技术领域
本申请要求基于于2018年7月31日提交的日本专利申请No.2018-144610、于2018年8月23日提交的日本专利申请No.2018-155979以及于2018年11月28日提交的日本专利申请No.2018-222063的优先权，所有这些的全部公开内容通过引用并入本文。本发明涉及用于在原组织(生組織)中检测生物膜的存在的方法以及用于该方法的试剂盒。
背景技术
慢性伤口，例如压力性溃疡(压力性损伤)和糖尿病足溃疡，具有发生感染的极高风险，因为它们经常暴露于外部细菌，并且宿主的免疫力减弱。近年来，变得清楚的是，细菌生物膜参与慢性伤口的病理生理学。已经强调了基于生物膜的伤口管理(biofilm-basedwound management)，其根据生物膜的存在来管理伤口。
生物膜是通过微生物的固定而形成的群落，并且其主要成分是糖蛋白、蛋白质、胞外DNA等。生物膜作为细菌的贮库存在，并通过形成群体来表现致病性。此外，生物膜可逃脱抗菌剂和宿主免疫力的作用，引起慢性炎症并成为非常强大的感染源(参见NPL 1)。因此，只要在伤口底部存在生物膜，就无法期望愈合。出于该原因，自21世纪前十年的后半期起，一直提倡，作为基于生物膜的伤口治疗(biofilm-based wound therapy)，应根据生物膜的存在来选择伤口处理。具体地，由欧洲、美国和泛太平洋压力性溃疡咨询委员会(EPUAP-NPUAP-PPPIA)在2014年共同发布的国际指南包括“Assessment and treatment ofinfection and biofilms”部分，其中说明了管理方法。该指南建议当例如伤口已经存在超过4周，在过去的2周没有愈合的迹象，存在炎症观察结果，或者存在抗微生物抗性时，怀疑存在生物膜。然而，由于明确诊断生物膜的存在需要组织活检和显微观察，因此在临床实践中实施很难(参见以上NPL 1)。
因此，最近提出了用于通过应用伤口印迹来检测作为生物膜成分的多糖组分而快速使伤口表面上的生物膜分布可视化的技术，所述伤口印迹是用于检测存在于伤口表面上的痕量组分的方法(例如PTL 1、PTL 2和NPL 2至NPL 4)。
PTL 1公开了用于通过使用包含用于检测存在于生物膜的胞外基质中的痕量组分(阴离子细菌外泌多糖，例如聚-β-(1-6)-N-乙酰基-D-葡糖胺和海藻酸)的配体的膜进行的伤口印迹来使伤口表面上生物膜的分布可视化的方法。然而，该方法需要约30分钟以进行检测，并且不适合于在临床实践中，特别是在床边使用。为了改善这一点，PTL 2公开了用于通过不使用生物膜特异性检测配体进行的伤口印迹来直接检测生物膜的方法。具体地，该方法包括使带正电荷的膜(例如，阳离子尼龙膜)与伤口表面接触，用阳离子染料(例如，钌红或阿尔新蓝)对从伤口表面去除的膜进行染色，以及用包含乙酸和1％至2％低醇的水溶液清洗经染色膜，从而可使来源于生物膜的带负电荷的痕量组分以附着于膜的状态被染色。尽管与PTL 1的方法相比，该方法可缩短检测时间，但是其尚不够充分。此外，由于使用了具有刺激性气味的乙酸作为膜清洗溶液的组分，因此该方法不适合在床边实施。
NPL 2至NPL 4公开了用于通过以下使生物膜可视化的方法：清洗伤口表面，然后使硝酸纤维素膜附着于伤口表面持续10秒，并随后将该膜浸渍于对来源于生物膜的多糖组分具有特异性的染色液(钌红或阿尔新蓝)中。根据这些方法，检测所需的时间为约2分钟，并且可容易地在短时间内且在床边非侵入性地检测生物膜。因此，可获得清洗伤口的指标，并且可对伤口进行更合适的局部管理。
引文列表
专利文献
PTL 1：US9145574B2
PTL 2：US9927438B2
非专利文献
NPL 1：
David J Leaper，et al.，Extending the TIME concept：what have we learnedin the past 10years？International Wound Journal 2012，；9(Suppl.2)：1-19
(第6至7页是特别相关的)
NPL 2：
仲上豪二朗ら、「バイオフィル厶の可視化による創傷ケアの変革」、日本フツトケア学会雑誌、2018：16(1)；第1-6页NPL 3：
仲上豪二朗ら、「バイオフイル厶を可視化する」、Visual Dermatology Vol.17，No.2，2018；第156-159页
NPL 4：
仲上豪二朗、「ベツドサイドで実施可能なバイオフイル厶検出技術を活用した新たな創傷ケア」、日本創傷治癒学会二ユ一ス2018.5；No.105
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供用于在原组织中检测生物膜的存在的方法，以及用于该方法的试剂盒。更优选地，本发明的目的是提供用于容易地在短时间内且在床边非侵入性地检测生物膜的方法，以及用于该方法的试剂盒。
技术方案
作为解决以上问题的广泛研究的结果，本发明人确定了，作为用于通过伤口印迹来在伤口中检测生物膜的存在的方法，将附着于伤口的膜浸渍于包含除阴离子型表面活性剂之外的表面活性剂的预处理液中，随后进行染色处理和洗涤处理(脱色处理)，从而可使膜上生物膜的存在在短时间内清晰地可视化。此外，本发明人发现，根据该方法，不仅在脱色处理之后立即而且在膜干燥之后，生物膜的可视化都是稳定的并且变得甚至更加清晰。因此，根据本发明的伤口印迹，伤口表面上生物膜的检测可在床边容易且迅速地进行并确定；另外，它可以有效地用作随后再确定和随后从伤口表面去除生物膜的指标。
基于这些一系列的发现，完成了本发明，并且本发明具有以下实施方案。
(I-1)
用于在受试组织中检测生物膜的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)预处理液，其包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂，
(b)染色液，其包含染料，以及
(c)脱色液，其包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂；
其中在使膜与所述受试组织接触并解除接触之后，使所述预处理液(a)、所述染色液(b)以及所述脱色液(c)按此顺序与所述膜的接触表面接触。
(I-2)
根据(I-1)所述的用于检测生物膜的试剂盒，其中所述预处理液(a)、所述染色液(b)以及所述脱色液(c)各自包含在单独的容器中，优选带有可打开和关闭的盖的容器中。
(I-3)
根据(I-1)或(I-2)所述的用于检测生物膜的试剂盒，其中所述预处理液(a)和/或所述脱色液(c)中使用的所述表面活性剂为：选自二烷基二甲基氯化铵和苯扎氯铵的阳离子型表面活性剂；选自烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱和烷基二甲基的两性表面活性剂；或者选自聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧化烯烷基醚(ポリオキシアルキレンアルキルエ一テル)、烷基聚葡糖苷、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇(ポリオキシエチレンポリオキシプ口ピレングリコ一ル)和聚甘油脂肪酸酯的非离子型表面活性剂。
(I-4)
根据(I-1)至(I-3)中任一项所述的用于检测生物膜的试剂盒，其中所述预处理液(a)和所述脱色液(c)是具有相同组成的水溶液。
(I-5)
根据(I-1)至(I-4)中任一项所述的用于检测生物膜的试剂盒，其还包含能够吸附存在于所述受试组织中的生物膜和/或其组分的膜。
(I-6)
根据(I-1)至(I-5)中任一项所述的用于检测生物膜的试剂盒，其还包含说明手册。
(I-7)
根据(I-1)至(I-6)中任一项所述的用于检测生物膜的试剂盒，其还包含选自以下的至少一种辅助装置：浸渍容器、排液构件、废液容器、带有排液器的容器、镊子、无菌蒸馏水和干燥器。
(II-1)
用于在受试组织中检测生物膜的方法，其包括以下步骤1至4：
(1)步骤1：使能够吸附生物膜和/或其组分的膜与受试组织接触；
(2)步骤2：使所述膜解除与所述受试组织的接触，并随后用包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂的(a)预处理液对所述膜中至少与所述受试组织接触的表面进行处理；
(3)步骤3：用包含染料的(b)染色液对用所述预处理液(a)处理的所述膜中至少与所述受试组织接触的表面进行处理；以及
(4)步骤4：用包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂的(c)脱色液对用所述染色液(b)处理的所述膜中至少与所述受试组织接触的表面进行处理。
(II-2)
根据(II-1)所述的生物膜检测方法，其中所述预处理液(a)和/或所述脱色液(c)中使用的所述表面活性剂为：选自二烷基二甲基氯化铵和苯扎氯铵的阳离子型表面活性剂；选自烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱和烷基二甲基氧化胺的两性表面活性剂；或者选自聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧化烯烷基醚、烷基聚葡糖苷、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇和聚甘油脂肪酸酯的非离子型表面活性剂。
(II-3)
根据(II-1)或(II-2)所述的生物膜检测方法，其中所述预处理液(a)和所述脱色液(c)是具有相同组成的水溶液。
(II-4)
根据(II-1)至(II-3)中任一项所述的生物膜检测方法，其中(1)的预处理步骤进行2至60秒，优选2至30秒；(2)的染色处理步骤进行5至60秒，优选10至30秒；并且(3)的脱色步骤进行10至120秒，优选10至60秒。
(II-5)
根据(II-1)至(II-4)中任一项所述的生物膜检测方法，其中所述受试组织是具有临床感染体征的伤口、难治性伤口或慢性伤口(压力性溃疡、糖尿病足溃疡、或腿溃疡)中的原组织。
(II-6)
根据(II-1)至(II-5)中任一项所述的生物膜检测方法，其还包括步骤5：确定所述受试组织中是否存在生物膜。
(II-7)
根据(II-6)所述的生物膜检测方法，其中步骤5是以下步骤：当用所述脱色液处理的所述膜中与所述受试组织接触的表面具有与所述膜的背景色形成对比的染料来源的着色(对比图像)时，确定所述受试组织中存在生物膜。
(II-8)
根据(II-1)至(II-7)中任一项所述的生物膜检测方法，其中步骤2至4以以下方式(i)至(iii)中的任一种进行：
(i)步骤2至4通过在包含步骤1中获得的所述膜的浸渍容器中依次地更换所述预处理液、所述染色液以及所述脱色液来进行；
(ii)步骤2至4通过依次地将步骤1中获得的所述膜放入和取出分别包含所述预处理液、所述染色液以及所述脱色液的浸渍容器中而进行；以及
(iii)步骤2至4通过将步骤1中获得的所述膜置于带有排液器的容器的排液器表面上，并且依次地喷洒或滴加所述预处理液、所述染色液以及所述脱色液以便使其散布在所述膜的整个表面上而进行。
有益效果
根据本发明生物膜检测试剂盒或本发明生物膜检测方法，可非侵入性地、视觉上快速地且清晰地检出受试组织，特别是原组织中生物膜的存在。因此，根据本发明，可在短时间内、在医学检查时或在床边容易地进行生物膜的可视化和检测。作为结果，伤口管理在临床实践中是可能的，例如当场迅速去除生物膜并确定处理策略。特别地，本发明的生物膜检测试剂盒的一个优选实施方案包括具有包含阿尔新蓝作为染料组分的染色液的生物膜检测试剂盒。由于该染色液以水溶液的形式在于室温下长期储存中是优异的，因此其可以以在使用时不需要制备的预先制备的溶液的状态在市场上分售。
附图说明
图1是示出了本发明的生物膜检测系统中(1)步骤2(预处理步骤)、(2)步骤3(染色步骤)和(3)步骤4(脱色步骤)的一个实施方案的示意图。
图2是示出了本发明的生物膜检测系统中步骤2(预处理步骤)、步骤3(染色步骤)和步骤4(脱色步骤)的另一个实施方案的示意图。
图3是示出了本发明的生物膜检测系统中(1)步骤2(预处理步骤)、(2)步骤3(染色步骤)和(3)步骤4(脱色步骤)的另一个实施方案的示意图。
图4(1)和(2)二者均示出了图3中所示的生物膜检测系统中使用的排液构件(标记8)和废液容器(标记9)的一些实施方案。
图5示出了在验证实验1的结果中，使用各自包含非离子型表面活性剂((1)聚山梨酯80、(2)聚氧乙烯月桂基醚或(3)聚氧化烯烷基醚)、两性表面活性剂((7)月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱或(8)月桂基二甲基氧化胺))或者阴离子型表面活性剂((11)聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠)的水溶液作为预处理液和脱色液来实施生物膜检测系统的结果。图像示出了在脱色之后立即和在干燥之后膜的着色状态。每个图像中示出的斑点对应于这样的位置：在所述位置处滴加了2μL生物膜悬浮液(左侧)以及滴加了10μL生物膜悬浮液(右侧)。
图6示出了显示出在实验例2中在生物膜检测系统中，在脱色处理之后(在脱色之后立即和在干燥之后)印迹膜的着色状态的图像，其中使用模型伤口表面(猪皮)进行了印迹。
具体实施方式
生物膜是由包裹在胞外基质中的细菌构成的复杂微生物群落。生物膜胞外基质包含聚阴离子胞外多糖(例如，酸性黏多糖，例如聚-β-(1-6)-N-乙酰基-D-葡糖胺和海藻酸)、蛋白质、胞外DNA、脂质和金属离子(例如，Ca、Mg和Fe)。本文中使用的术语“生物膜组分”包括生物膜及其片段，以及特别地，在构成生物膜胞外基质的组分中，生物膜胞外基质特有的聚阴离子胞外多糖。即，除非另外说明，否则术语“生物膜组分”用作包括以下的通用术语：生物膜及其片段，以及特别地，在构成生物膜胞外基质的组分中，生物膜特有的聚阴离子胞外多糖。
印迹是用于通过吸附而将生物分子固定至膜的技术。用于该目的的膜称为印迹膜。伤口表面意指伤口的表面，并且有时不仅包括伤口，而且还包括周围的皮肤表面。伤口印迹是用于通过上文提及的印迹来使皮肤(包括伤口表面)的不可见生理状态非侵入性地可视化的技术。
作为本发明目标的生物膜检测是上文提及的伤口印迹的应用。基本上，该技术包括：(A)将印迹膜附着于已预先清洗并任选地进行预处理(例如，擦去水)的伤口及其周围皮肤(伤口表面)并将生物膜组分收集在膜表面上的步骤(生物膜组分收集步骤)，以及(B)对从伤口表面去除的印迹膜进行染色的步骤(染色步骤)；并且基于经染色的印迹膜的着色结果检测伤口表面上生物膜的存在。
本发明的生物膜检测试剂盒(在下文中也简称为“试剂盒”)是用于在受试组织中检测生物膜的试剂盒。该试剂盒可优选地用作在应用伤口印迹的生物膜检测系统中用于生物膜检测的试剂。
尽管生物膜检测系统不受限制，但是一个实例是具有以下步骤1至5的生物膜检测系统。生物膜检测系统的细节将在之后描述；但是，试剂盒中包含的预处理液、染色液以及脱色液可分别在以下步骤中的步骤2、3和4中使用。所有这些步骤均用于对步骤1中附着于伤口表面以吸附生物膜组分的印迹膜进行处理。
步骤1：生物膜组分收集步骤
步骤2：预处理步骤(针对印迹膜)
步骤3：染色步骤(针对印迹膜)
步骤4：脱色步骤(针对印迹膜)
步骤5：生物膜检测和确定步骤
所述试剂盒的特征在于包含至少以下所述的(a)预处理液、(b)染色液以及(c)脱色液，其各自包含在单独的容器中：
(a)预处理液，其包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂，
(b)染色液，其包含染料，以及
(c)脱色液，其包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂。
下文将针对生物膜检测系统的步骤2至4来描述试剂盒中包含的试剂。
预处理液是用于处理在步骤1中获得的印迹膜的试剂。当伤口表面上存在生物膜时，生物膜和/或其组分(生物膜组分)被吸附在步骤1中获得的印迹膜中与伤口表面接触的表面上。预处理液用于在步骤3(染色步骤)之前的步骤2(预处理步骤)中对印迹膜进行处理。当用预处理液进行的处理在染色处理之前进行时，可防止印迹膜上未吸附生物膜组分的部分被染色，并且可防止染料被固定(着色)；因此，可防止与由于生物膜组分而引起的着色部分的对比降低，即，检测灵敏度和准确性降低。换言之，用预处理液进行的处理相当于用染料抑制膜的非特异性着色的封闭处理。
将所述预处理液制备为包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂的水溶液。对非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂没有特别限制，只要可实现本发明的效果即可。非离子型表面活性剂是优选的。
非离子型表面活性剂的一些实例包括：醚表面活性剂，例如通过将环氧乙烷(EO)加成聚合至C
两性表面活性剂的一些实例包括烷基甜菜碱表面活性剂，例如烷基二甲基氨基乙酸甜菜碱(例如，月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱)；以及氧化胺表面活性剂，例如烷基二甲基氧化胺(例如，月桂基二甲基氧化胺)。
阳离子型表面活性剂的一些实例包括二烷基二甲基氯化铵(例如，二癸基二甲基氯化铵)和具有C
这些表面活性剂可单独或以两种或更多种的任意组合来使用。非离子型表面活性剂是优选的，因为它们在相对宽的浓度范围内表现出稳定的作用。在这些中优选的是POE月桂基醚、聚氧化烯烷基醚和以聚山梨酯80为代表的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
预处理液优选以其中这样的表面活性剂溶解于水中的水溶液的形式使用。本文中使用的水没有特别限制，并且一些实例包括自来水、蒸馏水、离子交换水、纯化水、无菌水等。预处理液中表面活性剂的浓度可适当地选自0.001至20质量％的范围，如之后描述的验证实验1中所示。下限值为例如优选0.005质量％或更多，并且更优选0.01质量％或更多。此外，上限值优选为10质量％或更低。如验证实验1中所示，预处理液的pH在有效性方面不引起显著差异，并且取决于所使用的表面活性剂的类型，预处理液可具有3至12的不同pH水平。pH为例如但不限于优选3至8，并且更优选4至7。预处理液可包含防腐剂、杀菌剂、pH调节剂、稳定剂等，只要不损害本发明的效果即可。
染色液用于对在步骤2中处理的印迹膜进行染色。当伤口表面上存在生物膜时，生物膜组分被吸附在步骤1中获得的印迹膜的表面上。通过用染色液进行染色处理，生物膜组分可在被吸附在印迹膜上的同时被染色。
染料的一些实例包括阳离子染料，其与存在于生物膜胞外基质中的阴离子胞外多糖，特别是酸性黏多糖选择性结合，并且具有饱和度、色度和色相，使得可用肉眼直接观察到被染色的生物膜胞外多糖。已用于使生物膜染色的染料的一些实例包括结晶紫和刚果红(参见，例如，Karsten Pedersen，Applied and Environmental Microbiology，Jan.1982，pp.6-13；Bradford Craigen et aL.，The Open Microbiology Journal，2011，521-31；以及Masaaki Morikawa，“Let’s examine biofilm，”Biotechnology，Vol.90，No.5，pp.246-250，2012)，以及钌红和阿尔新蓝(参见，例如NPL 2至NPL 4)。就制备为水溶液之后的稳定性而言，优选的是钌红和阿尔新蓝，并且更优选的是阿尔新蓝。阿尔新蓝是属于酞菁染料的碱性染料，并且具有带正电荷的异硫脲
染色液优选以其中上文提及的染料溶解于水中的水溶液的形式使用。本文中使用的水没有特别限制，并且一些实例包括自来水、蒸馏水、离子交换水、纯化水、无菌水等。染色液的染料浓度可适当地选自0.05至1.2质量％的范围，如之后描述的验证实验2中所示。下限值为例如优选0.1质量％或更多。此外，上限值为例如优选1质量％或更低，并且更优选0.6质量％或更低。不需要用酸(例如乙酸或盐酸)来调节染色液的pH。染料可例如溶解于pH为1至5的水中。pH为例如但不限于优选2至5，并且更优选2至4.5。染色液可包含防腐剂、杀菌剂、pH调节剂、稳定剂等，只要不损害本发明的效果即可。
脱色液用于使在步骤3中染色的印迹膜脱色。通过用脱色液进行处理，可使非特异性附着于印迹膜的染料脱附。在另一方面，附着于吸附在印迹膜上的生物膜组分的染料特异性地吸附于生物膜组分。因此，即使通过用脱色液进行处理，该染料也不会脱附；或者，即使脱附，脱附也是轻微的，并且可保持染色状态(着色)。即，通过用脱色液进行脱色处理，去除了附着于印迹膜的生物膜组分非吸附部分的染料，并且该膜区域发生褪色。相比之下，吸附在印迹膜表面上的生物膜组分与染料特异地键合(离子键合)，以保持染色状态(着色)；因此，与膜的背景色相比形成了对比，并且通过对比图像可使吸附在印迹膜上的生物膜组分清晰地可视化。
脱色液包含选自非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂的至少一种表面活性剂。对非离子型表面活性剂、两性表面活性剂和阳离子型表面活性剂没有特别限制，只要可实现本发明的效果即可；但是，一些具体实例包括与上述用于预处理液的表面活性剂相同的表面活性剂。因此，关于预处理液的描述可在此并入。
非离子型表面活性剂是优选的，因为它们在相对宽的浓度范围内表现出稳定的作用。在这些中优选的是POE月桂基醚、聚氧化烯烷基醚和以聚山梨酯80为代表的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯。根据这些非离子型表面活性剂，如之后描述的验证实验1中所示，在脱色处理之后，随着印迹膜干燥，膜的生物膜组分非吸附区域进一步发生褪色，并且与由于生物膜组分而引起的着色部分的对比变得更清晰，从而产生检测灵敏度和准确性提高的效果。
脱色液优选以其中这样的表面活性剂溶解于水中的水溶液的形式使用。本文中使用的水没有特别限制，并且一些实例包括自来水、蒸馏水、离子交换水、纯化水、无菌水等。脱色液中表面活性剂的浓度可适当地选自0.001至20质量％的范围，如之后描述的验证实验1中所示。下限值为例如优选0.005质量％或更多，并且更优选0.01质量％或更多。上限值优选为10质量％或更低。此外，如验证实验1中所示，脱色液的pH在有效性方面不引起显著差异，并且取决于所使用的表面活性剂的类型，脱色液可具有3至12的不同pH水平。pH为例如但不限于优选3至8，并且更优选4至7。脱色液可包含防腐剂、杀菌剂、pH调节剂、稳定剂等，只要不损害本发明的效果即可。
作为脱色液，可优选使用与上述预处理液具有相同组成的试剂。即，在这种情况下，可以说预处理液也用作脱色液，而脱色液也用作预处理液。
这些预处理液、染色液以及脱色液以包含在单独容器中的状态构成试剂盒的一部分或全部。这些容器的材料和形状没有特别限制，只要预处理液、染色液以及脱色液可以以它们被包含在其中而不会变质(包括变色)或吸附于内表面(如果有的话)的状态稳定地储存即可。材料的一些实例包括但不限于玻璃、金属(例如，铝、不锈钢和钢)以及塑料(例如，聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、氯乙烯、聚苯乙烯、ABS树脂、丙烯酸、聚酰胺、聚碳酸酯和四氟乙烯)。此外，容器的形状可自由选择，而没有特别限制；例如，容器的形状可以是瓶形状、袋形状或管形状。容器的尺寸还取决于一次使用的预处理液、染色液以及脱色液的量，以及取决于试剂盒是用于一次性使用(一次性)还是多次使用。例如，当试剂盒用于一次性使用(一次性)时，包含预处理液、染色液以及脱色液的容器的体积没有特别限制，只要可包含一次使用的每种试剂的量即可。例如，容器的体积可适当地选自2至20mL的范围。当试剂盒用于多次使用时，可根据使用次数适当地选择包含预处理液、染色液以及脱色液的容器的尺寸。尽管没有限制，但是容器的体积可例如适当地选自100至500mL的范围。在多次使用的情况下，特别优选的是这些容器具有可打开和关闭的盖。此外，在多次使用的情况下，容器可具有称量标尺，或者可配备有计量极或计量分配器。当预处理液和脱色液具有相同组成时，试剂盒可在同一容器中包含预处理液和脱色液。即，在这种情况下，试剂盒被配置为具有包含在一个容器中的至少“预处理液”和“脱色液”以及包含在另一个容器中的“染色液”。
试剂盒可具有至少三种类型的试剂，即，预处理液、染色液以及脱色液作为基本组，但是除这些试剂之外，还可包含印迹膜。
印迹膜
印迹膜用于从伤口表面收集生物膜组分，并随后用上述试剂中的每一种对其进行处理。印迹膜可以是由在其表面的一侧上吸附生物膜和/或其组分(生物膜组分)的材料制成的片(膜)。一些实例包括由多种纤维材料制成的多孔片(包括例如非织造织物)。印迹膜以这样的方式使用：将其附着于皮肤表面(伤口表面)(包含在其中的生物膜待检测的目标伤口区域)，以原样干燥状态或者在必要时用无菌水的润湿状态，将其保持数秒至数十秒，优选约10秒，并随后将其剥离。以这种方式，如果在伤口表面上存在生物膜，则生物膜组分可被吸附并收集在印迹膜的接触表面上。因此，优选地，印迹膜的纤维材料和纤维结构可通过上述印迹吸附生物膜组分。更优选地，该膜具有能够稳定地吸附和保持生物膜组分(即使在随后的预处理步骤、染色步骤和脱色步骤中也是如此)的纤维材料和纤维结构。甚至更优选地，该膜具有这样的纤维材料和纤维结构：在其中，在预处理步骤之后在染色步骤中非特异性地附着于膜的染色液(染料)可通过在随后的脱色步骤中的脱色液而容易地脱附(脱落)。
这样的纤维材料的一些实例包括但不限于，如之后描述的验证实验3中所示，基于纤维素的纤维，例如硝酸纤维素、纤维素混合酯和乙酸纤维素；尼龙(包括不带电荷尼龙和带正电荷尼龙)；以及基于亲水性氟树脂的纤维，例如亲水性聚偏二氟乙烯(亲水性PVDF)和亲水性聚四氟乙烯(亲水性PTFE)。验证实验3的结果揭示了，尽管可使用带电荷或不带电荷的印迹膜，但是可优选使用极性材料或高度亲水性纤维材料。
印迹膜的孔径没有限制，但为例如0.1至0.5μm，并且优选0.2至0.45μm。印迹膜的厚度也没有特别限制，但从操作的视角考虑，可适当地选自0.05至1mm的范围，并且优选0.05至0.3mm。
在试剂盒中，印迹膜的形状没有特别限制。例如，印迹膜可具有卷状形状，使得其可在使用时被切割成期望的形状和尺寸，或者其可具有预切割的形状(例如，矩形)。鉴于使用的便利性，印迹膜优选是预切割的。切割尺寸没有特别限制。例如，在矩形的情况下，尺寸可适当地选自3至30cm的长度范围，以及3至30cm的宽度范围。可将印迹膜以无菌状态逐个或一起包装在袋中。或者，可将印迹膜以预先用无菌水等浸润的状态包装在气密袋中。
试剂盒还可包含描述了用于评价测试结果(评价生物膜检测)的方法或后续的(推荐的)处理方法的说明手册或文档。此外，试剂盒还可任选地具有用于使用试剂盒的辅助装置，例如浸渍容器、排液构件、废液碟(废液容器)、带有排液器的容器、镊子、无菌蒸馏水或干燥装置，例如干燥器。带有排液器的容器可以是具有整合的排液构件和废液容器的容器，或者是具有可拆卸地配对的排液构件和废液容器的容器。例如，带有排液器的容器可具有盖，使得其可留在排液器表面上或携带置于排液器表面上的经处理膜。下文将描述排液构件、带有排液器的容器、用于操作试剂盒的方法、用于评价印迹膜上可视化的测试结果的方法以及基于该结果的后续处理。
试剂盒可适合地用于在特别要关注生物膜的存在的伤口(作为受试组织)中检测生物膜，所述伤口例如具有临床感染体征(炎症、提高的渗出物、延迟愈合、脓肿形成、伤口表面变色、肉芽形成组织形成、伤口破裂、伤口底部袋形成、臭味等)的伤口和难治性伤口，包括慢性伤口，例如压力性溃疡、腿溃疡和糖尿病足溃疡。试剂盒还可适合地用于在急性伤口(割伤、擦伤、烧伤等)中检测生物膜。由于试剂盒易于操作和快速的结果确定，其可在医学检查时或在床边更换绷带或绊创膏时使用。基于结果，可当场进行处理或者可制定处理计划。
本发明的生物膜检测方法基本上包括上述步骤1(生物膜组分收集步骤)、步骤2(印迹膜预处理步骤)、步骤3(染色步骤)和步骤4(脱色步骤)。如果必要的话，本发明的生物膜检测方法可在这些步骤之后包括步骤5(生物膜检测和确定步骤)。
步骤1具有使能够吸附生物膜组分的膜与受试组织接触的操作。该步骤中使用的膜的一些实例包括以上第2节中描述的印迹膜。优选的是，在使膜与受试组织接触之前，先用无菌水等将膜润湿。通过这样做，由于与膜接触而引起的受影响区域的疼痛减轻，并且生物膜组分易于附着且吸附在膜上。
如上所述，目标受试组织是关注生物膜存在的可能性的伤口。一些优选的实例包括具有临床感染体征(炎症、提高的渗出物、延迟愈合、脓肿形成、伤口表面变色、肉芽形成组织形成、伤口破裂、伤口底部袋形成、臭味等)的伤口和难治性伤口。例如，慢性伤口，例如压力性溃疡、腿溃疡和糖尿病足溃疡，具有发生感染的极高风险，并因此可适合作为受试组织。也可使用关注生物膜存在的可能性的急性伤口(割伤、擦伤、烧伤等)。受试组织优选在与膜接触之前预先例如通过用蒸馏水或生理盐水洗涤来预处理。
膜与受试组织的接触没有限制，但是可通过将膜附着于受试组织的表面(伤口表面)来实现。附着时间没有限制，但是为数秒至数十秒，例如5秒或更多，优选10秒或更多，并且特别优选约10秒。如果必要的话，可在附着时间期间轻压附着于伤口表面的膜表面，以便使可存在于受试组织中的生物膜组分容易附着或吸附在膜上。在接触之后，可通过从受试组织去除膜来将生物膜组分收集在膜上。换言之，可通过步骤1中的操作来制备具有从受试组织收集的生物膜组分吸附在其上的表面的膜。
步骤2具有用预处理液对在步骤1中获得的具有生物膜组分吸附在其上的表面的膜进行预处理的操作。该步骤可防止染料非特异性地附着并固定至膜(着色)。该步骤中使用的预处理液的一些实例包括以上第2节中描述的预处理液。
用预处理液对膜进行的处理可以是其中使预处理液与整个膜接触以便使膜被预处理液浸湿并润湿的处理(湿处理)。具体的处理操作不特别限于此程度。例如，如图1(1)中所示，将在步骤1中从受试组织去除的膜(标记4)置于容器(例如，托盘)(标记5)中，并在该状态下，将预处理液(标记1)置于容器(标记5)中，以便使整个膜被预处理液浸渍并润湿(浸渍法)；如图2中所示，将膜(标记4)预先置于包含预处理液(标记1)的容器(例如托盘)(标记5)中，并将其用预处理液浸渍并润湿(浸渍法)；或者将预处理液喷洒或滴加到在步骤1中从受试组织去除的膜上，以使均匀散布以润湿(喷洒或滴加法)。当使用喷洒或滴加法时，如图3(1)中所示，该方法可在将膜(标记4)置于带有开口的构件，例如网(在本发明中，这被称为“排液构件”)(标记8)上的同时进行。排液构件的材料、形状、尺寸等没有特别限制，并且可使用任何构件，只要其可使膜展开在其顶部上并且具有允许多于用于润湿膜的量的过量预处理液通过的开口(液体通过孔)即可。还可没有区别地使用例如，图3(1)中所示的平板样构件(片样或板样构件)，带有手柄的滤器(半圆形或中空状的排液容器)，例如除渣器或滤茶器，以及一些物什如筛粉器。在这种情况下，如图4(1)和(2)中所示，将用于包含通过的预处理液的碟或容器(在下文中称为“废液容器”)(标记9)置于排液构件(标记8)的下方，从而预处理液可作为废液收集在其中。还可使用带有排液器的容器，其中排液构件和废液容器可拆卸地配对。排液构件的开口(液体通过孔)的形状和尺寸没有特别限制，只要可实现上述目的即可。湿处理时间没有限制，但是例如，在室温条件(25±5℃)下为2至60秒。湿处理时间优选为2至30秒，并且更优选2至15秒。在用预处理液进行湿处理之后，将预处理液从容器中去除(参见图1(1))，将经处理膜从包含预处理液的容器中去除(参见图2)，或者在使膜置于排液构件上的同时，使过量的预处理液通过其自重(如果必要的话，通过将排液构件倾斜)从排液构件的开口滴加(参见图3(1))并作为废液收集在废液容器(标记9)中(参见图4)。以这种方式，步骤2可以完成。
在步骤2中，用于一次湿处理的预处理液的量没有特别限制，只要可实现湿处理即可。尽管其取决于目标受试组织的尺寸和所用膜的尺寸，但是，例如，当膜为5cm×5cm的矩形片时，预处理液的量为例如2至10mL/处理。尽管湿处理的次数没有限制，但是一次处理通常是足够的。
步骤3具有对在步骤2中获得的膜(经预处理膜)进行染色的操作。该步骤可使吸附在膜上的生物膜组分以吸附在膜上的状态染色。该步骤中使用的染色液的一些实例包括以上第2节中描述的染色液。
用染色液对膜进行的处理可以是其中使染色液与用预处理液预处理(湿处理)的膜的至少生物膜组分吸附部分接触，以便使膜被染色液浸湿并润湿的处理(湿处理)。具体的处理操作不特别限于此程度。例如，如图1(2)中所示，将染色液(标记2)置于在步骤2中已从其中去除预处理液的含膜容器(标记5)中，以便使整个膜(标记4)浸渍并浸润在染色液中(浸渍法)；如图2中所示，将从包含预处理液(标记1)的容器(标记5)中取出的膜置于包含染色液(标记2)的容器(标记5)中，以便使膜浸渍并浸润在染色液中(浸渍法)；或者通过喷洒或滴加染色液来润湿在步骤2中预处理的膜(喷洒或滴加法)。当使用喷洒或滴加法时，如图3(2)中所示，也可以以与预处理步骤中相同的方式(或自预处理步骤起连续)，在膜(标记4)被置于排液构件(标记8)上的同时进行该方法。同样，在这种情况下，如在预处理步骤中的(或自预处理步骤起连续)，如图4(1)和(2)中所示，将废液容器(标记9)置于排液构件(标记8)的下方，从而可以以与预处理液相同的方式将染色液作为废液收集。由于本发明中使用的染色液即使当与上述预处理液混合时也不产生热或反应，因此染色液可作为废液储存在步骤2中使用的废液容器中，同时预处理液也储存在其中。用染色液进行的湿处理时间(染色时间)没有限制，但是例如，在室温条件(25±5℃)下为5至60秒。湿处理时间优选为10至60秒，并且更优选10至30秒。在用染色液进行湿处理(染色处理)之后，将染色液从容器中去除(参见图1(2))，将经处理膜从包含染色液的容器中去除(参见图2)，或者在使膜保持原样的同时，使过量的染色液通过其自重(如果必要的话，通过将排液构件倾斜)从排液构件的开口滴加(图3(2))并作为废液收集在废液容器中(参见图4)。以这种方式，步骤3可以完成。
在步骤3中，用于一次湿处理(染色处理)的染色液的量没有特别限制，只要可实现湿处理(染色处理)即可。尽管其取决于目标受试组织的尺寸和所用膜的尺寸，但是，例如，当膜为5cm×5cm的矩形片时，染色液的量为例如2至10mL/处理。尽管湿处理(染色处理)的次数没有限制，但是一次处理通常是足够的。
步骤4具有使在步骤3中获得的膜(经染色膜)脱色的操作。该步骤可使非特异性附着于膜的染料脱附，同时保持吸附在膜上的生物膜组分的着色。由于由此降低了背景膜本身的着色(褪色)，因此吸附在膜上的生物膜组分的存在可作为对比图像突出显示，这实现了视觉的且容易的确定(生物膜的可视化)。该步骤中使用的脱色液的一些实例包括以上第2节中描述的脱色液。优选地，可使用与步骤2中使用的预处理液具有相同组成的试剂。
用脱色液对膜进行的处理可以是其中使脱色液与已用染色液进行湿处理(染色处理)的膜区域接触，以便使膜被脱色液浸湿并润湿的处理(湿处理)。具体的处理操作不特别限于此程度。例如，如图1(3)中所示，如果必要的话，对在步骤3中已从其中去除染色液的含膜容器(标记5)进行洗涤，并将脱色液(标记3)置于其中，以便使整个膜被脱色液浸渍并润湿(浸渍法)；如图2中所示，将从包含染色液(标记2)的容器(标记5)中取出的膜置于包含脱色液(标记3)的容器(标记5)中，以便使膜被脱色液浸渍并润湿(浸渍法)；或者通过喷洒或滴加脱色液来润湿在步骤3中染色的膜(喷洒或滴加法)。当使用喷洒或滴加法时，如图3(3)中所示，可以如在预处理步骤和染色步骤中的(或自预处理步骤和染色步骤起连续)，在膜(标记4)被置于排液构件(标记8)上的同时进行该方法。同样，在这种情况下，如在预处理步骤和染色步骤中的(或自预处理步骤和染色步骤起连续)，如图4(1)和(2)中所示，将废液容器(标记9)置于排液构件(标记8)的下方，从而可以以与预处理液和染色液相同的方式将脱色液作为废液收集在其中。由于本发明中使用的脱色液即使当与上述预处理液和染色液混合时也不产生热或反应，因此脱色液可作为废液储存在步骤2和3中使用的、其中储存了预处理液和染色液的废液容器中。用脱色液进行的湿处理时间(脱色时间)没有限制，但是例如，在室温条件(25±5℃)下为10至120秒。湿处理时间优选为10至60秒，并且更优选10至30秒。在用脱色液进行湿处理(脱色处理)之后，将脱色液从容器中去除(参见图1(3))，将经处理膜从包含脱色液的容器中去除(参见图2)，或者在使膜保持原样的同时，使过量的脱色液通过其自重(如果必要的话，通过将排液构件倾斜)从排液构件的开口滴加(图3(3))并作为废液收集在废液容器中(参见图4)。以这种方式，步骤4可以完成。
在步骤4中，用于一次湿处理(脱色处理)的脱色液的量没有特别限制，只要可实现湿处理(脱色处理)即可。尽管其取决于目标受试组织的尺寸和所用膜的尺寸，但是，例如，当膜为5cm×5cm的矩形片时，脱色液的量为例如2至10mL/处理。尽管湿处理(脱色处理)的次数没有限制，但是一次处理通常是足够的。
步骤1至4的一系列操作可连续地进行，但是也可不连续地进行，只要可获得本发明的效果即可。当连续进行步骤1至4的一系列操作时，所需的总时间是各个步骤所需的时间的和，并且优选地例如在2分钟内。在不连续地进行步骤1至4的情况下，例如，可将步骤1中制备的膜储存直至对其进行步骤2，或者也可将步骤2中预处理的膜储存直对其进行步骤3(染色步骤)。
吸附在膜上的生物膜组分的存在可通过视觉上观察在步骤4中获得的经脱色膜的着色状态来确定。具体地，如果在步骤4中获得的膜的与受试组织的接触表面与由于用步骤3中使用的染料进行着色而引起的膜的背景色(浅色)形成对比，则假定生物膜组分吸附在膜上，这可确定目标受试组织上存在生物膜。在另一方面，如果在步骤4中获得的膜上没有形成对比，则假定生物膜组分未吸附在膜上，这可确定在目标受试组织上不存在生物膜。通过这样的可视化进行的确定可在脱色处理之后立即进行，但不限于此；即使在膜已经干燥之后也可以进行该确定。特别地，当使用包含选自POE月桂基醚、聚氧化烯烷基醚和以聚山梨酯80为代表的聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯的至少一种非离子型表面活性剂的水溶液作为预处理液和脱色液进行预处理和脱色处理时，通过在脱色处理之后使膜干燥，膜的背景色的褪色变得更加显著。作为结果，对比变得更清晰，并且生物膜组分可突出显示且可视化。因此，可提供在脱色步骤之后并且在检测和确定步骤之前使膜干燥的步骤。
膜中的这样的着色，确切地说，使用与膜的背景色的对比(对比图像)作为指标来检测生物膜组分，以及基于生物膜组分的检测来决定(确定)受试组织中生物膜的存在，可通过使用通过步骤1至4的处理获得的膜或者(如果必要的话)随后的干燥处理来容易地进行。因此，根据本发明的生物膜检测方法，特别是使用本发明的试剂盒的生物膜检测方法，不仅仅是医师，任何人都可容易地确定受试组织中生物膜的存在。使用本发明的试剂盒或检测方法(本发明的生物膜检测系统)来在受试组织中检测和确定生物膜可用于原组织中生物膜的存在的明确诊断，以及用于常规组织活检和/或显微镜观察的辅助或预诊断。
如果通过本发明的方法确定了受试组织中存在生物膜，则优选从受试组织中去除生物膜，并且如果必要的话，采取进一步措施以防止生物膜的再形成。这样的措施可在本发明的生物膜检测方法之后连续地进行，或者可在作为处理方法之一的提议和检查之后进行。尽管用于去除生物膜的方法没有限制，但是常规方法的一些实例包括物理破坏(侵袭性/强烈的清创术)和物理清洗(清洗或声处理)。此外，用于防止生物膜再形成的方法的一些实例包括通过用敷料材料(例如，银敷料材料、碘敷料材料、PHMB敷料材料和医学蜂蜜敷料材料)、表面广谱抗生素或表面活性剂来杀伤微生物而防止进一步伤口感染的方法(参见NPL 1等)。
在本说明书中，术语“包含”或“包括”包括“由……组成”和“基本上由……组成”的含义。
实施例
基于实验例，下文描述了本发明的结构和效果。然而，实验例仅是用于说明本发明的实施例，并且本发明不受这些实验例的限制。在下文中，除非另外说明，否则“％”意指“质量％”，以及“份”意指“按质量计的份”。此外，除非另外说明，否则实验均在大气压条件下、在调节至恒定温度(25±2℃)和湿度(35±15％)的室内进行。
通过应用伤口印迹设计了包括以下步骤1至5的生物膜检测系统，并且验证了步骤2中使用的预处理液、步骤3中使用的染色液、步骤4中使用的脱色液和步骤1至5中使用的印迹膜。
步骤1：生物膜组分收集步骤
步骤2：预处理步骤(针对印迹膜)
步骤3：染色步骤(针对印迹膜)
步骤4：脱色步骤(针对印迹膜)
步骤5：生物膜检测和确定步骤
步骤1是将印迹膜附着于伤口表面以使存在于伤口表面上的生物膜组分吸附在膜上的步骤。通过该步骤，如果伤口表面上存在生物膜，则生物膜组分可被收集在印迹膜上。
在以下验证实验1至3中，代替将印迹膜附着于伤口表面以吸附生物膜组分的步骤，将以以下方式制备的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物膜悬浮液(10
用于制备铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生物膜悬浮液的方法
使用铜绿假单胞菌PAO1菌株、ATCC 15442和ATCC 27853作为铜绿假单胞菌，以及金黄色葡萄球菌ATCC 29213作为金黄色葡萄球菌进行评价。将铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌分别在胰蛋白酶大豆肉汤琼脂培养基上于37℃下培养48小时。用无菌水收集通过培养产生的菌落(包括胞外物质)，并将其分别调节至10
步骤2是用预处理液处理在其上吸附有生物膜组分的印迹膜的步骤。该步骤可防止在其上未吸附生物膜组分的膜部分的着色。
在以下验证实验1至3中，首先将在步骤1中处理的印迹膜置于用于浸渍处理的容器(7cm×7cm，1cm高的板样容器)中。在下文中，步骤2以及随后的步骤3和4都在该容器中进行。概要如图1(1)中所示。具体地，向包含印迹膜(标记4)的容器(标记5)添加2至10mL的预处理液(标记1)，使印迹膜浸渍于预处理液中，持续30秒，并随后将预处理液从容器中去除(参见图1(1))。在之后描述的实验例4(1)中，使用图2中所示的方法进行步骤2，并且在实验例4(2)中，使用图3(1)中所示的方法进行步骤2。在实验例4(1)中，具体地，将印迹膜(标记4)置于包含2至10mL预处理液(标记1)的容器(标记5)中以进行浸渍和润湿，并随后将膜从容器中去除(参见图2)。在实验例4(2)中，具体地，将印迹膜(标记4)置于排液构件(标记8)上，将2至10mL的预处理液(标记1)均匀地喷洒或滴加在其上以散布遍及整个膜(浸润)，并随后使过量的预处理液通过排液构件(标记8)(参见图3(1))并作为废液收集在置于排液构件下方的废液容器中。
步骤3是用染色液处理在步骤2中用预处理液处理的印迹膜的步骤。该步骤可对印迹膜进行染色，并且也可对吸附在印迹膜表面上的生物膜组分进行染色。
在以下验证实验1至3中，具体地，向在步骤2中已从其中去除预处理液(标记1)的容器(标记5)添加2至10mL的染色液(标记2)，使印迹膜浸渍于染色液中，持续30秒，并随后从容器中去除染色液(参见图1(2))。在之后描述的实验例4(1)中，使用图2中所示的方法进行步骤3，并且在实验例4(2)中，使用图3(2)中所示的方法进行步骤3。在实验例4(1)中，具体地，将印迹膜(标记4)置于包含2至10mL的染色液(标记2)的容器(标记5)中以进行浸渍和润湿，并随后将膜从容器中去除(参见图2)。在实验例4(2)中，具体地，将印迹膜(标记4)置于排液构件(标记8)上，将2至10mL的染色液(标记2)均匀地喷洒或滴加在其上以散布遍及整个膜(浸润)，并随后使过量的染色液通过排液构件(标记8)(参见图3(2))并作为废液收集在置于排液构件下方的废液容器中。
步骤4是用脱色液处理在步骤3中用染色液处理的印迹膜的步骤。该步骤可使非特异性附着于在步骤3中染色的印迹膜的染料脱附。然而，与吸附在印迹膜上的生物膜组分特异性结合的染料保持原样而没有脱附(着色)。作为结果，可在视觉上清晰地确定吸附在印迹膜上的生物膜组分的存在(生物膜组分的可视化)。
在以下验证实验1至3中，具体地，向在步骤3中已从其中去除染色液(标记2)的容器(标记5)添加2至20mL的脱色液(标记3)，使印迹膜浸渍于脱色液中，持续60秒，并随后从容器中去除脱色液(参见图1(3))。在之后描述的实验例4(1)中，使用图2中所示的方法进行步骤4，并且在实验例4(2)中，使用图3(3)中所示的方法进行步骤4。在实验例4(1)中，具体地，将印迹膜(标记4)置于包含2至10mL的脱色液(标记3)的容器(标记5)中以进行浸渍和润湿，并随后将膜从容器中去除(参见图2)。在实验例4(2)中，具体地，将印迹膜(标记4)置于排液构件(标记8)上，将2至10mL的脱色液(标记3)均匀地喷洒或滴加在其上以散布遍及整个膜(浸润)，随后使过量的脱色液通过排液构件(标记8)(参见图3(2))并作为废液收集在置于排液构件下方的废液容器中。
步骤5是在视觉上确定在步骤4中用脱色液处理的印迹膜的着色状态的步骤。该步骤可确定在步骤1中已附着印迹膜的伤口表面上是否存在生物膜。当用脱色液处理的印迹膜中与伤口表面接触的表面被染料着色，并且观察到相对于膜的背景色的对比图像(阳性检测)时，可确定伤口表面上存在生物膜。具体地，当伤口表面上存在生物膜时，生物膜组分吸附在印迹膜中与伤口表面接触的表面上；因此，即使通过染色处理之后的脱色处理，染料也未从吸附部分脱附。因此，吸附部分被着色为比已从其中使染料脱附的膜的背景色(浅色)明显更暗的颜色，并且形成了比膜的背景色(浅色)更暗的对比(对比图像)。
以下验证实验评价了在滴加了生物膜悬浮液的印迹膜表面的2个位置处对比图像的存在。
在验证实验1中，将通过将表1中所示的表面活性剂稀释至不同浓度(0.001％至20％)而制备的水溶液用作在步骤2(预处理步骤)中使用的预处理液和在步骤4(脱色处理步骤)中使用的脱色液，并实施生物膜检测系统(预处理：30秒，染色处理：30秒，以及脱色处理：60秒；总共2分钟)以验证预处理液和脱色液的实用性。在该验证实验中，在步骤1中使用的印迹膜是切成5cm×5cm的矩形、孔径为0.2μm的硝酸纤维素膜(商品名称：SupportedNitrocellulose Membrane，Bio-Rad#1620097)。在步骤3(染色步骤)中使用的染色液是使用阿尔新蓝8GX(A9186，Sigma-Aldrich)制备的0.3％阿尔新蓝水溶液(pH：4.0)。
在脱色处理1分钟之后，从容器中取出印迹膜，并且在视觉上确定着色状态(对比图像的存在)。结果示于表1和2中。表1示出了使用铜绿假单胞菌PAO1菌株悬浮液(用10μl的10
评价标准
○：可在脱色之后立即在视觉上确定对比图像。
△：不能在脱色之后立即在视觉上确定对比图像；但是，当使膜干燥时，可在视觉上确定对比图像。
×：不能在脱色之后立即或当使膜干燥时在视觉上确定对比图像。
表1
在表中，“-”意指未实施。
(1)Nonion OT-221：NOF Corporation、pH：4.0至7.0
(2)Blaoncn EL 1509；Aoki Oil lndustrial Co.，Ltd.，pH：4.5至7.0
(3)Emulgen MSll0：Kao Corporation.pH：4.0至7.0
(4)Triton CG-50(包含50％烷基聚糖苷)，The Dow Chemical Company，pH：9.0至12.0
(5)Pluronic L-31；ADEKA Corporation，pH：3.0至5.0
(6)Sunsoft Q-10Y-C：Taiyo Kagakn Co.，Ltd.，pH：3.0至6.0
(7)Rikabion A-100(包含30％月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱)：New JapanChemizal Co.，Ltd.，pH：6.0至8.0
(8)Genaminox K-12(包含32％月桂基二甲基氧化胺)：Clariant Japan K，K.，pH：6.0至8.0
(9)Cation DDC-80(包含80％二癸基二甲基氯化铵)：Sanyo ChemicalIndnstries，Ltd.pH：5.0至7.0
(10)Cation F2-50(包含50.7％苯扎氯铵)NOF Corpotation.pH：5.0至7.0
(11)Taycapol NE1220(包含27％聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠)：TaycaCorporation，pH：4.0至5.0
(12)SDS：FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation.pH：5.0至6.0
(13)LAS：FUJIFILM Wako Pure Chemieal Corporation，pH：6.0至7.0
表2
在表1中所示的结果中，图5示出了显示出使用包含浓度为5％的以下中的任一种作为表面活性剂的水溶液进行了预处理和脱色处理的印迹膜的着色状态(在脱色之后立即和在干燥之后)的图像：(1)聚山梨酯80、(2)聚氧乙烯月桂基醚和(3)聚氧化烯烷基醚(所有均为非离子型表面活性剂)，(7)月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱和(8)月桂基二甲基氧化胺(所有均为两性表面活性剂)，以及(11)聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠(阴离子型表面活性剂)。
如表1和2中所示，确定了包含浓度为0.001％至20％的非离子型表面活性剂、两性表面活性剂或阳离子型表面活性剂的水溶液可用作预处理液和脱色液。此外，如图5中所示，当使用包含非离子型表面活性剂或两性表面活性剂的水溶液进行预处理和脱色处理时，即使在脱色处理之后立即，生物膜的存在也可在印迹膜上清晰地可视化，并且该状态即使在印迹膜干燥之后也稳定地维持。这些之中，对于包含非离子型表面活性剂，特别是(1)聚山梨酯80、(2)聚氧乙烯月桂基醚或(3)聚氧化烯烷基醚的水溶液，确定了在宽的浓度范围中均获得了稳定的结果；并且，随着印迹膜干燥，膜的背景中的浅蓝色和微红色变浅(褪色)，并且与吸附了生物膜组分的着色部分的对比变得更清晰，从而使生物膜的存在在印迹膜上显著地可视化。
在验证实验1中，还确定了尽管连续进行了步骤2、3和4，甚至当使在步骤1中预处理的印迹膜在室温条件下干燥1周并随后进行步骤2之后的步骤以进行染色和脱色处理时，生物膜的存在可在印迹膜上显著地可视化。
在验证实验2中，将通过将表2中所示的染料(钌红和阿尔新蓝)稀释至不同浓度(0.05％至1.2％)而制备的水溶液用作在步骤3(染色步骤)中使用的染色液，并实施生物膜检测系统(预处理：30秒，染色处理：30秒，以及脱色处理：60秒；总共2分钟)以验证染色液的实用性。
每种染色液以以下方式制备。染色液不预先制备，而是恰好在进行该验证实验之前制备。
(1)钌红水溶液
将钌红粉末(颜色指数77800)溶解于水中至0.5％。
(2)阿尔新蓝水溶液
将阿尔新蓝粉末(颜色指数74240)溶解于水中至0.05％至1.2％。
在验证实验2中，在步骤1中使用的印迹膜是切成5cm×5cm的矩形、孔径为0.2μm的硝酸纤维素膜(商品名称：Supported Nitrocellulose Membrane，Bio-Rad#1620097)。在步骤2(预处理步骤)中使用的预处理液和在步骤4(脱色步骤)中使用的脱色液是5％聚氧乙烯月桂基醚(Blaunon EL 1509，由Aoki Oil Industrial Co.，Ltd.生产)水溶液。
在脱色处理1分钟之后，从容器中取出印迹膜，并且在视觉上确定着色状态。结果示于表3和4中。表3示出了使用铜绿假单胞菌PAO1菌株悬浮液(用10μl的10
表3
-未实施
表4
如表3和4中所示，确定了至少浓度为0.5％的钌红水溶液和浓度为0.05％至1.2％，优选0.1％至1.2％的阿尔新蓝水溶液可有效地用作本发明生物膜检测系统中的染色液。与钌红不同，水溶液形式的阿尔新蓝具有优异的储存稳定性。还确定了钌红和阿尔新蓝可简单地通过将它们溶解于水中而无需调节水溶液的pH而稳定地用作染色液。
在验证实验3中，将由表5中所示的多种材料制成的膜片用作贯穿步骤1至5而使用的印迹膜，并实施生物膜检测系统(预处理：30秒，染色处理：30秒，以及脱色处理：60秒；总共2分钟)以验证印迹膜的实用性。在表5中所示的膜中，通过分别对市售的PVDF(AmershamHybond P)、PVDF(Immun-Blot)以及PVDF(Sequi-Blot)进行亲水性处理来制备PVDF(Amersham Hybond P)/亲水性处理、PVDF(Immun-Blot)/亲水性处理以及PVDF(Sequi-Blot)/亲水性处理。通过将每种市售膜浸渍于95体积％的乙醇中10分钟(亲水性处理)随后进行风干(在实际使用中，将干燥的膜用无菌水润湿，并随后进行步骤1)来进行亲水性处理。在步骤2(预处理步骤)中使用的预处理液和在步骤4(脱色步骤)中使用的脱色液是5％聚氧乙烯月桂基醚(Blaunon EL 1509，由Aoki Oil Industrial Co.，Ltd.生产)水溶液。在步骤3(染色步骤)中使用的染色液是0.3％阿尔新蓝(A9186，Sigma-Aldrich)水溶液(pH：4.0)。
在脱色处理1分钟之后，从容器中取出印迹膜，并且在视觉上确定着色状态。结果示于表5和6中。表5示出了使用铜绿假单胞菌PAO1菌株悬浮液(用10μl的10
表5
*双极尼龙膜
表6
表5和6中所示的结果揭示了尽管在使用伤口印迹的生物膜检测(生物膜检测系统)中，可在带电荷或不带电荷的情况下使用印迹膜，但是可优选使用极性材料或高度亲水性纤维材料。
使用实验例1(验证实验1至3)中建立的生物膜检测系统来评价本发明的生物膜检测方法的检测灵敏度。具体地，使用包含透明质酸和硫酸软骨素(其为构成生物膜的酸性黏多糖的类型)的水溶液(包含0.1mg/mL透明质酸钠和0.1mg/mL硫酸软骨素钠的水溶液)代替在实验例1中使用的铜绿假单胞菌生物膜悬浮液，并且进行步骤2至4(步骤2中的预处理：30秒，步骤3中的染色处理：30秒，以及步骤4中的脱色处理：60秒；总共2分钟)。在步骤2至4中使用的印迹膜是切成5cm×5cm的矩形的表7中所示的多种膜。在步骤2(预处理步骤)中使用的预处理液和在步骤4(脱色步骤)中使用的脱色液是5％聚氧乙烯月桂基醚(Blaunon EL1509，由Aoki Oil Industrial Co.，Ltd.生产)水溶液。在步骤3(染色步骤)中使用的染色液是表4中所示的0.3％阿尔新蓝水溶液。
在脱色处理1分钟之后，从容器中取出印迹膜，并且在视觉上确定着色状态。结果示于表7中。表7中所示的评价标准与以上验证实验中使用的标准相同。
表7
以上结果确定了根据本发明的生物膜检测方法，可在视觉上检测包含各自浓度为0.1mg/mL的至少透明质酸和硫酸软骨素的生物膜。
使用由猪皮制成的模型伤口表面，验证了实验例1(验证实验1至3)中建立的生物膜检测系统。
(1)模型伤口表面的制备
在通过从宰杀供食用的猪获得的皮肤去除毛发而制备的市售猪皮片(5cm×5cm)的表面的中央，逐滴添加200μL的不同细菌溶液(铜绿假单胞菌PAO1、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC 29213，以及这三种细菌的混合物；10
将用无菌水润湿的膜(Supported Nitrocellulose：Bio-Rad，0.2μm)(5cm×5cm)施加至以上制备的模型伤口表面(猪皮)，持续10秒(步骤1：印迹)，并随后如实验例1中的，对剥离的膜进行步骤2至4。在步骤2(预处理步骤)中使用的预处理液和在步骤4(脱色步骤)中使用的脱色液是5％聚氧乙烯月桂基醚(Blaunon EL 1509，由Aoki Oil IndustrialCo.，Ltd.生产)水溶液。在步骤3(染色步骤)中使用的染色液是0.3％阿尔新蓝水溶液。
图6示出了显示出在脱色处理之后(在脱色之后立即和在干燥之后)的印迹膜的着色状态的图像。该实验还确定了如实验例1中的，伤口表面上生物膜的存在可在印迹膜上清晰地可视化，并且该状态即使在印迹膜干燥之后也稳定地维持。如实验例1中的，确定了随着印迹膜干燥，膜的背景中的浅蓝色变浅(褪色)，并且与吸附了生物膜组分的着色部分的对比变得更清晰，从而使生物膜的存在在印迹膜上显著地可视化。
在实验例4(1)和(2)中，作为生物膜检测系统，以不同的处理时间各自进行图2和3中所示的步骤(预处理步骤、染色步骤和脱色步骤)以验证生物膜的反应性(表8和9)。在该实验例中，所使用的印迹膜是切成5cm×5cm的矩形、孔径为0.2μm的硝酸纤维素膜(商品名称：Supported Nitrocellulose Membrane，Bio-Rad#1620097)。在步骤1中，如实验例1或2中的，代替将印迹膜附着于伤口表面以吸附生物膜组分的步骤，将作为生物膜悬浮液的铜绿假单胞菌PAO1菌株悬浮液(10
在步骤4中的脱色处理之后，在视觉上确定各印迹膜的着色状态。结果示于表8和9中。表8和9中所示的评价标准(○)与验证实验1中使用的标准相同。
表8
表9
表8和9中所示的结果确定了在使用伤口印迹的生物膜检测方法(生物膜检测系统)中，预处理步骤可以以最少2秒完成，染色步骤以最少10秒完成，以及脱色步骤以最少10秒完成；并且即使当将预处理步骤延长持续至少180秒、染色步骤延长持续至少300秒以及脱色步骤延长持续至少600秒时，对反应结果也没有影响。每个步骤的优选处理时间为但不限于，预处理步骤：2至60秒，染色步骤：10至60秒，以及脱色步骤：10至60秒。鉴于在临床实践中的用途，优选从以上范围中选择且设置每个步骤的处理时间，使得这些步骤的总时间在2分钟内。
参考标记列表
1.预处理液
2.染色液
3.脱色液
4.印迹膜
5.浸渍容器
6.包含预处理液、染色液或脱色液的容器
7.镊子
8.排液构件
9.废液容器
机译： 用于检测生物膜的试剂盒和用于检测生物膜的方法
机译： 用于检测生物膜的试剂盒及检测生物膜的方法
机译： 用于检测生物膜的试剂盒及检测生物膜的方法
