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苏云金芽胞杆菌Sip1Aa蛋白随机重组突变蛋白

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本发明涉及苏云金芽胞杆菌Sip1Aa蛋白随机重组突变蛋白，属于生物技术领域。本发明获得了Sip1Aa高效可溶性杀虫蛋白突变体M6和M8蛋白，分别改变了一个氨基酸，获得的突变体蛋白M8的杀虫活性提高了4.02倍，M6的杀虫活性提高了2.19倍，有效的克服寻找苏云金芽胞杆菌表达蛋白对大猿叶甲有高毒力基因的难题、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。

著录项

公开/公告号CN112480220A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-03-12

原文格式PDF
申请/专利权人东北农业大学;
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申请/专利号CN202011390510.6
发明设计人李海涛;刘志洋;刘荣梅;王静;高继国;张杰;
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申请日2020-12-02
分类号C07K14/325(20060101);C12N15/32(20060101);A01N47/44(20060101);A01P7/04(20060101);
代理机构11333 北京兆君联合知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人胡敬红
地址 150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区长江路600号
入库时间 2023-06-19 10:13:22

说明书

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及对鞘翅目农业害虫具有高毒力的Bt杀虫基因的随机重组突变蛋白。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性细菌，广泛存在于自然界中，其外形一般呈短杆状，单生或形成短链状。1911年，德国生物学家贝尔奈(Berliner)从德国苏云金的一种地中海粉螟的患病幼虫上分离得到同一种细菌，并命名为苏云金芽胞杆菌。苏云金芽胞杆菌已有100多年的研究历史，有关该菌的报道涉及生物分子学、细胞学、分类命名、Bt的有效成分以及其杀虫机理等方方面面，研究报告已有数万篇之多。

目前，国内外对Bt Sip蛋白的报道较少。Donovan等研究Bt菌株对鞘翅目昆虫的杀虫活性的过程中，发现一些菌株的培养上清液在致死中浓度(LC

从理论上来说，PCR扩增是一个指数增长的过程，但是实际上，PCR的扩增曲线并不是标准的“J”形指数曲线，而是接近于“S”形的曲线。发生这种情况是因为随着PCR扩增循环数的增加。扩增规模呈指数型迅速增大，Taq酶、dNTPs、引物、甚至是DNA模板等各种PCR反应的要素逐渐供不应求，进而导致PCR的效率越来越低，产物增长的速率也就逐渐减缓。当所有PCR所需的原料都被消耗掉以后，PCR就进入了平台期，PCR产物的量也达到饱和。由于各种因素之间复杂的相互作用，不同PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大的差异。

通过荧光定量PCR获得质粒的扩增曲线，检测整个PCR的扩增过程，观察PCR反应的基线期、对数期和平台期，明确在模板量不同的情况下，PCR进入指数扩增的循环数，再通过计算得到达到预期突变率所需的指数扩增循环数。选择能够产生尽可能多的产物量的适宜浓度的质粒作为易错PCR的模板，使用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR产物胶回收纯化后，与载体质粒一同进行双酶切反应，T4连接酶进行连接后转化至大肠杆菌LM109感受态细胞，筛选阳性克隆，保存转化子，即获得sip1Aa随机重组文库。

本专利申请，希望通过随机重组的方法，得到高活性的Sip1Aa突变体蛋白，对于苏云金芽胞杆菌对害虫发挥毒杀作用的关键氨基酸残基的研究，突变率并非越高越好，所以选择合适的突变率至关重要。另外，要研究杀虫蛋白结构与功能的关系，一般以研究单个氨基酸残基的突变为宜，也就是每段目的基因约发生1.5个碱基突变。若仅仅是想要获得性质具有明显变化的蛋白质，可以通过增加PCR体系中Mg

另外，在先前对Cry蛋白的研究中，通过随机突变构建了一系列突变体，其中杀虫活性提高的突变体，都是处于低突变频率的，当突变频率太高时，大部分突变都是有害的，几乎无法筛选到有益突变(Vartanian JP,Henry M,Wain-Hobson S.Hypermutagenic PCRinvolving all four transitions and a sizeable proportion oftransversions.Nucleic Acids Res,1996,24(14):2627-2631.)。同时突变频率如果太低，则会使野生型蛋白占据突变文库的优势，也无法筛选到理想的突变体。因此，本研究选择预期每段目的基因发生1.5个碱基突变的低突变频率，构建sip1Aa随机重组文库。

发明内容

为延缓昆虫抗性和获得更高杀虫活性的突变体蛋白，本研究利用易错PCR技术构建Sip1Aa蛋白随机重组文库，随机选取100个阳性转化子进行序列测定，共产生25个突变体，分别命名为M1-M25。共发生29个碱基突变，平均每个突变体发生1.2个碱基突变。与Sip1Aa蛋白相比，突变体M1(A31,Y118,D227),M5(K168)和M21(I307)的杀虫活性明显降低，活性降低了4-6倍，同时也获得对大猿叶甲杀虫活性提高的突变体M 8(R174S)，活性提高了4.02倍，和M6(F346V)突变体活性提高了2.19倍，该研究结果为Sip1Aa蛋白的分子改造及杀虫活性关键位点的研究提供了借鉴。

突变体M8(R174S)，其氨基酸序列如SEQ ID No.3。

编码上述突变体M8(R174S)的基因。

突变体M6(F346V)，其氨基酸序列如SEQ ID No.5。

编码上述突变体M6(F346V)的基因。

所述的基因序列如SEQ ID No.4，SEQ ID No.6所示。

上述突变体SEQ ID No.3，SEQ ID No.5所示在杀灭大猿叶甲害虫中的应用。

所述应用为将所述的突变体SEQ ID No.3，SEQ ID No.5制成杀虫剂杀灭大猿叶甲。

本发明利用易错PCR技术构建Sip1Aa蛋白随机重组文库，随机选取100个阳性转化子进行序列测定，共产生25个突变体，分别命名为M1-M25。共发生29个碱基突变，平均每个突变体发生1.2个碱基突变。与野生型Sip1Aa蛋白相比，突变体M1(A31,Y118,D227),M5(K168)和M 21(I307)的杀虫活性明显降低，LC50值升高4-6倍，同时也获得了对大猿叶甲杀虫活性提高的突变体M 8(R174S)，其LC50值降低了4倍；和M6(F346V)突变体活性提高了2.19倍。该研究结果为Sip1Aa蛋白的分子改造及杀虫活性关键位点的研究提供了借鉴。

附图说明

图1荧光定量PCR扩增/循环图，

图2 PCR扩增结果，

M：DL2000 DNA Marker，1-2：pAc19sip1Aa质粒模板浓度为3.5ng/μL，PCR分别扩增35个和28个循环；3-4：pAc19sip1Aa质粒模板浓度为35ng/μL，PCR分别扩增35个和13个循环，

图3易错PCR产物及载体酶切，

M：DL5000和DL2000，1：Xho I和EcoR I酶切质粒pAc19sip1Aa后回收3kb载体；2：Xho I和EcoR I酶切易错PCR胶回收产物后回收1kb目的条带，

图4突变位点的分布，

图5随机突变文库蛋白表达分析，

M:Premixed Protein Marker(Low),CK-:pUC19,P:pAc19Sip1Aa,1:M 1,2:M 2,3:M 5,4:M 6,5:M 7,6:M 8,7:M 10,8:M 11,9:M 13,10:M 17,11:M 18,12:M 19,13:M 21and14:M 25，

图6突变位点结构分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

1.材料与试剂

1.1菌株与质粒

实验所用菌株与质粒详见表1，可以对公众发放。

表1菌株与质粒

1.2引物

随机突变引物

根据sip1Aa基因序列设计随机突变引物，在上游引物5'端引入Xho I酶切位点，下游引物5'端引入EcoR I酶切位点。引物序列如表2所示。

表2引物名称及序列

1.3培养基和抗生素

液体LB：胰蛋白胨1％，NaCl 1％，酵母提取物0.5％；氨苄青霉素(Ampicillin):称取100mg氨苄青霉素(Ampicillin)溶于1ml无菌水，过0.22μm滤膜除菌使用时稀释1000倍。

1.5酶和生化试剂

蛋白质Marker购自TaKaRa公司；2×Taq Mix DNA聚合酶购于CWBIO公司；DNA凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.6供试昆虫

实验所用标准化大猿叶甲试虫由中国农业科学院植物保护研究惠赠。

2实验方法

2.1质粒浓度测定

取1μL质粒，利用NanoDrop仪器进行浓度测定。将质粒浓度梯度稀释为35ng/μL和3.5ng/μL。

2.2荧光定量PCR反应

以转化E.coli JM109的pAc19sip1Aa质粒为模板，以sip1Aa-Xho I和sip1Aa-EcoRI为引物对，进行qPCR扩增sip1Aa基因片段，反应体系如下：

反应程序：95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。

2.3易错PCR反应

以3.5ng/μL的pAc19sip1Aa质粒为模板，以sip1Aa-Xho I和sip1Aa-EcoR I为引物对，扩增sip1Aa基因片段，反应体系如下：

PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，59.8℃退火30s，72℃延伸1min。扩增28个循环，最后72℃终止延伸10min。

反应结束后，胶回收目的片段。

2.4酶切反应

利用Xho I和EcoR Ⅰ对pAc19sip1Aa质粒和易错PCR胶回收产物同时进行双酶切，反应体系如下：

反应条件：37℃反应30min。

反应结束后，将酶切产物进行琼脂糖凝胶回收。

2.5连接反应

将胶回收后的双酶切载体片段pAc19与易错PCR胶回收产物通过T4连接酶连接，体系如下：

反应条件：16℃过夜。

反应结束后转化至大肠杆菌JM109感受态，建立随机重组文库。

2.6序列测定及分析

筛选随机重组文库中的阳性克隆，随机挑取100个阳性克隆进行序列测定。

2.7随机重组文库蛋白表达与提取

(1)挑取重组单菌落于5mL含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃，220rpm/min培养12h；

(2)按1％接种量接种至100mL 2×LB液体培养基中，37℃，220rpm/min培养16h；

(3)4℃，8000rpm/min离心10min，收集菌体；

(4)沉淀用5mL 1×TE溶液悬浮；

(5)在冰水浴中进行超声波破碎(80％，3s，3s，10min)；

(6)4℃，12000rpm/min离心10min，收集上清；SDS-PAGE检测蛋白表达情况。

(7)沉淀用2％的Triton-100悬浮，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清，重复3次；

(8)用无菌水悬浮沉淀，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清；

(9)用5mL PBS悬浮沉淀，保存备用。

2.8 SDS-PAGE电泳

聚丙烯酰胺凝胶的配置见表3。

表3 SDS聚丙烯酰氨凝胶的配制

蛋白样品处理：将100μL蛋白样品与40μL 5×上样缓冲液混合后沸水浴10min，12000rpm/min离心10min；

上样电泳：取10μL上清液上样，80V预电泳20min，当蛋白样品浓缩至一条直线，改为120V电泳直至结束。

染色：电泳结束后，取下凝胶，置于已经加入100mL SI的玻璃皿中，微波炉高火加热30s，取出置于摇床上，70rpm/min脱色5min。倒掉SI，将凝胶转移至已经加入100mL SII和2mL SⅢ的玻璃皿中，微波炉高火加热30s，取出置于摇床上，70rpm/min染色20min左右至出现清晰条带。将凝胶取出，转移至装有蒸馏水的玻璃皿中，70rpm/min过夜脱色。

成像：通过凝胶成像系统，将凝胶拍照保存。

2.9杀虫活性测定

将pAc19-Sip1Aa蛋白以及随机重组蛋白稀释至不同浓度，同时以pUC19在大肠杆菌中表达的蛋白作为阴性对照，采用叶浸生物测定法用新鲜小白菜对大猿叶甲进行毒力分析。具体方法如下：

(1)选取新鲜的，大小一致的小白菜叶片，用蒸馏水洗净并放置于滤纸上晾干；

(2)将待测蛋白样品放入无菌培养皿，向样品中加入0.1％家用洗涤剂，将叶片浸泡在蛋白样品中30s左右，上下翻转一次；

(3)将叶片置于保鲜膜上晾干；

(4)将晾干的叶片分别放入铺有被灭菌水喷湿的滤纸的培养皿中；

(5)用毛笔轻轻接入大猿叶甲初孵幼虫，每个叶片接幼虫16头，每个处理做三次重复；

(6)放置27℃生化培养箱中，并于早晚在培养箱内喷适量灭菌水，以保持培养箱空气湿度，光周期控制为14/10(亮/暗)；

48h统计死虫数、活虫数，采用SPSS软件计算死亡率、校正死亡率及LC

3试验结果

3.1确定PCR扩增初始模板浓度

经微量分光光度计NaroDrop测量pAc19sip1Aa质粒的浓度为268.3ng/μL。将质粒梯度稀释为35ng/μL和3.5ng/μL，分别取1μL质粒作为模板，以sip1Aa-Xho I和sip1Aa-EcoRI为引物对进行荧光定量PCR，同时以水为模板进行阴性对照，每个条件重复3次。qPCR扩增结果如图1所示。

PCR指数扩增循环数的不同会导致所产生的突变频率不同，因此通过荧光定量PCR对pAc19sip1Aa质粒的扩增情况进行了摸索。根据图1的结果，当pAc19sip1Aa质粒模板的浓度是35ng/μL时，PCR在10-22循环时，处入指数扩增期；当pAc19sip1Aa质粒模板的浓度是3.5ng/μL时，PCR在25-35循环时，处于指数扩增期。

根据计算结果，要想得到1.5个碱基的突变率，当pAc19sip1Aa质粒模板初始浓度为35ng/μL时，需要13个PCR循环；当pAc19sip1Aa质粒模板初始浓度为3.5ng/μL时，需要28个PCR循环。以此条件进行PCR扩增，结果如图2所示。

由图2可知，PCR扩增达到饱和之前，在相同模板量的情况下，PCR产物的量随着PCR循环次数的增加而增加。将PCR产物进行胶回收后进行浓度测定发现，pAc19sip1Aa质粒模板初始浓度为35ng/μL，13个PCR循环扩增得到的产物浓度要明显低于pAc19sip1Aa质粒模板初始浓度为3.5ng/μL，28个PCR循环扩增得到的产物浓度。为了便于后续的胶回收、酶切等操作，选择pAc19sip1Aa质粒模板初始浓度为3.5ng/μL，28个PCR循环作为建立随机重组文库的条件。

3.2随机重组文库的建立

将初始浓度为3.5ng/μL的pAc19sip1Aa质粒作为易错PCR反应的模板，经过28个PCR扩增循环之后，将产物进行胶回收。接着用限制性内切酶Xho I和EcoR I对胶回收产物进行双酶切，回收1kb大小的目的条带；与此同时，用限制性内切酶Xho I和EcoR I对pAc19sip1Aa质粒进行双酶切，胶回收3kb大小的载体片段，如图3所示。将二者的胶回收产物按照T4连接酶的反应体系进行连接，16℃过夜反应后，转化E.coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，对总计1000个阳性转化子进行保存，即建成sip1Aa随机重组文库。

3.3随机重组文库序列分析

为了验证随机突变目标片段碱基的变化情况，从随机突变文库中随机选择100个阳性转化子进行序列测定，并对测序结果进行分析。其中，共有25个突变体发生碱基改变，分别命名为M1-M25。突变体中核苷酸和氨基酸的变化统计如表4所示。

表4随机重组文库中突变碱基与氨基酸序列

在100个被测序的转化子中，有11个突变体发生了核苷酸变化，但没有引起氨基酸变化。核苷酸发生改变又引起氨基酸变化的突变体共14个，占14％。发生错义突变的突变体分别为M1、M2、M5、M6、M7、M8、M10、M11、M13、M17、M18、M19、M21和M25。在获得的25个突变体中，没有出现突变后产生终止密码子的情况，也没有发现碱基插入和缺失突变。

对100个阳性转化子的测序分析结果显示，100个转化子中，有25个突变体发生了碱基突变，共产生29个核苷酸位点突变(表4)，每个突变体平均发生1.2个碱基突变，与预期的每个突变体发生1.5个碱基突变基本一致。在29个突变的核苷酸位点中，大部分的碱基替换发生在AT→GC，占总突变位点的82.8％，鸟嘌呤和胞嘧啶产生的突变较少，仅有3.4％，这与之前报道的Taq DNA聚合酶在进行PCR反应时具有AT→GC错配的倾向性一致。

3.4突变位点的分布

利用Origin 8.0对随机突变文库中的29个碱基突变位点进行统计分析，结果如图4所示。在sip1Aa核苷酸序列的91-1005bp之间，发生突变的碱基位点分布较为均匀，未发现突变热点。除了第1036位碱基外，其余每个碱基位点均发生1次突变。突变体M6中第1036位的胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤，导致第346位的苯丙氨酸被缬氨酸取代；突变体M13中第1036位胸腺嘧啶突变为胞嘧啶，导致第346的苯丙氨酸突变为亮氨酸。

3.5随机突变文库蛋白表达

对随机重组文库中的重组菌株在大肠杆菌JM109中表达的蛋白进行提取，SDS-PAGE分析发生错义突变的突变体蛋白表达情况，如图5所示。以cry1Ac启动子指导表达的Sip1Aa蛋白为阳性对照，以大肠杆菌中表达的pUC19为阴性对照。结果表明，随机突变体文库中的所有突变体均在大肠杆菌中成功表达，表达产物中含有37.6kDa的目的蛋白，与Sip1Aa蛋白大小一致(图5)。

3.6生物活性测定

首先对14个突变体进行了初步的活性测试，结果显示突变蛋白M6(F346V)和M8(R174S)对大猿叶甲的致死率高于pAcSip1Aa蛋白，突变蛋白M1(A31G，Y118C，D227E)、M2(N305I，T324A)、M5(K168R)和M21(I307T)对大猿叶甲的杀虫活性低于pAcSip1Aa。突变蛋白M7(F89L)、M10(K168N)、M11(I45V)、M13(F364L)、M17(D141G)、M18(N317D)、M19(K193K，E235G)、M25(N75S)和pAcSip1Aa对大猿叶甲的致死率无显著差异。

表5 Sip1Aa随机突变蛋白对大猿叶甲的杀虫结果

将突变体M1、M2、M5、M6、M8和M21纯化后对大猿叶甲进行复筛，以PBS缓冲液作为阴性对照。复筛的蛋白浓度设置为0.1μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL和50μg/mL六个浓度梯度，每个浓度设置三次重复，每个重复接种16头虫，在27℃人工气候箱中培养48h后，统计昆虫死亡情况，计算LC

表5 Sip1Aa随机突变蛋白对大猿叶甲的定量生物活性测定结果

从表6中可以看出，突变体M8突变体活性大大提高，对大猿叶甲的杀虫活性明显好于pAc19Sip1Aa，活性提高了4.02倍，突变体M6对大猿叶甲的杀虫活性提高了2.19倍。突变体M2对大猿叶甲的杀虫活性略低于pAc19Sip1Aa,M1，M5和M21对大猿叶甲的杀虫活性明显低于pAc19Sip1Aa蛋白，活性降低了4倍、5倍和6倍。

3.7突变位点结构分析

利用PDB Viewer软件对Sip1Aa蛋白随机重组文库中的突变体的M1(A31,Y118,D227)、M5(K168)、M8(R174)和M21(I307)位点进行结构分析。

Y118和D260能够形成两条分子内氢键，键长分别为

突变体M5中K168和V236形式两个键长为

突变体M8中第174位精氨酸位于β11折叠上，如图6中g所示。当第174位碱性的精氨酸被中性的丝氨酸取代后(图6中h)，突变体蛋白与野生型Sip1Aa蛋白相比提高了4倍。可能在这个位置上，中性氨基酸更有利于Sip1Aa蛋白在大猿叶甲中发挥毒杀作用。

4结论

本发明采用随机重组技术将Sip1Aa蛋白进行改造，突变体M8和M6的杀虫活性明显提高,突变体M8活性提高了4.02倍，突变体M6对大猿叶甲的杀虫活性提高了2.19倍。另外因为更改了载体的启动子，Sip1Aa突变体蛋M8,M6蛋白质的表达量提高了，溶解性高了，稳定性好。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> Sip1Aa蛋白随机重组突变蛋白

<141> 2020-12-02

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 364

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 1

Met Lys Tyr Lys Phe Ser Lys Val Val Lys Cys Thr Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Met Ile Thr Thr Phe Val Thr Pro Ser Met Ala Val Phe Ala Ala Glu

20 25 30

Thr Lys Ser Pro Asn Leu Asn Ala Ser Gln Gln Ala Ile Thr Pro Tyr

35 40 45

Ala Glu Ser Tyr Ile Asp Thr Val Gln Asp Arg Met Lys Gln Arg Asp

50 55 60

Arg Glu Ser Lys Leu Thr Gly Lys Pro Ile Asn Met Gln Glu Gln Ile

65 70 75 80

Ile Asp Gly Trp Phe Leu Ala Arg Phe Trp Ile Phe Lys Asp Gln Asn

85 90 95

Asn Asn His Gln Thr Asn Arg Phe Ile Ser Trp Phe Lys Asp Asn Leu

100 105 110

Ala Ser Ser Lys Gly Tyr Asp Ser Ile Ala Glu Gln Met Gly Leu Lys

115 120 125

Ile Glu Ala Leu Asn Asp Met Asp Val Thr Asn Ile Asp Tyr Thr Ser

130 135 140

Lys Thr Gly Asp Thr Ile Tyr Asn Gly Ile Ser Glu Leu Thr Asn Tyr

145 150 155 160

Thr Gly Thr Thr Gln Lys Met Lys Thr Asp Ser Phe Gln Arg Asp Tyr

165 170 175

Thr Lys Ser Glu Ser Thr Ser Val Thr Asn Gly Leu Gln Leu Gly Phe

180 185 190

Lys Val Ala Ala Lys Gly Val Val Ala Leu Ala Gly Ala Asp Phe Glu

195 200 205

Thr Ser Val Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Thr Thr Glu Thr Asn Thr

210 215 220

Ile Ser Asp Lys Phe Thr Val Pro Ser Gln Glu Val Thr Leu Ser Pro

225 230 235 240

Gly His Lys Ala Val Val Lys His Asp Leu Arg Lys Met Val Tyr Phe

245 250 255

Gly Thr Gln Asp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Val Ser Phe Asn Asp Lys

260 265 270

Glu Ile Val Gln Lys Phe Ile Tyr Pro Asn Tyr Arg Ser Ile Asp Leu

275 280 285

Ser Asp Ile Arg Lys Thr Met Ile Glu Ile Asp Lys Trp Asn His Val

290 295 300

Asn Thr Ile Asp Phe Tyr Gln Leu Val Gly Val Lys Asn His Ile Lys

305 310 315 320

Asn Gly Asp Thr Leu Tyr Ile Asp Thr Pro Ala Glu Phe Thr Phe Asn

325 330 335

Gly Ala Asn Pro Tyr Tyr Arg Ala Thr Phe Thr Glu Tyr Asp Glu Asn

340 345 350

Gly Asn Pro Val Gln Thr Lys Ile Leu Ser Gly Asn

355 360

<210> 2

<211> 1095

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 2

atgaaataca agttttcaaa agtcgttaag tgtactttac cagctttaat gattactaca 60

ttcgttactc caagtatggc agtttttgcc gcagaaacca agtcgccaaa tctaaatgca 120

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aatggtgata ctttatatat agataccccg gccgaattta catttaatgg agctaatcca 1020

tattatagag caacatttac agaatacgac gagaacggaa atcctgttca aacaaagatt 1080

ttaagtggaa attaa 1095

<210> 3