骨痛药酒中大黄素的含量测定方法

摘要

本发明公开了骨痛药酒中大黄素的含量测定方法，它是以大黄素对照品为对照，以甲醇:水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸/0.01％～0.5％甲酸水溶液＝60～90：40～10为流动相的高效液相色谱法。本发明方法的专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，达到了有效控制药物质量的目的，确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨痛药酒中大黄素含量测定方法，属于中药质量检测技术领域。

背景技术

骨痛药酒是卫生部药品标准中药成方制剂第五册颁布品质，是由原河南省濮阳骨病研究所研制，本药酒是娄氏骨病疗法主要用药之一，骨痛药酒具有祛风定痛，舒筋活络作用，药借酒势，酒助药威，可快速打通愈阻，畅通血管，经络，化解软骨上的瘀血，分割粘连组织，就像溶解冰块一样，逐渐分解钙化变形的增生骨刺。骨痛药酒属于娄氏骨病疗法中药品，其系列都已经取得国家国药准字药品列为国家法定临床用药。其由制草乌、桑寄生、七叶莲、威灵仙、虎枚、苍术、红藤、络石藤、伸筋草等二十二味中药材制成，用于筋骨酸痛，关节不利，四肢酸麻。

大黄素在临床上，用大黄素纯品治疗肿癌，主要用于白血病、胃癌等肿瘤，而最常用的则用于抑菌。它对很多细菌，还具有利尿、利胆、解痉、降低血压抑制免疫功能等作用，现代药理研究表明，为骨痛药酒中的有效成分中的一种，对大黄素进行含量测定显的尤为重要。但是，现有的骨痛药酒的质量检测方法并没有对大黄素成分的含量进行测定，为进一步完善骨痛药酒的质量检测标准，以确保其药品质量，建立骨痛药酒中大黄素的含量测定项目非常必要。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种骨痛药酒中大黄素的含量测定方法，该方法专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，达到了有效控制药物质量的目的，确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

骨痛药酒中大黄素含量测定方法，它是以大黄素对照品为对照，以甲醇:水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸＝60～90：40～10为流动相，检查波长为250-300nm的高效液相色谱法。

上述的骨痛药酒中大黄素含量测定方法，照高效液相色谱法、按下述步骤进行测定：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸＝60～90：40～10；柱温为20～40℃；检测波长为 250-300nm；流速为0.5～1.5mL·min

(2)对照品溶液的制备：取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，备用；

(3)供试品溶液的制备：采用下述方法①-⑤中的任一种：

①精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干,精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；

②精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，用适量石油醚索氏提取30min，残渣挥干后，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；

③精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入70％～80％的乙醇100mL，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50mL的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

④精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，浓缩至干，残留物用0.3％氢氧化钠溶液溶解后，加稀盐酸调至pH5～6，然后用乙酸乙酯或水饱和的正丁醇萃取四次，合并有机层，减压蒸干，残渣用甲醇定容至50mL，摇匀，即得；

⑤精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，浓缩至干，残渣加适量温水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，充分提取后，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3 次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10mL使溶解，通过大孔吸附树脂柱，以水50mL 洗脱，弃去水液，再用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

上述的骨痛药酒中大黄素含量测定方法，所述的流动相为甲醇:0.5％磷酸水溶液＝80:20。

上述的骨痛药酒中大黄素含量测定方法，步骤(1)中的流速为0.8～1.0mL/min；柱温为 35℃；检查波长为285nm。

为确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，申请人进行了一系列试验研究和考察。

一、仪器与试药

仪器Agilent1100 LC系统(美国惠普公司)；四元泵、在线真空脱气机、可变波长紫外检测器(VWD)工作站；FA2004电子分析天平(上海天平仪器厂)、BP211D电子分析天平(德国Starforias公司)；HS2005D超声波洗涤器(天津鑫洲科技公司)；所用仪器和量

具均经校正和检定；

试药骨痛药酒：贵州信邦制药股份有限公司(批号：20180801、20180802、20180803、 20180804、20180805)。

二、方法与结果

1、色谱条件的选择

1.1柱温选择

采用不同柱温进行实验，寻找最佳柱温，结果见表1。

表1

由表1可知，应选择35℃作为柱温，此温度容易控制，且在低压下有利于降低溶剂的粘度，从而降低柱压。

1.2流速选择

采用不同流速进行实验，寻找最佳流速范围，结果见表2。

表2

由表2可知，设置流速在0.8～1.0mL/min内最好。

1.3流动相选择

采用不同流动相进行UV检测，寻找最佳流动相，结果见表3。

表3

由上表可知，选用甲醇:0.5％磷酸水溶液＝80:20作为流动相，其得到的色谱峰效果最好。

2、对照品溶液的制备

取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，备用。

3、供试品溶液的制备

可采用下述方法①-⑤中的任一种进行制备：

①精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干,精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；

②精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，用适量石油醚索氏提取30min，残渣挥干后，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；

③精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入70％～80％的乙醇100mL，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50mL的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

④精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，浓缩至干，残留物用0.3％氢氧化钠溶液溶解后，加稀盐酸调至pH5～6，然后用乙酸乙酯或水饱和的正丁醇萃取四次，合并有机层，减压蒸干，残渣用甲醇定容至50mL，摇匀，即得；

⑤精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，浓缩至干，残渣加适量温水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，充分提取后，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3 次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10mL使溶解，通过大孔吸附树脂柱，以水50mL 洗脱，弃去水液，再用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，

残渣用甲醇溶解并转移至50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

申请人比较了上述5种供试品制备方法，实验结果见表4。

表4

由上表可知，前两种方法虽然操作简便，大黄素提取率高，但大黄素纯度很低。后三种方法步骤虽稍显繁琐，大黄素提取率稍低、但纯度高，在很大程度上消除了杂质对检测结果的影响。

4、检测波长的选择

在250～300nm对大黄素对照品溶液进行光谱扫描，其最大吸收波长为285nm，因此选用 285nm为检测波长。

5、标准曲线的制备

取对照品溶液0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL于10mL容量瓶中，加甲醇稀释，定容，各进样10μL，以不同浓度的大黄素对照品溶液相应的峰面积对浓度绘制标准曲线，计算得回归方程为Y＝2.42×10

6、精密度实验

照对照品溶液的制备项下方法制得对照品溶液，取对照品溶液10μL，重复进样6次，计算得大黄素峰面积RSD为1.06％，表明该方法精密度良好。

7、稳定性实验

照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液，室温下分别于0、2、4、8、12、24h各吸10μL，共进样6次，计算得大黄素峰面积的RSD为1.37％，表明处理后的溶液在室温下24h内稳定，稳定性良好。

8、重复性实验

照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，取同一样品溶液6份，各进样10μL，计算得峰面积的RSD为1.17％，表明重复性良好。

具体实施方式

本发明实施例1：一种骨痛药酒中大黄素的含量测定方法如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.5％磷酸水溶液＝80：20为流动相；检测波长为285nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃；理论板数按大黄素峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，备用；

(3)供试品溶液的制备：精密称骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干,精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本发明实施例2：一种骨痛药酒中大黄素的含量测定方法如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.5％磷酸水溶液＝80:20为流动相；检测波长为285nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃；理论板数按大黄素峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备：取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，备用；

(3)供试品溶液的制备：精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，用适量石油醚索氏提取30min，残渣挥干后，精密加入甲醇100mL，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本发明实施例3：一种骨痛药酒中大黄素的含量测定方法如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.5％磷酸水溶液＝75:25为流动相；柱温为40℃；检测波长为280nm；流速为1.5mL·min

(2)对照品溶液的制备：取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，备用；

(3)供试品溶液的制备：精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入70％～80％的乙醇100mL，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50mL 的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本发明实施例4：一种骨痛药酒中大黄素的含量测定方法如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.5％磷酸水溶液＝70:30为流动相；柱温为20℃；检测波长为275nm；流速为0.5mL·min

(2)对照品溶液的制备：取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，备用；

(3)供试品溶液的制备：精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入甲醇 100mL，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，浓缩至干，残留物用0.3％氢氧化钠溶液溶解后，加稀盐酸调至pH5～6，然后用乙酸乙酯或水饱和的正丁醇萃取四次，合并有机层，减压蒸干，残渣用甲醇定容至50mL，摇匀，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本发明实施例5：一种骨痛药酒中大黄素的含量测定方法如下：

(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.5％磷酸水溶液＝85:15为流动相；柱温为30℃；检测波长为240nm；流速为0.8mL·min

(2)对照品溶液的制备：取大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1mL含0.2mg的溶液，备用；

(3)供试品溶液的制备：精密称取骨痛药酒100ml，于水浴上挥发至干，精密加入甲醇 100mL，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，浓缩至干，残渣加适量温水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，充分提取后，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10mL使溶解，通过大孔吸附树脂柱，以水50mL洗脱，弃去水液，再用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

上述实施例中的所有条件参数的任意组合，均可得到一致的含量测定结果。