一种以单一原料制备多元抗菌益生剂的方法

摘要

一种以单一原料制备多元抗菌益生剂的方法。本发明属于天然抗菌益生剂的提取与制备领域，公开了一种以树皮为原料生产动物养殖用天然抗菌益生剂的工艺，主要方法包括(1)低温水热法预处理树皮，(2)收集并浓缩低温水热抽提液，(3)高温水热预处理低温水热抽提后树皮，(4)依次用蒸发浓缩、酸沉淀法和木聚糖酶解法处理高温水热抽提液(5)将处理后高温水热抽提液和低温水热抽提液混合获得富单宁‑木质素多酚‑木寡糖三元抗菌益生剂(6)将三元抗菌益生剂与酸化剂混合获得富单宁‑木质素多酚‑木寡糖‑酸化剂四元抗菌益生剂。本发明制备的抗菌益生剂具有抗菌、维持酸性生境、促进有益微生物生长的作用，而且生产成本低可作为合成抗生素替代物用于动物养殖。

说明书

技术领域

本发明涉及天然抗菌益生剂的提取与制备领域，具体涉及一种以单一原料 制备用于替代抗生素的多元抗菌益生剂的方法。

背景技术

长期使用抗生素不仅能引起动物内源性感染和二重感染，使病原菌产生耐 药性、降低其免疫功能，而且抗生素在畜产品和生态环境中的残留直接威胁着 人类健康和安全。目前，我国及欧盟已经颁布法令禁止饲料中添加抗生素，因 此，开发天然、安全的抗生素替代品，发展无抗养殖越来越成为我国及美欧国 家着力发展的方向。

发明内容

本发明的目的在于，解决抗生素滥用问题，开发一种抗生素替代物。本发 明以树皮为主要原料，应用双阶段水热法同时从树皮中抽提单宁类、木质素多 酚类、寡糖类以及有机酸，以简单和低成本的工艺制备具有抑菌、益生作用的 天然抗生素替代产品。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种以单一原料制备多元抗菌益生剂的方法，包括如下步骤：

A、物料预处理：选择树皮为原料，粉碎成片状或丝状，气干恒重后继续粉 碎至颗粒并与无铁离子水按质量比为1：4～20混合均匀得到第一混合物料，调 整所述混合物料的pH值为3～8；

B、低温水热抽提：将所述第一混合物料转入抽提釜内，在密闭搅拌条件下 加热至60～100℃，持续作用1～12小时，然后，固液分离，获得固态分离物和含 单宁抽提物的第一上清液，所述第一上清液浓缩5～10倍后得到浓缩单宁抽提液 和冷凝水；

C、高温水热抽提:将所述冷凝水与所述固态分离物按一定固液比相混合， 并按需要加入新的无铁离子水，得到最终固液比为1:3～20的第二混合物料，磷 酸调节所述第二混合物料pH值至4～5，加入抽提釜内，加热至100℃后，放气 至无压力，然后密闭继续加热至120～150℃，保温30～60分钟，然后放气降温至 20～80℃，然后固液分离得到富木质素多酚、聚糖和寡糖的液态抽提物；

D、酸沉去除酸不溶木质素：将所述液态抽提物浓缩至固形物含量大于80％， 得到浓缩抽提液，接着加入硫酸调节所述浓缩抽提液的pH值至1.0～2.5并静止 10～60分钟，然后进行固液分离以去除沉淀，接着收集第二上清液；

E、酶解：向所述第二上清液中加入木聚糖酶分解木聚糖，获得酶解浓缩抽 提液；

F、获得三元抗菌益生剂：所述浓缩单宁抽提液和所述酶解浓缩抽提液按照 一定比例进行混合，获得液态三元抗菌益生剂；所述液态三元抗菌益生剂干燥 后，获得固态三元抗菌益生剂。

树皮是造纸产业的主要废弃物，但其主要组成成分包括木质素、单宁、半 纤维素和纤维素，而且来源广、价格低廉。单独依靠一种抗生素替代物无法完 全取代现有化学合成抗生素的作用，而且商品化的单宁、木质素多酚或者寡糖 的价格都十分昂贵，无法通过商品化单品混用的方法替代抗生素，不具备可行 性。本发明从树皮出发，获得同时富含单宁、木质素多芬和寡糖的多元抗菌益 生剂，可以有效地替代传统抗生素发挥作用，并显著降低生产成本。

单宁是一类水溶性、分子量在500～3 000Da之间的酚类化合物。主要包括 以没食子酸为基本组成单元的水解单宁(包括单宁酸、没食子酸和鞣花酸等) 和以黄烷醇为基本组成单元的缩合单宁(花青素、原花青素)。研究发现单宁 具有强的蛋白质络合能力、金属结合能力、抗氧化和抑菌作用。

木质素多酚是一种水解木质素，构成木质素基本原料是单木酚，而产生单木 酚的起始物是氨基酸苯丙氨酸。木质素多酚包括酚酸(阿魏酸、丁香酸等)、 酚醇等酚类物质。它具有多种“战略性”防御功能:抗氧化剂、抗菌、抗毒素、 抗病毒作用。

木聚糖酶分解木聚糖获得寡糖，是利用天然化合物的益生作用，即通过添加 有益微生物生长所需的营养物质成分来促进微生物的生长。这一类主要包括水 溶性聚糖和寡糖，寡糖是一类由2-10个单糖组成的化合物，主要包括木寡糖、 乳寡糖等。虽然动物不能直接利用大分子寡糖，但肠道内微生物却可以利用这 些寡糖并产生乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸。因此，寡糖可以促进有益微生 物的生长并维持健康的肠道环境。利用本发明工艺主要获得的是木寡糖，木寡 糖的益生作用显著强于乳寡糖、果寡糖等其他益生元。

本发明利用低温水热法、高温水热法和活性酶催化分解相结合，从树皮这一 单一物料中以低成本同时获得单宁、木质素多酚和寡糖，制备成多元抗菌益生 剂，集抗菌消炎、保护动物的肝脏、促进动物生长等多种功能于一身。

低温水热处理后再进行高温水热抽提，还可以有效地降低高温水热阶段的处 理温度和处理时间。步骤B的低温水热抽提后完成后，树皮的天然结构在一定 程度上被破坏，获得的固态分离物主要包含木质素、半纤维素(木聚糖为主)、 多酚、纤维素。此时再进行步骤C高温水热工艺，由于树皮的天然结构已经被 破坏，可以采用较低的处理温度和较少的处理时间。经过步骤C高温水热处理 后，半纤维素与木质素多酚溶于液相，固相残渣内为酸不溶性木质素和纤维素。

优选的，还包括如下步骤：

G、获得四元抗菌益生剂：将所述液态三元抗菌益生剂与液态酸化剂按照任 意比例混合，获得液态四元抗菌益生剂；将所述液态酸化剂与二氧化硅载体混 合，获得固态酸化剂，将所述固态三元抗菌益生剂与所述固态酸化剂任意比例 混合，获得固态四元抗菌益生剂。

在三元抗菌益生剂的基础上，直接添加降低环境pH值的酸性物质，又称酸 化剂，如有机酸和无机酸，可以得到四元抗菌益生剂。在酸性条件下肠道内有 益微生物生长速率显著高于有害微生物，酸性环境甚至可以完全抑制有害微生 物的生长。虽然，肠道内有益微生物也可以依靠自身产生短链有机酸来降低环 境pH，但是有益微生物的大量繁殖需要依靠良好的初始营养和环境条件。因此， 除了提供木寡糖，也需要提供稳定的酸性环境，以利于有益微生物生长成为优 势菌群。

本发明既具有抑制有害菌又可以为有益菌提供营养物质和良好生长环境的 产品将可以达到降低有害微生物生长以及维持机体健康、降低发病率以及减少 化学合成抗生素的利用，减低环境污染以及保持环境安全的目的。

优选的，所述液态酸化剂为有机酸与无机酸按照任意比例混合的混合物。所 述有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、柠檬酸、L-乳酸、富马酸、 山梨酸、酒石酸、苯甲酸、苹果酸中一种或者多种；所述无机酸包括盐酸、磷 酸中一种或者多种。

一方面，无机酸的作用速度快，能快速中和掉饲料内的碱；另一方面，无机 酸有利于维持有机酸的非电离状态，使其容易被有益微生物所利用，二者结合 效果好。

优选的，在所述步骤A中，所述树皮包括毛杨梅树皮、栎木树皮、栗木树皮、 木麻黄树皮、槲树树皮、漆树树叶、云杉树皮、落叶松树皮、油柑树皮、黑荆 树树皮、马占相思树皮中的一种或多种；在所述步骤E中，所述木聚糖酶为内 切-1,4-β木聚糖酶(酶编号3.2.1.8)。

优选的，在所述步骤E中，所述内切-1,4-β木聚糖酶包括糖苷水解酶GH10 家族、糖苷水解酶GH11家族中的一种或多种；所述木聚糖酶与所述树皮的比例 为1×10

糖苷水解酶GH10、GH11家族拥有良好的内切酶活性，能很好的地催化分解 木聚糖。

优选的，在所述步骤E中，所述酶解反应在水性环境中进行，水解温度为 20～90℃，pH为3～8，水解时间为1～96小时。

木聚糖酶添加量为有效水解半纤维素的数量添加，如每1×10

优选的，在所述步骤B中和所述步骤C中，固液分离方法包括板框式滤压、 带式滤压、螺旋压制、蝶式离心中的一种或多种；在所述步骤B中和所述步骤 D中，浓缩方法包括浓缩罐、多功能刮板浓缩罐、旋转薄膜蒸发器、单效、多 效升膜式或降膜式蒸发器，外循环一效、二效、三效蒸发器，强制循环式蒸发 器中的一种或多种。

优选的，在所述步骤F中，所述浓缩单宁抽提液和所述酶解浓缩抽提液的 比例为:10:1～1:10；所述干燥方法包括冷冻干燥、真空干燥、热风干燥、喷雾干 燥中的一种或多种。

一种上述以单一原料制备多元抗菌益生剂的方法制备的多元抗菌益生剂。

一种上述多元抗菌益生剂的应用，其特征在于，应用于畜禽和水产养殖动 物的饲料添加剂、水质调节剂和皮肤喷涂剂。

畜禽包括牛、猪、鸡、鸭、鹅等；水产动物包括虾、鱼、蟹以及两栖类的 牛蛙、美国青蛙、龟和鳖等。

在作为饲料添加剂的应用中，本发明多元抗菌益生剂成分内的酸化剂可以 维持动物肠道健康和保持稳定的pH环境，酚类、有机酸和单宁可以直接抑制有 害微生物生长，寡糖可促进有益微生物的增殖。多元成分互相协同可以达到抑 菌促生长的作用，适用于畜禽和水产动物的饲料添加。

在作为水质调节剂的应用中，本发明多元抗菌益生剂成分内的酸化剂可以 调节池水的pH值，多酚和单宁可以直接抑制池水内有害微生物的增殖；单宁还 可以作为絮凝剂沉淀悬浮颗粒物，抑制底泥浮着病菌的上浮，从而降低水中有 害微生物数量以及饲料残渣；木寡糖可以作为水体中有益微生物的碳源，促进 有益微生物的繁殖，适于水产养殖动物的水质调节。

在作为皮肤喷涂剂的应用中，本发明多元抗菌益生剂对保护和治疗两栖动 物，特别是牛蛙、美国青蛙以及龟和鳖等经济动物的皮肤和皮肤病效果显著。 两栖动物的皮肤是一个重要的免疫和呼吸器官，其对动物生长非常重要，然而 由于高密度饲养经常会出现腐皮病等皮肤疾病。本发明多元抗菌益生剂可以直 接喷洒或者涂覆到皮肤溃烂处，进行局部治疗，具有抑菌、干燥、收敛皮肤， 促进皮肤快速愈合的效果。另外，对于皮肤完整个体而言，多元抗菌益生剂也 可以起到维持皮肤微生物组健康的作用，从而防止病菌的侵害，适于两栖水产 动物的皮肤保健和疾病治疗。

与现有技术相比较，实施本发明，具有如下有益效果：

1、本发明开发的益生-抗菌剂生产工艺创新性的将低温水热法和高温水热法 结合起来处理树皮，以低成本同时提取出了树皮中的单宁类物质和木质素多酚， 完全利用了树皮成分的抗菌潜能。另外，除了能够抗菌消炎外，本益生-抗菌剂 还能保护动物的肝脏，同时能够促进动物生长。

2、本发明利用木聚糖酶酶解树皮低温和高温水热抽提液可将处理液内的木 聚糖水解为具有促进肠道有益微生物生长的益生素-木寡糖。

3、本发明制备的四元抗菌益生剂，因含有酸化剂可以降低动物肠道、皮肤 和养殖水体的pH值，维持酸性环境，促进有益微生物和抑制有害微生物生长， 维持健康的微生物菌群结构，从而可降低养殖动物疾病发生率和抗生素的使用。

4、本发明制备的抗菌益生剂结合了单宁、木质素酚、木寡糖和酸化剂的优 势，通过直接抑制有害微生物生长、为有益微生物提供生长碳源和营造有利于 有益微生物生长的酸性环境的机制来维持养殖动物的肠道、皮肤以及水体的健 康微生物群落结构，从而提高动物抗病力，降低疾病发生率和抗生素使用量， 最终可生产出健康的动物产品，并减少环境污染。

附图说明

图1为本发明工艺流程图；

图2为本发明效果例1三元抗菌益生剂与兽用阿莫西林抑制牛蛙池水中微 生物生长柱状图，其中，AMCL为兽用阿莫西林，TE为三元抗菌益生剂；

图3为实验组(实施例1)治疗后第2天牛蛙皮肤愈合效果图；

图4为空白组第2天牛蛙皮肤愈合效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明 作进一步地详细描述。

实施例1

如图1所示，将气干恒重的马占相思树皮颗粒与水按1:6的比例混合，倒入 高压水热反应釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空5 分钟，以去除氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至80℃，然后开始低温水热 预处理。所述水热预处理条件为温度80℃，处理时间为12小时，搅拌速度30 转/min，初始pH值7。处理结束后快速降温至40℃，经固液分离后，液相经 三效蒸发器浓缩后获得浓缩单宁混合液，固相部分与三效蒸发获得的冷凝水按 1:4的比例混合，倒入高压水热反应釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空5分钟，以去除氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至100 度，开盖放气后开始高温水热预处理。所述水热预处理条件为温度150℃，处 理时间为30分钟，搅拌速度30转/min，磷酸调节pH值至5，处理结束后快速 降温至80℃，经固液分离后，液相经三效蒸发器浓缩后获得富木质素多酚和聚 糖的浓缩高温水热抽提液。调节浓缩的高温水热抽提液pH值调整为5.0，温度 调整为60℃，接着按每1×10

实施例2

如图1所示，将等质量比气干恒重毛杨梅树皮、栎木树皮、栗木树皮和木 麻黄树皮混合物与水按1:4的质量比混合，倒入高压水热反应釜中，盖上反应釜 盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空5分钟，以去除氧气。然后密闭反 应釜各出口，加温至70℃，然后开始低温水热预处理。所述水热预处理条件为 温度70℃，处理时间为18小时，搅拌速度50转/min，初始pH值6。处理结束 后快速降温至50℃，经固液分离后，液相经三效蒸发器浓缩后获得浓缩单宁混 合液，固相部分与三效蒸发获得的冷凝水按1:5的比例混合，倒入高压水热反应 釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空5分钟，以去除 氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至100℃，开盖放气后开始高温水热预处理。 所述水热预处理条件为温度120℃，处理时间为60分钟，搅拌速度50转/min， 磷酸调节pH值至5。处理结束后快速降温至70℃，经固液分离后，液相经三效 蒸发器浓缩后获得富木质素多酚和聚糖的浓缩高温水热抽提液。调节浓缩的高 温水热抽提液pH值调整为5.5，温度调整为55℃，接着按每1×10

实施例3

如图1所示，将等质量比气干恒重槲树树皮、漆树树叶、云杉树皮、落叶 松树皮、油柑树皮和黑荆树树皮混合物与水按1:5的质量比混合，倒入高压水热 反应釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空4分钟，以 去除氧气，然后密闭反应釜各出口，加温至80℃，然后开始低温水热预处理。 所述水热预处理条件为温度80℃，处理时间为24小时，搅拌速度40转/min， 初始pH值7。处理结束后快速降温至50℃，经固液分离后，液相经三效蒸发 器浓缩后获得浓缩单宁混合液，固相部分与三效蒸发获得的冷凝水按1:6的比例混合，倒入高压水热反应釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵， 抽真空5分钟，以去除氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至100℃，开盖放气 5分钟后开始高温水热预处理。所述水热预处理条件为温度130℃，处理时间为 45分钟，搅拌速度60转/min，磷酸调节pH值至4。处理结束后快速降温至70℃， 经固液分离后，液相经三效蒸发器浓缩后获得富木质素多酚和聚糖的浓缩高温 水热抽提液。调节浓缩的高温水热抽提液pH值调整为5，温度调整为65℃，接 着按每1×10

对比例1

将气干恒重的马占相思树皮颗粒与水按1:6的比例混合，倒入高压水热反应 釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空5分钟，以去除 氧气。然后倒入高压水热反应釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真 空泵，抽真空5分钟，以去除氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至100℃，开 盖放气后开始高温水热预处理。所述水热预处理条件为温度150℃，处理时间 为30分钟，搅拌速度30转/min，磷酸调节pH值至5。处理结束后快速降温至 80℃，经固液分离后，液相经三效蒸发器浓缩后获得富木质素多酚和聚糖的浓 缩高温水热抽提液。调节浓缩的高温水热抽提液pH值调整为5.0，温度调整为 60℃，接着按每1×10

对比例2

将气干恒重的马占相思树皮颗粒与水按1:6的比例混合，倒入高压水热反应 釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空5分钟，以去除 氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至80℃，然后开始低温水热预处理。所述 水热预处理条件为温度80℃，处理时间为12小时，搅拌速度30转/min，初始 pH值7。处理结束后快速降温至40℃，经固液分离后，液相经三效蒸发器浓 缩后获得浓缩单宁混合液，pH值调整为5.0，温度调整为60℃，接着按每1×10

对比例3

将气干恒重的马占相思树皮颗粒与水按1:6的比例混合，倒入高压水热反应 釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵，抽真空5分钟，以去除 氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至80℃，然后开始低温水热预处理。所述 水热预处理条件为温度80℃，处理时间为12小时，搅拌速度30转/min，初始 pH值7。处理结束后快速降温至40℃，经固液分离后，液相经三效蒸发器浓 缩后获得浓缩单宁混合液，固相部分与三效蒸发获得的冷凝水按1:4的比例混 合，倒入高压水热反应釜中，盖上反应釜盖，经液面以上出气口连接真空泵， 抽真空5分钟，以去除氧气。然后密闭反应釜各出口，加温至100℃，开盖放气 后开始高温水热预处理。所述水热预处理条件为温度150℃，处理时间为30分 钟，搅拌速度30转/min，磷酸调节pH值至5。处理结束后快速降温至80℃， 经固液分离后，液相经三效蒸发器浓缩后获得富木质素多酚和聚糖的浓缩高温 水热抽提液。将浓缩高温水热抽提液与浓缩单宁混合液充分混合获得液态产品 A，产品A经喷雾干燥后获得固态产品B。将液态产品A与含甲酸、乙酸、丙 酸、丁酸、琥珀酸、柠檬酸和L-乳酸的液态酸化剂按体积比为10:1的比例混合 制成产品C；将固态产品B与含甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、柠檬酸和 L-乳酸的固态酸化剂按质量比为5:1的酶比例相混合，制成固态产品D。

效果例1

取歪头病发病率高达30％的牛蛙养殖池水，接种于YPD培养基，分别向有 氧培养瓶中加入兽用阿莫西林(终浓度0.1和0.2g/L)和三元抗菌益生剂(终浓 度0.1和0.5g/L)，空白为对照组，培养条件为27摄氏度和摇床转速300rpm， 分别于12、24和48小时测定细胞光密度(OD700)，以对照组OD700为标准， 测定生长抑制率，测试结果如表1所示。

表1.三元抗菌益生剂与兽用阿莫西林抑制牛蛙池水中微生物生长效果比较(抑制率，％)

将表格绘制成柱状图，如图2所示，结果表明0.1g/L的三元抗菌益生素就 可以替代0.2g/L的兽用阿莫西林。

效果例2

取歪头病发病率高达30％的牛蛙养殖池水，接种于YPD培养基，分别向有 氧培养瓶中加入兽用阿莫西林(终浓度0.1和0.2g/L)和四元抗菌益生剂(终浓 度0.1和0.5g/L)，空白为对照组，培养条件为27摄氏度和摇床转速300rpm， 分别于12、24和48小时测定细胞光密度(OD700)，以对照组OD700为标准， 测定生长抑制率，测试结果如表2所示。

表2.四元抗菌益生剂与兽用阿莫西林抑制牛蛙池水中微生物生长效果比较 (抑制率，％)

结果表明0.1g/L的四元抗菌益生素的效果已基本优于0.2g/L的兽用阿莫西 林。

效果例3

取头部和背部皮肤溃烂、且体重为100g左右的牛蛙40只，平均分成2组， 分别养殖于白色300L养殖桶内，桶底添加自来水，水量以没过牛蛙腹部为宜。 实验组每天患处涂抹实施例1～3获得的固态产品D.对照组分别涂抹对比例1～3 获得的固态产品D，空白组不涂抹任何药物。每天投食两次，并记录死亡率以 及皮肤愈合状况。测试结果如图3、图4和表3所示。

表3.四元抗菌益生剂作为皮肤喷涂剂的作用效果

结果表明，运用本发明工艺获得的四元抗菌益生剂，施用后能很好地至于 牛蛙等两栖经济动物的皮肤创伤，提高牛蛙的存活率。而对比例1因为缺少了 单宁成分的提取，治愈率和存活率都出现了显著的下降，表明单宁成分在皮肤 愈合过程中发挥重要作用。对比例2和对比例3分别缺少了木质素多酚的提取 和寡糖的获得步骤，治愈率和存活率也均出现了一定程度的下降，表明木质素 多酚和寡糖在皮肤愈合过程中起到协同增强的作用。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明 之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范 围。