产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物以及制备和使用所述前体的方法

摘要

提供工程化为产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体如去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的宿主细胞。所述宿主细胞可具有一种或多种选自以下的工程化的修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶中的失活突变；以及异源编码序列。还提供适用于本发明方法中的使用所述宿主细胞和组合物例如试剂盒、系统等产生目标BIA或其前体的方法。

说明书

本申请为中国专利申请(申请日(进入日)：2016年06月16日，申请号：201480068628.3，以及发明名称为“产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物以及制备和使用所述前体的方法”)的分案申请。

政府权利

本发明是根据由美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的批准号1066100在政府支持下进行的。政府对本发明享有某些权利。

相关申请的交叉引用

按照美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2013年11月4日提交的美国临时专利申请序列号61/899,496的提交日期的优先权；所述申请的公开内容以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明涉及微生物，特别涉及产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的微生物，以及制备和使用所述前体的方法。

背景技术

苄基异喹啉生物碱(BIA)是一大组来自植物和其他生物体的次生代谢物。这些分子在人体中具有从所建立的吗啡和可待因的镇痛和镇咳特性至针对分子如黄连素和血根碱所观察到的针对癌症和感染的新颖活性范围内的治疗功能。供应所有这些BIA分子，以使得它们可供用于研究人员和医师是令人感兴趣的。合成反应的数目和用于选择性立体化学的要求意味着BIA的化学合成是低产率的并且不是用于大规模生产的可行手段。相反，对于广泛使用的药物可待因和吗啡，罂粟(opium poppy/Papaver somniferum)已培育且发育为生产作物。适用作药物和药物前体的吗啡生物合成中的中间体不会积聚，因为植物代谢演化为使至最终阿片样物质的途径通量最大化。即使对于最终产物代谢物像吗啡，积聚仅在芽和维管组织中的特化细胞内发生，并且需要在提取过程中对收获的植物材料进行严苛化学加工，其可产生按干重计少于2％吗啡。如此，用于制备BIA的方法是令人感兴趣的。

发明内容

提供工程化为产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体如去甲乌药碱(norcoclaurine)(NC)和全去甲劳丹碱(norlaudanosoline)(NL)的宿主细胞。所述宿主细胞可具有一种或多种选自以下的修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶中的失活突变；以及异源编码序列。还提供适用于本发明方法中的使用所述宿主细胞和组合物例如试剂盒、系统等产生目标BIA或其前体的方法。

附图说明

本发明根据以下详细描述在结合附图阅读时得到最好理解。要强调的是，按照惯例，附图的各种特征不成比例。相反，为清楚起见，各种特征的尺寸任意地放大或缩小。附图中包括以下附图。

图1示出从葡萄糖至酪氨酸以及其他BIA前体分子的生物合成途径。

图2示出ZWF1敲除和TKL1过度表达对戊糖磷酸途径(PPP)的作用。A：天然PPP通量，B：修饰的PPP通量。

图3示出从前体分子合成NC(A)和NL(B)。

图4示出在不同饲喂酪氨酸情况下四种遗传修饰对NC产生的作用。

图5示出从具有遗传修饰的组合的菌株产生NC。

图6示出醛氧化还原酶(ALD)/醇脱氢酶(ADH)基因敲除菌株中的NL产生的水平。

图7示出体内L-DOPA脱羧酶(DODC)的活性。用DNA转化以表达罂粟酪氨酸/DOPA脱羧酶的酵母菌株能够将L-DOPA体内转化成多巴胺。

图8示出饲喂100mM多巴胺和不同浓度的酪氨酸的酵母菌株中去甲乌药碱(NC)的产生。

图9示出饲喂100mM多巴胺且无酪氨酸的多种工程化酵母菌株中的NC产生。

图10示出在具有L-DOPA脱羧酶PpDODC的额外整合的工程化酵母菌株(CSY980)中从多巴胺或从L-DOPA产生NC。

图11示出使用哺乳动物酪氨酸羟化酶(TyrH)与共底物四氢生物蝶呤(BH4)，包括酪氨酸羟基化的生物合成方案。

图12示出从酵母细胞表达的酪氨酸羟化酶将酪氨酸转化成L-DOPA：(A)LC-MS色谱图证实在共底物BH4存在下酪氨酸转化成L-DOPA；以及(B)溶解产物样品中的L-DOPA离子片段化。

图13示出酪氨酸羟化酶与BH4生物合成酶的共表达提供酪氨酸转化成L-DOPA。

图14示出从NC合成BIA前体分子乌药碱和N-甲基乌药碱。

图15示出在工程化的酵母菌株的液体培养物中从L-DOPA产生NC源性BIA前体分子(包括N-甲基乌药碱)的LC-MS分析(A：离子计数)(B：m/z片段化模式)。

定义

在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下定义以说明和限定说明书中所用术语的含义和范围。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton，等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)以及Hale&Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供本文使用的许多术语的一般性含义。此外，为清楚起见且便于参考，以下定义某些术语。

必须指出，除非上下文另外明确地规定，否则本文和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。例如，术语“一种引物”是指一种或多种引物，即单引物和多种引物。此外应注意，撰写权利要求书以排除任何可选要素。因而，对于使用如“唯一”、“仅”等与权利要求书要素的叙述相关的排他性术语或使用“负面”限制来说，这一陈述意图起到前提基础的作用。

如本文所用，术语“确定”、“测量”和“评定”以及“测定”可互换使用并且包括定量测定和定性测定二者。

如本文所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，包括长度范围为2-50个氨基酸的肽以及长度大于50个氨基酸的多肽。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“多肽”包括编码和非编码氨基酸的聚合物、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸、以及具有修饰的肽主链的多肽，其中常规主链已被非天然存在的或合成的主链置换。多肽可具有任何适宜的长度，例如，2个或更多个氨基酸，如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸、50个或更多个氨基酸、100个或更多个氨基酸、300个或更多个氨基酸，如达500或1000个或更多个氨基酸。“肽”可以是2个或更多个氨基酸，如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸，如达50个氨基酸。在一些实施方案中，肽长度在5与30个氨基酸之间。

如本文所用，术语“分离的”是指目标部分至少60％不含、至少75％不含、至少90％不含、至少95％不含、至少98％不含且甚至至少99％不含所述部分在纯化之前所缔合的其他组分。

如本文所用，术语“由...编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列或其部分包含3个或更多个氨基酸的氨基酸序列，如来自由所述核酸序列编码的多肽的5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、15个或更多个或20个或更多个氨基酸。所述术语还涵盖可用由所述序列编码的多肽免疫学鉴别的多肽序列。

“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。如本文所用，术语“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”可互换用于指能够指导目标基因的表达且能够将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体，其通过所述载体的全部或一部分的基因组整合或作为染色体外元件的载体的瞬时或可遗传维持来实现。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。

“表达盒”包括能够指导目标基因/编码序列的表达的任何核酸构建体，所述序列可操作地连接至所述表达盒的启动子。这类盒被构建到“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”中以便将表达盒转移至靶细胞中。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。

“多个”包含至少2个成员。在某些情况下，多个可具有10个或更多个，如100个或更多个、1000个或更多个、10,000个或更多个、100,000个或更多个、10

数字范围包括限定所述范围的数字。

本文所述的方法包括多个步骤。每个步骤可根据需要在预定量的时间已在步骤之间经过之后进行。如此，进行每个步骤之间的时间可以是1秒或更长、10秒或更长、30秒或更长、60秒或更长、5分钟或更长、10分钟或更长、60分钟或更长且包括5小时或更长。在某些实施方案中，每个随后步骤在前一步骤完成之后立即进行。在其他实施方案中，步骤可在前一步骤完成之后的孵育或等待时间(例如，几分钟至过夜等待时间)之后进行。

其他术语定义可在整个说明书中出现。

具体实施方式

提供工程化为产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体如去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的宿主细胞。所述宿主细胞可具有一种或多种选自以下的工程化的修饰：酶基因中的反馈抑制减轻突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶中的失活突变；以及异源编码序列。还提供适用于本发明方法中的使用所述宿主细胞和组合物例如试剂盒、系统等产生目标BIA或其前体的方法。

在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所述的特定实施方案，因为此类实施方案当然可变化。还应理解，本文所用的术语仅为出于描述特定实施方案的目的，并且不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。

在提供值的范围的情况下，应理解除非上下文另外清楚指示，否则本发明内涵盖所述范围的上限与下限之间的各插入值(至下限单位的十分之一)以及在所陈述范围内的任何其他陈述值或插入值。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在这些较小范围内并且也涵盖于本发明内，从属于所述范围内的任何特定排除的限值。在所述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下，本发明中还包括排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围。

本文中提供的某些范围中数值前面有术语“约”。本文中使用的术语“约”来准确地指示它后面的确切数字以及与此术语后面的数字接近或近似的数字。在确定数值是接近还是近似具体列举的数值时，接近或近似的未列举的数值可以是在其出现的上下文中提供与具体列举的数值大致等同的数值。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文中所述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明，但是现在描述代表性例示方法和材料。

本说明书中所引用的所有公布和专利均以引用的方式并入本文中，就如同各个别公布或专利特定地且个别地被指示为以引用的方式并入，并且以引用的方式并入本文中以公开并且描述引用所述公布时所涉及的方法和/或材料。对任何公布的引用都是针对其在申请日之前的公开内容并且不应被解释为承认本发明由于先前发明而无权先于所述公布。此外，所提供的公布日期可能不同于可需要独立确认的实际公开日期。

应注意，如本文中和所附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。此外应注意，可撰写权利要求书以排除任何可选要素。因而，对于使用如“唯一”、“仅”等与权利要求书要素的叙述相关的排他性术语或使用“负面”限制来说，这一陈述意图起到前提基础的作用。

本领域技术人员在阅读本公开时将明白的是，本文所述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征，这些组分和特征可容易地与任何其它若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所陈述方法均以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。

在进一步描述本发明中，首先更详细地描述目标苄基异喹啉生物碱前体，接着描述用于产生所述苄基异喹啉生物碱前体的宿主细胞。接下来，综述其中宿主细胞所适用的目标方法。还描述可用于实践本发明的方法的试剂盒。

苄基异喹啉生物碱(BIA)前体

如以上所总结，提供产生苄基异喹啉生物碱前体(BIA前体)的宿主细胞。BIA前体可以是带来目标BIA(例如，如本文所述)的产生的合成途径(例如，如本文所述)中的任何中间或前体化合物。在一些情况下，BIA前体具有可表征为BIA或其衍生物的结构。在某些情况下，BIA前体具有可表征为BIA的片段的结构。在一些情况下，BIA前体是早期BIA。如本文所用，“早期BIA”意指细胞中的目标BIA的合成中的早期中间体，其中所述早期BIA由宿主细胞从宿主细胞原料或简单起始化合物产生。在一些情况下，早期BIA是由仅主题宿主细胞从宿主细胞原料(例如，碳和营养物源)产生而无需添加起始化合物至所述细胞的BIA中间体。术语早期BIA可指目标BIA最终产物的前体，无论所述早期BIA本身是否能够被表征为苄基异喹啉生物碱。

在一些情况下，BIA前体是早期BIA，如前牛心果碱苄基异喹啉生物碱。因而，提供产生前牛心果碱苄基异喹啉生物碱(前牛心果碱BIA)的宿主细胞。牛心果碱是经由细胞工程化努力来产生最终产物如阿片类产物的下游BIA合成中的目标主要分支点中间体。主题宿主细胞可从简单且廉价的起始材料产生BIA前体，所述材料可适用于牛心果碱和下游BIA最终产物的产生。

如本文所用，术语“前牛心果碱苄基异喹啉生物碱”、“前牛心果碱BIA”以及“前牛心果碱BIA前体”可互换使用并且指牛心果碱的生物合成前体，无论牛心果碱前体本身的结构是否被表征为苄基异喹啉生物碱。术语前牛心果碱BIA意指包括可产生牛心果碱的宿主细胞生物合成途径的任何适宜成员的生物合成前体、中间体及其代谢物。在一些情况下，前牛心果碱BIA包括苄基异喹啉生物碱片段，如苄基片段、喹啉片段或其前体或衍生物。在某些实例中，前牛心果碱BIA具有可表征为苄基异喹啉生物碱或其衍生物的结构。

目标BIA前体包括但不限于，去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)以及NC和NL前体，如酪氨酸、4-羟基苯乙醛(4-HPA)、4-羟基苯丙酮酸(4-HPPA)、L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3，4-二羟基苯乙醛(3，4-DHPA)以及多巴胺。在一些实施方案中，一种或多种BIA前体是3，4-二羟基苯乙醛(3，4-DHPA)和多巴胺。在某些实例中，一种或多种BIA前体是4-羟基苯乙醛(4-HPA)和多巴胺。图3A和3B分别示出经由皮克特-施彭格勒(Pictet-Spengler)缩合反应从前体分子合成NC和NL，其中所述反应可自发发生或可通过任何适宜的酶催化。

BIA前体的合成途径可在宿主细胞中产生，并且可用任何适宜的起始化合物或材料开始。图1示出从葡萄糖开始BIA前体的目标合成途径。起始材料可以是非天然存在的或起始材料可以是天然存在于宿主细胞中。基于存在于宿主细胞中的合成途径，任何适宜的化合物和材料可用作起始材料。起始材料的来源可以是来自宿主细胞本身(例如酪氨酸)，或者起始材料可从外部来源添加或补充至宿主细胞。因而，在一些情况下，起始化合物是指细胞的合成途径中从外部来源添加至宿主细胞的不为生长原料或细胞生长培养基的一部分的化合物。目标起始化合物包括但不限于多巴胺、4-HPA、4-HPPA以及图1中所示的任何化合物。例如，如果宿主细胞生长在液体培养基中，则细胞培养基可补充有起始材料，所示起始材料转运至细胞中并且由所示细胞转化成所需产物。目标起始材料包括但不限于，廉价的原料和简单前体分子。在一些情况下，宿主细胞利用包括简单碳来源的原料作为起始材料，所示宿主细胞利用所示起始材料来产生细胞的合成途径的化合物。宿主细胞生长原料可包括一种或多种化合物，如碳源(如纤维素、淀粉、游离糖)以及氮源如铵盐或廉价的氨基酸。在一些情况下，适用作起始材料的生长原料可源自可持续来源，如在边际土地上生长的生物质(包括柳枝稷和藻类)或来自其他工业或农业活动的生物质废产物。

宿主细胞

如上所总结，本发明的一方面是一种产生一种或多种BIA前体的宿主细胞。任何适宜的细胞可用于主题宿主细胞和方法中。在一些情况下，宿主细胞是非植物细胞。在一些实例中，宿主细胞可被表征为微生物细胞。在某些情况下，宿主细胞是昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞或酵母细胞。任何适宜类型的宿主细胞可用于产生主题产BIA细胞，参见例如，US2008/0176754和US2014/0273109，其公开内容以引用的方式整体并入。目标宿主细胞包括但不限于，细菌细胞，如枯草杆菌细胞、大肠杆菌细胞、链霉菌属细胞和鼠伤寒沙门氏菌细胞；昆虫细胞，如黑腹果蝇S2和草地贪夜蛾Sf9细胞；以及酵母细胞，如酿酒酵母细胞、粟酒裂殖酵母细胞和毕赤酵母细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞或大肠杆菌细胞。在一些情况下，宿主细胞是酵母细胞。在一些实例中，宿主细胞来自工程化为产生目标BIA前体的酵母菌株。在Smolke等人的US2008/0176754和US2014/0273109中描述的任何宿主细胞可适用于在主题细胞和方法中使用。在某些实施方案中，酵母细胞可具有酿酒酵母(S.cerevisiae)种。在某些实施方案中，酵母细胞可具有粟酒裂殖酵母种。在某些实施方案中，酵母细胞可具有毕赤酵母种。酵母作为宿主细胞是令人感兴趣的，因为细胞色素P450蛋白(其参与一些目标生物合成途径)能够正确地折叠至内质网膜中，以使得它们的活性得以维持。适用于本发明的目标酵母菌株包括但不限于，CEN.PK(基因型：MATa/α ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112 his3 Δ1/his3 Δ1 MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2)、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、∑1278B、AB972、SK1以及FL100。在某些情况下，酵母菌株是以下中的任一者：S288C(MATα；SUC2 mal mel gal2 CUP1flo1 fllo8-1 hap1)、BY4741(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)、BY4742(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；lys2Δ0；ura3Δ0)、BY4743(MATa/MATα；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0)以及WAT11或W(R)，W303-B菌株的衍生物(MATa；ade2-1；his3-11、-15；leu2-3、-112；ura3-1；canR；cyr+)，其分别表达拟南芥NADPH-P450还原酶ATR1和酵母NADPH-P450还原酶CPR1。在另一个实施方案中，酵母细胞是W303α(MATα；his3-11，15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)。另外的目标酵母菌株的身份和基因型可在EUROSCARF(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)找到。

宿主细胞可被工程化为包含提供目标BIA前体的产生的一种或多种修饰(如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种修饰)。在一些情况下，修饰意指遗传修饰，如基因或其片段的突变、添加或缺失，或基因或其片段的转录调控。在一些情况下，一种或多种(如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种)修饰选自：对所述细胞天然的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；对所述细胞天然的生物合成酶基因的转录调节修饰；对所述细胞天然的酶中的失活突变；以及编码酶的异源编码序列。包含一种或多种修饰的细胞可被称为修饰的细胞。

修饰的细胞可过度产生一种或多种BIA前体分子。过度产生意指细胞相对于对照细胞(例如，未修饰的细胞)具有提高的或增加的目标BIA前体分子产生。提高的或增加的产生意指在对照不具有BIA前体产生的情况下一定量的目标BIA前体的产生，以及在对照具有一定BIA前体产生的情况下约10％或更多，如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，如2倍或更多、如5倍或更多、包括10倍或更多的增加。

在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，宿主细胞能够产生增加量的去甲乌药碱。在某些实例中，增加量的去甲乌药碱是相对于对照宿主细胞约10％或更多，如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多或甚至10倍或更多。

在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，宿主细胞能够产生增加量的全去甲劳丹碱。在某些实例中，增加量的全去甲劳丹碱是相对于对照宿主细胞约10％或更多，如相对于对照宿主细胞约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多或甚至10倍或更多。

在一些实施方案中，宿主细胞能够从起始化合物如酪氨酸产生10％或更多产率的去甲乌药碱，如从起始化合物产生20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或甚至90％或更多产率的去甲乌药碱。

在一些实施方案中，宿主细胞能够从起始化合物如酪氨酸产生10％或更多产率的全去甲劳丹碱，如从起始化合物产生20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或甚至90％或更多产率的全去甲劳丹碱。

在一些实施方案中，宿主细胞过度产生一种或多种选自由以下组成的组的BIA前体分子：4-羟基苯乙醛(4-HPA)、L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3，4-二羟基苯乙醛(3，4-DHPA)以及多巴胺。

一种或多种修饰的任何适宜的组合可包含于主题宿主细胞中。在一些情况下，包含两种或更多种(如两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种)不同类型的修饰。在某些实例中，同一类型的修饰的两种或更多种(如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或甚至更多种)不同的修饰包含于主题细胞中。

在宿主细胞的一些实施方案中，当所述细胞包含编码一种或多种酶的一个或多个异源编码序列时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；对所述细胞天然的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及对所述细胞天然的酶中的失活突变。在宿主细胞的某些实施方案中，当所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因的转录调节修饰；对所述细胞天然的酶中的失活突变；以及编码酶的异源编码序列。在宿主细胞的一些实施方案中，当所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；对所述细胞天然的酶中的失活突变；以及编码酶的异源编码序列。在宿主细胞的某些实例中，当所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种酶中的一个或多个失活突变时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；对所述细胞天然的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及编码酶的异源编码序列。

在宿主细胞的某些实施方案中，所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变；以及对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰。在宿主细胞的某些实施方案中，所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变；以及对所述细胞天然的酶中的一个或多个失活突变。在宿主细胞的某些实施方案中，所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变；以及一个或多个异源编码序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种修饰(例如，如本文所述)，所述修饰包含在表1中描述的一种或多种目标基因。

反馈抑制减轻突变

在一些实例中，宿主细胞是包含所述细胞的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个)的细胞。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因是对所述细胞天然的(例如，存在于未修饰的细胞中)。如本文所用，术语“反馈抑制减轻突变”是指减轻宿主细胞的反馈抑制控制机制的突变。反馈抑制是细胞的控制机制，其中受调控化合物的合成途径中的酶在所述化合物已累积至一定水平时受到抑制，从而使所述细胞中的所述化合物的量均衡。在一些实例中，一个或多个反馈抑制减轻突变是在图1或图2的合成途径中描述的酶中。减轻反馈抑制的突变相对于对照细胞降低目标细胞中的受调控酶的抑制，并且提供提高水平的受调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，减轻受调控酶的抑制意指抑制的IC

针对BIA前体的水平的调控的多种反馈抑制控制机制以及对宿主细胞天然的生物合成酶可被靶向以用于在宿主细胞中减轻。宿主细胞可包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。所述突变可位于对宿主细胞天然的任何适宜的生物合成酶基因中，其中所述生物合成酶经受调控控制。在一些实施方案中，所述一种或多种生物合成酶基因编码一种或多种选自3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶和分支酸变位酶(chorismate mutase)的酶。在一些实施方案中，所述一种或多种生物合成酶基因编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因编码分支酸变位酶。在某些实例中，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于选自ARO4和ARO7的生物合成酶基因中。在某些实例中，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于为ARO4的生物合成酶基因中。在某些实例中，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于为ARO7的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种生物合成酶基因(如表1中描述的那些基因中的一种)中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

任何适宜数目和类型的突变可用于减轻反馈抑制控制机制。如本文所用，术语“突变”是指相对于参考序列或基序，氨基酸残基或核苷酸的缺失、插入或取代。所述突变可作为在原始基因座处的天然基因的定向突变并入。在一些情况下，所述突变可作为在单独基因座处作为遗传整合引入的基因的另外拷贝或作为游离型载体如2μ或着丝粒质粒上的另外拷贝并入。在某些实例中，酶的反馈抑制的拷贝在天然细胞转录调控下。在一些实例中，通过将酶的反馈抑制的拷贝置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控情况下引入所述拷贝。

在某些实施方案中，一个或多个反馈抑制减轻突变存在于ARO4基因中。目标ARO4突变包括但不限于，在位置229处用亮氨酸取代赖氨酸残基、在位置166处用赖氨酸残基取代谷氨酰胺残基或如由Hartmann M，等人((2003)ProcNatlAcadSci U S A 100(3)：862-867)或Fukuda等人((1992)J Ferment Bioeng74(2)：117-119)描述的突变。在一些实例中，用于赋予反馈抑制的突变选自酶突变体的诱变文库。这类选择的实例包括用过量酪氨酸拯救培养基中的o-氟-D，L-苯丙氨酸的生长或aro3突变酵母菌株的生长，如由Fukuda等人((1990)Breeding of Brewing Yeast Producing a Large Amount of Beta-PhenylethylAlcohol and Beta-Phenylethyl Acetate.Agr Biol Chem Tokyo 54(1)：269-271)所述。

目标ARO7突变包括但不限于，用异亮氨酸取代位置226处的苏氨酸残基，如由Schmidheini等人((1989)，J Bacteriol 171(3)：1245-1253)所述；以及选自微生物分支酸变位酶突变体的诱变文库的赋予反馈抑制的另外突变。这类选择的实例包括在外部饲喂酪氨酸不存在下在表达异源酪氨酸酶(1.9)的菌株中针对5-甲基色氨酸敏感性或增加的黑色素产生的测定。

在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可包含对所述宿主细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或甚至15个或更多个反馈抑制减轻突变，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个反馈抑制减轻突变。

转录调节修饰

宿主细胞可包含所述细胞的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个修饰)。在一些情况下，所述一种或多种生物合成酶基因是对所述细胞天然的。所述细胞的任何适宜的生物合成酶基因可被靶向以转录调节。转录调节意指相对于对照细胞(例如，未修饰的细胞)调节修饰的细胞中的目标基因的表达，例如，增加或减少、增强或阻抑。在一些情况下，目标基因的转录调节包括增加或增强表达。增加或增强表达意指相较于对照，即未修饰的相同细胞中的表达(例如，通过使用任何适宜的基因表达测定)，目标基因的表达水平增加2倍或更多，如5倍或更多且有时25、50或100倍或更多，并且在某些实施方案中300倍或更多或更高。或者，在细胞中的目标基因的表达如此低以至于其不可检测的情况下，如果表达被增加至可容易检测的水平，则目标基因的表达水平被认为增加。在某些实例中，目标基因的转录调节包括减少或阻抑表达。减少或阻抑表达意指如相较于对照，目标基因的表达水平减少2倍或更多，如5倍或更多且有时25、50或100倍或更多，并且在某些实施方案中300倍或更多或更高。在一些情况下，表达被减少至不可检测的水平。可适于在主题宿主细胞中使用的目标宿主细胞过程的修饰描述于Smolke等人的美国公布号20140273109(14/211,611)中，所述公布的公开内容以引用的方式整体并入本文。

任何适宜的生物合成酶基因可进行转录调节，并且包括但不限于，在图1中描述的那些生物合成酶，如ARO3、ARO4、ARO1、ARO7、TYR1、TYR、TyrH、DODC、MAO、ARO10、ARO9以及TKL。在一些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因选自ARO10、ARO9和TKL。在一些情况下，所述一种或多种生物合成酶基因是ARO10。在某些实例中，所述一种或多种生物合成酶基因是ARO9。在一些实施方案中，所述一种或多种生物合成酶基因是TKL。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种基因(如表1中描述的那些基因中的一种)的一个或多个转录调节修饰。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种基因(如图1和2中的一者的合成途径中描述的那些基因中的一种)的一个或多个转录调节修饰。

在一些实施方案中，转录调节修饰包括用强启动子取代一种或多种生物合成酶基因的天然启动子。驱动目标基因的表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，条件是所述启动子可以在宿主细胞中是活性的。目标基因可从其天然启动子表达，或可使用非天然启动子。虽然不是要求，但这类启动子应在使用它们的宿主中为中等至高强度。启动子可以是调控的或组成型的。在一些实施方案中，使用不受葡萄糖阻抑的、或者在培养基中存在葡萄糖时仅受轻微阻抑的启动子。存在众多适合的启动子，所述启动子的实例包括糖酵解基因的启动子，如枯草杆菌基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶)或来自酵母酿酒酵母的GAPDH启动子(编码甘油醛-磷酸脱氢酶)(Bitter G.A.，Meth.Enzymol.152：673684(1987))。其他目标强启动子包括但不限于，面包酵母的ADHI启动子(Ruohonen L.等人，J.Biotechnol.39：193203(1995))；磷酸饥饿诱导的启动子，如酵母的PHO5启动子(Hinnen，A.等人，Yeast Genetic Engineering，Barr，P.J.，等人编辑，Butterworths(1989)；来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等人，J.Gen.Microbiol.137：11271133(1991))；GPD1和TEF1。目标酵母启动子包括但不限于，诱导型启动子如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS；可阻抑启动子Met25、tetO；以及组成型启动子，如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延长因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。在一些实例中，强启动子是GPD1。在某些实例中，强启动子是TEF1。含有可受激素(如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制酵母表达载体也是已知的并且包括但不限于，糖皮质激素反应性元件(GRE)和甲状腺激素反应性元件(TRE)，参见例如在美国专利号7,045,290中描述的那些启动子。可使用含有组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动目标基因的表达。应了解，可选择对宿主细胞具有特异性的任何适宜的启动子，例如大肠杆菌。在一些情况下，启动子选择可用于优化转录，并且因此，优化酶水平以使产生最大化，同时使能量资源最小化。

宿主细胞可包含所述细胞的酶的一个或多个失活突变(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个)。包含一个或多个失活突变可修饰宿主细胞的合成途径的通量以增加目标BIA前体或产生所述BIA前体的合乎需要的酶活前体的水平。在一些情况下，一个或多个失活突变是针对对细胞天然的酶。图2示出天然戊糖磷酸途径(PPP)通量和修饰的PPP通量，其中其涉及ZWF1酶的失活。如本文所用，“失活突变”意指细胞的基因或调控DNA序列的一个或多个突变，其中所述突变使由所述目标基因表达的蛋白质的生物活性失活。在一些情况下，所述基因是对所述细胞天然的。在一些实例中，所述基因编码失活的酶，并且是由宿主细胞产生的BIA前体的合成途径的一部分或连接至所述合成途径。在一些实例中，失活突变位于控制目标基因的调控DNA序列中。在某些情况下，失活突变是针对基因的启动子。任何适宜的突变(例如，如本文所述)可用于使目标基因或调控DNA序列失活。“失活的”或“失活”意指相对于由未突变对照基因表达的对照蛋白质，由突变的基因表达的蛋白质的生物活性被降低10％或更多，如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多或99％或更多。在一些情况下，蛋白质是酶并且失活突变降低酶的活性。

在一些实施方案中，细胞包含对所述细胞天然的酶中的失活突变。任何适宜的酶可被靶向以用于失活。目标酶包括但不限于在图1和2中描述的那些酶，所述酶在宿主细胞的合成途径中的作用倾向于降低目标BIA前体的水平。在一些情况下，所述酶具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ZWF1(参见，例如图2)。在一些情况下，所述酶具有醇脱氢酶活性。在一些实施方案中，包含失活突变的酶选自ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7以及SFA1。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH2。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH3。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH4。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH5。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH6。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ADH7。在一些情况下，所述酶具有醛氧化还原酶活性。在某些实施方案中，包含失活突变的酶选自ALD2、ALD3、ALD4、ALD5以及ALD6。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD2。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD3。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD4。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD5。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是ALD6。在一些实施方案中，宿主细胞包含表1中描述的一种或多种基因的一个或多个失活突变。

在一些实例中，宿主细胞是具有一个或多个异源编码序列(如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或甚至更多个)的细胞，所述异源编码序列编码使宿主细胞能够产生所需BIA前体(例如如本文所述)的活性。如本文所用，术语“异源编码序列”用于指示编码或最终编码通常不存在于宿主生物体中且可在适当条件下在宿主细胞中表达的肽或蛋白质或其等效氨基酸序列(例如，酶)的任何多核苷酸。因而，“异源编码序列”包括通常存在于宿主细胞中的编码序列的多个拷贝，以使得所述细胞表达通常不存在于所述细胞中的编码序列的另外拷贝。异源编码序列可以是RNA或其任何类型，例如，mRNA、DNA或其任何类型，例如cDNA或RNA/DNA的杂合体。目标编码序列包括但不限于包含这类特征如编码序列、内含子、启动子区、3′-UTR和增强子区的全长转录单位。

在一些实施方案中，所述宿主细胞包含去甲乌药碱(NC)合酶活性。任何适宜的NC合酶适用于主题宿主细胞中。目标NC合酶包括但不限于酶如EC 4.2.1.78，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包含针对NC合酶或其活性片段的异源编码序列。在一些实例中，宿主细胞包含针对将酪氨酸转化成L-DOPA的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在某些情况下，一种或多种酶选自细菌酪氨酸酶、真核酪氨酸酶(例如，EC1.14.18.1)和酪氨酸羟化酶(例如，EC 1.14.16.2.)。在一些实例中，宿主细胞包含针对将L-DOPA转化成多巴胺的一种或多种酶或其活性片段(例如，EC 4.1.1.28)的一个或多个异源编码序列。

在某些实施方案中，所述细胞包含针对将多巴胺转化成3，4-DHPA的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在某些情况下，一种或多种酶是单胺氧化酶(MAO)(例如，EC 1.4.3.4)。一个或多个异源编码序列可源自任何适宜的物种(例如，如本文所述)。在一些情况下，一个或多个异源编码序列可源自表1中所述的物种。在一些情况下，一个或多个异源编码序列存在于选自表1中所述的那些基因或酶的基因或酶中。

在一些实例中，一个或多个异源编码序列包括在编码天然ARO10的基因组基因座处整合的MAO编码序列。在某些实例中，一个或多个异源编码序列包括可操作地连接至诱导型启动子的MAO编码序列。在一些实施方案中，诱导型启动子是包括靶向调控ARO10基因的启动子的DNA结合蛋白的诱导型系统的一部分。在一些实施方案中，宿主细胞包括针对在表1的基因中描述的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。

如本文所用，术语“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分(即肽或酶的cDNA或mRNA序列)以及全长转录单位的编码部分(即包含内含子和外含子的基因)，以及编码酶或编码其等效氨基酸序列的改变的序列的“密码子优化的”序列、截短序列或其他形式，条件是所述等效氨基酸序列产生功能蛋白质。这类等效氨基酸序列可具有一个或多个氨基酸的缺失，其中缺失是N末端、C末端或内部。设想截短形式，只要它们具有本文所指示的催化能力。还设想两种或更多种酶的融合以有助于途径中的代谢物的转移，条件是催化活性得以维持。

可操作的片段、突变体或截短形式可通过建模和/或筛选进行鉴别。通过以逐步方式缺失例如蛋白质的N末端、C末端或内部区域、接着相较于原始序列关于所得衍生物针对所需反应的活性对所述衍生物进行分析来使这一点可能。如果讨论中的衍生物在这种能力方面操作，则认为正确构成酶的等效衍生物。

本发明的方面还涉及编码与各种酶的天然氨基酸序列等效的氨基酸序列的异源编码序列。为“等效”的氨基酸序列被定义为与特定氨基酸序列不相同、而是包含至少一些氨基酸变化(缺失、取代、翻转、插入等)的氨基酸序列，当用于所需目的时，与特定氨基酸序列的类似活性相比，所述变化不会实质上影响蛋白质的生物活性。在脱羧酶的实例中，生物活性是指其催化活性。等效序列还意图包括已被工程化和/或进化为具有与原始氨基酸序列不同的特性的那些。目标易突变特性包括催化活性、底物特异性、选择性、稳定性、溶解性、定位等。在某些实施方案中，“等效”氨基酸序列包含在氨基酸水平下与特定氨基酸序列至少80％-99％同一性，在一些情况下在氨基酸水平下至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更高，在某些情况下至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的，但DNA序列被改变，例如以便优化宿主生物体的密码子使用。

宿主细胞还可被修饰为具有一个或多个遗传改变以适应异源编码序列。天然宿主基因组的改变包括但不限于修饰基因组以减少或消除可能干扰所需途径的特定蛋白质的表达。这类天然蛋白质的存在可将途径的中间体或最终产物中的一种迅速转化成代谢物或在所需途径中不可用的其他化合物。因此，如果天然酶的活性被降低或完全不存在，则所产生的中间体将可更容易并入至所需产物中。

在一些实例中，在消除蛋白质的表达可能令人感兴趣的情况下，是在参与多效性药物反应的蛋白质中，包括但不限于ATP结合盒(ABC)转运蛋白、多重耐药性(MDR)泵和相关转录因子，这些蛋白质参与BIA分子输出至培养基中，因此缺失控制化合物输出至培养基中，从而使得它们更可用于并入至所需产物中。在一些实施方案中，目标宿主细胞基因缺失包括与未折叠蛋白质反应和内质网(ER)增殖相关的基因。这类基因缺失可产生改进的BIA产生。细胞色素P450的表达可诱导未折叠蛋白质反应且可引起ER增殖。与这些应激反应相关的基因的缺失可控制或减少宿主细胞上的总体负担并且改进途径性能。遗传改变还可包括修饰内源基因的启动子以增加表达和/或引入内源基因的另外拷贝。此的实例包括构建/使用过度表达内源酵母NADPH-P450还原酶CPR1的菌株以增加异源P450酶的活性。此外，还可过度表达直接参与中间体代谢物的合成的内源酶，如ARO8、9和10。

目标异源编码序列包括但不限于编码通常负责植物中的BIA和前体产生的酶的序列(野生型序列或等效序列)。在一些情况下，异源序列所编码的酶可以是BIA途径中的任何酶，并且可来自任何适宜的来源。用于特定合成途径的由异源编码序列编码的酶的选择和数目可基于所需产物进行选择。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可包含1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或甚至15个或更多个异源编码序列，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个异源编码序列。

在一些情况下，由异源编码序列编码的肽序列是如GENBANK中所报道。目标酶包括但不限于本文所述的那些酶和表1中所示的那些。宿主细胞可包含来自任何来源的所列举酶的任何组合。除非另外指示，否则表1中的登录号是指GenBank。一些登录号是指酵母属基因组数据库(SGD)，其在万维网www.yeastgenome.org上可获得。

在一些实施方案中，通过将一种或多种酶定位至细胞中的隔室来将宿主细胞(例如，酵母菌株)工程化以选择性产生目标BIA。在一些情况下，酶可位于宿主细胞中，以使得由所述酶产生的化合物自发重排，或在到达可将所述化合物转化成不合意的代谢物的定位酶之前由另一种酶转化成合乎需要的代谢物。可选择两种酶之间的空间距离以防止所述酶中的一种直接作用于化合物而产生不合意的代谢物并且限制不合意的最终产物(例如，不合意的阿片样物质副产物)的产生。在某些实施方案中，本文所述的任何酶(单独地或与第二酶一起)可被定位至宿主细胞中的任何适宜的隔室，包括但不限于细胞器、内质网、高尔基体、液泡、细胞核、质膜或周质。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种酶，所述酶包含定位标签。可利用任何适宜的标签。在一些情况下，定位标签是连接在酶的N末端和或C末端处的肽序列。

任何适宜的方法可用于将标签连接至酶。在一些情况下，定位标签源自内源性酵母蛋白。这类标签可提供至各种酵母细胞器的路径：内质网(ER)、线粒体(MT)、质膜(PM)以及液泡(V)。在某些实施方案中，标签是ER路径选择标签(例如，ER1)。在某些实施方案中，标签是液泡标签(例如，V1)。在某些实施方案中，标签是质膜标签(例如，P1)。在某些实例中，标签包括或源自蛋白质的尾锚定类别内的跨膜结构域。在一些实施方案中，定位标签将酶定位在细胞器的外部上。在某些实施方案中，定位标签将酶定位在细胞器的内部上。

在一些实例中，每种类型的酶的表达通过另外的基因拷贝增加(即，多个拷贝)，其增加中间体积聚和/或BIA前体产生。本发明的实施方案包括通过同时表达单一或多种酶的多个物种变体，宿主细胞中的BIA前体产生增加。在一些情况下，单一或多种酶的另外基因拷贝包含于宿主细胞中。可利用任何适宜的方法，包括针对宿主细胞中的酶的异源编码序列的多个拷贝。

在一些实施方案中，宿主细胞包含针对酶的异源编码序列的多个拷贝，如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或甚至10个或更多个拷贝。在某些实施方案中，宿主细胞包含针对一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种酶等的多个拷贝。在一些情况下，针对酶的异源编码序列的多个拷贝源自两种或更多种相较于宿主细胞不同的源生物体。例如，宿主细胞可包含一个异源编码序列的多个拷贝，其中所述拷贝中的每个源自不同的源生物体。因此，每个拷贝可基于由异源编码序列编码的目标酶的种间差异包含显式序列中的一些变异。

在宿主细胞的一些实施方案中，异源编码序列来自选自由以下组成的组的源生物体：罂粟(P.somniferum)、黄唐松草(T.flavum)和日本黄连(C.japonica)。在一些实例中，源生物体是罂粟、花菱草(E.californica)、日本黄连、黄唐松草、匍枝小檗(Berberisstolonifer)、黄唐松草亚种glaucum、黄连(Coptis chinensis)、唐松草属(Thalictrumspp)、黄连属(Coptis spp)、罂粟属(Papaver spp)、金花小檗(Berberis wilsonae)、墨西哥刺罂粟(A.mexicana)或小檗属(Berberis spp)。在某些实例中，异源编码序列来自选自罂粟、黄唐松草和日本黄连的源生物体。在一些实施方案中，宿主细胞包括来自表1中描述的一种或多种源生物体的异源编码序列。

可对工程化的宿主细胞培养基取样并且监测目标BIA前体的产生。可使用任何适宜的方法观察且测量BIA前体。目标方法包括但不限于LC-MS方法(例如，如本文所述)，其中通过与已知量的标准化合物比较来分析目标样品。身份可例如通过m/z和MS/MS片段化模式确认，并且定量或测量化合物可经由已知保留时间的LC迹线峰和/或参考已知量的化合物标准品的对应LC-MS分析进行的EIC MS峰分析来实现。

方法

如上所总结，本发明的方面包括制备目标苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法。因而，本发明的方面包括在功能性地表达一种或多种宿主细胞修饰(例如，如本文所述)的条件下培养宿主细胞，以使得所述细胞将目标起始化合物转化成目标产物BIA或其前体(例如，前牛心果碱BIA)。还提供以下方法，所述方法包括在适合于蛋白质产生的条件下培养宿主细胞以使得功能性地表达一个或多个异源编码序列并且将目标起始化合物转化成目标产物BIA。在一些实例中，所述方法是一种制备苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法，包括培养宿主细胞(例如，如本文所述)；将起始化合物添加至细胞培养物；以及从所述细胞培养物回收BIA。在所述方法的一些实施方案中，起始化合物、BIA产物和宿主细胞由表1的条目之一描述。

培养宿主细胞的任何适宜的方法可用于产生目标BIA前体和下游BIA。所采用的具体方案可例如取决于宿主细胞、异源编码序列、所需BIA前体等而变化。细胞可存在于任何适宜的环境中，如其中细胞能够表达一种或多种功能性异源酶的环境。如本文所用，体外简单地意指活细胞的外部，不管细胞的位置如何。如本文所用，术语体内指示活细胞的内部，不管细胞的位置如何。在一些实施方案中，将细胞在有利于酶表达的条件下以及用可用于允许体内产生BIA前体的适当底物进行培养。在一些实施方案中，功能性酶是从宿主提取的以用于在体外条件下产生BIA。在一些实例中，宿主细胞被放回至多细胞宿主生物体中。宿主细胞处于任何生长期，包括但不限于稳定期和对数生长期等。此外，培养物本身可以是连续培养物或它们可以是分批培养物。

可利用针对特定细胞类型的任何适宜的细胞培养条件。在某些实施方案中，使用标准细胞培养基和补充剂，将包含一种或多种修饰的宿主细胞在标准或容易优化的条件下培养。作为一个实例，当不需要用于质粒维持的选择性压力时，标准生长培养基可包含20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和20g/L右旋糖(YPD)。含有质粒的宿主细胞在含有1.7g/L酵母氮源、5g/L硫酸铵、20g/L右旋糖、补充有生长和选择所需的适当氨基酸的合成完全(SC)培养基中生长。可用于诱导酶表达的替代碳源包括但不限于蔗糖、棉子糖和半乳糖。在实验室中将细胞在任何适宜的温度(例如，30℃)下在任何适宜速率(例如，200rpm)的振荡下生长于容器中，例如在1-1000mL或更大范围体积的试管或烧瓶中。培养体积还可按比例放大以用于在例如作为工业过程的一部分的较大发酵容器中生长。

用于优化宿主细胞中的异源多核苷酸的表达的任何适宜的密码子优化技术可适用于在主题宿主细胞和方法中使用，参见例如，Gustafsson，C等人(2004)TrendsBiotechnol，22，346-353，其以引用的方式整体并入。

主题方法还可包括将起始化合物添加至细胞培养物。任何适宜的添加方法可适于在主题方法中使用。细胞培养物可补充有足够量的目标起始材料(例如，如本文所述)，例如mM至μM量，如约1-5mM之间的起始化合物。应了解所添加的起始材料的量、添加定时和速率、添加的材料的形式等可根据多种因素而变化。可纯净地添加起始材料或将起始材料可预先溶解于适合的溶剂(例如，细胞培养基、水或有机溶剂)中。起始材料可以浓缩形式(例如，超过所需浓度10x)添加以使在添加时细胞培养基的稀释最小化。起始材料可以一个或多个批次添加，或通过在延长的时间段(例如，数小时或数天)内连续添加而添加。

主题方法还可包括从细胞培养物回收目标BIA前体或下游BIA。任何适宜的分离和隔离方法(例如，色谱方法或沉淀方法)可适于在主题方法中使用以从细胞培养物回收目标BIA或其前体。过滤方法可用于分离细胞培养物的可溶性部分与不溶性部分。在一些情况下，液相色谱方法(例如，反相HPLC、尺寸排阻、正相色谱法)用于使BIA或前体与细胞培养物的其他可溶性组分分离。在一些情况下，萃取方法(例如，液体萃取、基于pH的纯化等)用于使BIA前体或BIA与细胞培养物的其他组分分离。

还包括出于产生目标BIA或其前体的目的工程化宿主细胞的方法。将DNA插入宿主细胞中可使用任何适宜的方法来实现。所述方法用于将异源编码序列插入至宿主细胞中，以使得宿主细胞功能性地表达酶并且将目标起始化合物转化成目标产物BIA。

任何适宜的启动子可用于主题宿主细胞和方法中。驱动异源编码序列的表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，条件是所述启动子在宿主细胞中是活性的。异源编码序列可从其天然启动子表达，或可使用非天然启动子。这类启动子应在使用它们的宿主中为低至高强度。启动子可以是调控的或组成型的。在某些实施方案中，使用不受葡萄糖阻抑的、或者在培养基中存在葡萄糖时仅受轻微阻抑的启动子。目标启动子包括但不限于，糖酵解基因的启动子，如枯草杆菌基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶基因的启动子区)或来自酵母酿酒酵母基因的编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的启动子(GPD、GAPDH或TDH3)；面包酵母的ADH1启动子；磷酸饥饿诱导的启动子，如酵母的PHO5启动子；来自地衣芽孢杆菌的碱性磷酸酶启动子；酵母诱导型启动子，如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS；可阻抑启动子Met25、tetO；以及组成型启动子，如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延长因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子等。含有可受激素(如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素)诱导的启动子的自主复制酵母表达载体也可使用并且包括但不限于，糖皮质激素反应性元件(GRE)和甲状腺激素反应性元件(TRE)。这些和其他实例描述于美国专利号7,045,290中，其以引用的方式并入，包括其中引用的参考文献。可使用含有组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的另外载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动基因的表达。任何适宜的适当启动子可被选择用于宿主细胞，例如大肠杆菌。还可使用启动子选择以优化转录，并且因此，优化酶水平以使产生最大化，同时使能量资源最小化。

任何适宜的载体可用于主题宿主细胞和方法中。目标载体包括用于在酵母和其他细胞中使用。酵母载体的类型可分成4种一般类别：整合型载体(YIp)、自主复制高拷贝数目载体(YEp或2μ质粒)、自主复制低拷贝数目载体(YCp或着丝粒质粒)以及用于克隆大片段的载体(YAC)。经由任何适宜转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。

效用

本发明的宿主细胞和方法(例如，如上文所述)适用于多种应用。目标应用包括但不限于：研究应用和治疗应用。本发明的方法适用于多种不同的应用中，包括其中BIA的产生令人感兴趣的任何适宜的应用。

主题宿主细胞和方法适用于多种治疗应用。目标治疗应用包括其中制备包含BIA的药物产品令人感兴趣的那些应用。本文所述的宿主细胞产生苄基异喹啉生物碱前体(BIA前体)。牛心果碱是包括工程化努力以产生最终产物如阿片类产物的BIA合成中的目标主要分支点中间体。主题宿主细胞可用于从简单且廉价的起始材料产生BIA前体，所述材料可适用于产生牛心果碱和BIA最终产物。因此，主题宿主细胞适用于供应治疗活性BIA或其前体。

在一些实例中，宿主细胞和方法适用于产生商业规模量的BIA或其前体，其中这些化合物的化学合成是低产量的并且不是用于大规模生产的可行手段。在某些情况下，宿主细胞和方法用于发酵设施中，所述发酵设施将包括例如5,000-200,000升容量的生物反应器(发酵罐)，从而允许快速产生用于治疗产物的目标BIA或其前体。这类应用可包括从可发酵碳源如纤维素、淀粉和游离糖工业规模产生目标BIA。

主题宿主细胞和方法适用于多种研究应用。主题宿主细胞和方法可用于分析多种酶对多种目标BIA或其前体的生物合成途径的作用。此外，宿主细胞可被工程化为产生BIA或其前体，所述BIA或其前体适用于测试在尚未证实的治疗功能方面的目标生物活性。在一些情况下，工程化宿主细胞以包含编码多种酶的多种异源编码序列阐明针对目标BIA或其前体的高产量生物合成途径。在某些情况下，研究应用包括产生用于目标治疗分子的前体，所述前体随后可进一步化学修饰或衍生化为所需产物或针对增加的目标治疗活性进行筛选。在一些实例中，宿主细胞菌株用于筛选在这类途径中感兴趣的酶活性，其可导致经由在这些菌株中产生的BIA代谢物的转化发现酶。

主题宿主细胞和方法可用作植物特化代谢物的生产平台。主题宿主细胞和方法可用作药物库开发以及植物酶发现的平台。例如，主题宿主细胞和方法可适用于通过采用酵母菌株产生令人感兴趣的支架分子(如原阿片碱)并且通过组合生物合成或通过化学手段进一步功能化化合物结构来开发基于天然产物的药物库。通过以这种方式产生药物库，任何潜在药物命中已经与易于大规模培养和产生的产生宿主相关。作为另一个实例，这些主题宿主细胞和方法可适用于植物酶发现。主题宿主细胞提供限定代谢物的干净背景以表达植物EST库来鉴别新的酶活性。主题宿主细胞和方法提供用于酵母中的植物酶的功能表达和活性增加的表达方法和培养条件。

试剂盒和系统

本发明的方面还包括试剂盒和系统，其中所述试剂盒和系统可包括在本发明的方法中采用的一种或多种组分，例如，宿主细胞、起始化合物、异源编码序列、载体、培养基等(如本文所述)。在一些实施方案中，主题试剂盒包括宿主细胞(例如，如本文所述)，以及一种或多种选自以下的组分：起始化合物、异源编码序列和/或包含所述异源编码序列的载体、载体、生长原料、适合用于表达系统的组分(例如，细胞、克隆载体、多克隆位点(MCS)、双向启动子、内部核糖体进入位点(IRES)等)以及培养基。

本文所述的任何组分可提供于试剂盒中，例如，包含一种或多种修饰的宿主细胞、起始化合物、培养基等。适合用于制备和使用异源编码序列的多种组分、克隆载体和表达系统可适用于主题试剂盒中。试剂盒还可包括管、缓冲剂等以及使用说明书。根据需要，试剂盒的各种试剂组分可存在于单独容器中，或所述组分中的一些或全部可预组合于单一容器中的试剂混合物中。

还提供用于产生目标BIA的系统，其中所述系统可包括包含一种或多种修饰(例如，如本文所述)的工程化的宿主细胞、起始化合物、培养基、发酵罐和发酵设备，例如，适合于维持宿主细胞的生长条件的设备、取样和监测设备和部件等。适合用于酵母细胞的大规模发酵的各种组分可适用于主题系统中。

在一些情况下，所述系统包括用于工程化的宿主细胞的大规模发酵以及监测和纯化由发酵的宿主细胞产生的BIA化合物的部件。在某些实施方案中，在发酵罐中的工程化的宿主细胞产生一种或多种所需BIA产物或其前体的条件下将一种或多种起始化合物(例如，如本文所述)添加至所述系统。在一些实例中，宿主细胞产生目标BIA前体(例如，如本文所述)。在某些情况下，目标BIA产物是阿片类产物，如可待因、尼奥平(neopine)、吗啡、新吗啡、氢可酮、羟考酮、氢吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因或二氢吗啡。

在一些情况下，所述系统包括用于监测和或分析通过主题宿主细胞产生的一种或多种BIA化合物或其前体的装置。例如，如本文所述的LC-MS分析系统、色谱系统或任何适宜的系统，其中样品可进行分析或与标准品(例如如本文所述)比较。可通过取样和分析在发酵之前和期间的任何适宜的时间监测发酵培养基。当起始化合物转化为目标BIA产物或前体完成时，发酵可停止并且可进行BIA产物的纯化。因此，在一些情况下，主题系统包括适用于纯化来自其在其中产生的宿主培养基的目标BIA产物或前体的纯化部件。纯化部件可包括可用于纯化发酵的BIA产物或前体的任何适宜的方式，包括但不限于，二氧化硅色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法、HIC色谱法、尺寸排阻色谱法、液体萃取和pH萃取方法。在一些情况下，主题系统提供在将一种或多种起始化合物输入至所述系统之后目标BIA发酵产物的产生和分离。

提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和说明，并不意欲限制本发明人看待其发明的范围，也不意欲表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。虽然已尽力确保就所用数字(例如量、温度等)来说的准确性，但仍应考量一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。

实验

一系列特异性遗传修饰提供用于从简单廉价的原料或前体分子产生BIA的酿酒酵母中的生物合成过程。描述了用于从非BIA前体或简单原料构建能够产生早期BIA分子去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)的新颖菌株的方法。NC从未被报道为微生物合成的产物并且是所有已知BIA分子的天然前体。还描述了用于操纵酵母生物合成途径的调控以及用于优化芳香族氨基酸和相关BIA前体的产生的方法。

出于用于增加BIA前体分子的细胞内浓度的目的，通过芳香族氨基酸生物合成途径在改进的通量下开发酿酒酵母的菌株，所述BIA前体分子包括酪氨酸、4-羟基苯乙醛(4-HPA)、L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3，4-二羟基苯乙醛(3，4-DHPA)以及多巴胺。这些菌株一般出于从针对芳香族氨基酸合成的中心代谢增加碳通量的目的将遗传修饰组合至酵母菌株，并且包括引入关键异源酶以用于产生不由酵母天然产生的BIA前体分子。采用了遗传修饰，包括将反馈抑制减轻突变引入至编码天然生物合成酶的基因，调整天然生物合成酶的转录调控，缺失编码使前体分子转移远离所意图途径的酶的基因，并且引入异源酶以用于将天然内源性分子转化成非天然BIA前体分子。

具体描述：

1.1)工程化菌株中的生物合成途径将反馈抑制减轻突变(1.1.1)并入至天然酵母基因ARO4，所述基因单独或组合编码3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶。这种突变(ARO4

1.1.1)ARO4

1.2)工程化菌株中的生物合成途径将反馈抑制减轻突变(1.2.1)并入至天然酵母基因ARO7，所述基因编码酶分支酸变位酶。这种突变(ARO7

1.2.1)ARO7

1.3)工程化菌株中的生物合成途径并入强启动子元件(如GPD1、TEF1等)的引入以用于过度表达天然酵母基因ARO10，所述基因编码具有羟基苯丙酮酸脱羧酶活性的酶。这种遗传修饰作为在原始基因座处的天然启动子DNA序列的定向交换、作为在单独基因座处的遗传整合引入的在新转录调控下的基因的另外拷贝或作为游离型载体如2μ或着丝粒质粒上的另外拷贝并入。

1.4)工程化菌株中的生物合成途径并入强启动子元件(如GPD1、TEF1等)的引入以用于过度表达天然酵母基因ARO9，所述基因编码具有羟基苯丙酮酸/谷氨酸转氨酶活性的酶。这种遗传修饰作为在原始基因座处的天然启动子DNA序列的定向交换、作为在单独基因座处的遗传整合引入的在新转录调控下的基因的另外拷贝或作为游离型载体如2μ或着丝粒质粒上的另外拷贝并入。

1.5)工程化菌株中的生物合成途径并入强启动子元件(如GPD1、TEF1等)的引入以用于过度表达天然酵母基因TKL，所述基因编码具有转酮醇酶活性的酶。这种遗传修饰作为在原始基因座处的天然启动子DNA序列的定向交换、作为在单独基因座处的遗传整合引入的在新转录调控下的基因的另外拷贝或作为游离型载体如2μ或着丝粒质粒上的另外拷贝并入。

1.6)工程化菌株中的生物合成途径通过并入天然酵母基因ZWF1的缺失或失活突变得以改进，所述基因编码具有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的酶。

1.7)工程化菌株中的生物合成途径通过并入已知天然醇脱氢酶(如由基因ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7或SFA1编码的酶)的一个或多个缺失或失活突变得以改进。

1.8)工程化菌株中的生物合成途径通过并入已知天然醛氧化还原酶(如ALD2、ALD3、ALD4、ALD5活ALD6)的一个或多个缺失或失活突变得以改进。

1.9)生物合成途径并入异源酶以用于将酪氨酸转化成L-DOPA。所述酶可来自其中类别中的一种，包括但不限于细菌酪氨酸酶、真核酪氨酸酶和酪氨酸羟化酶(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生L-DOPA的酶通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控情况下引入。

1.9.1)在使用酪氨酸羟化酶以用于将酪氨酸转化为L-DOPA的生物合成途径中，编码用于合成和再循环蝶呤辅因子四氢生物蝶呤(BH4)及其衍生物的酶的基因的另外表达被并入工程化的菌株中以支持酪氨酸羟化酶的活性。这些酶包括GTP环化水解酶、6-丙酮酰基-四氢蝶呤合酶、墨蝶呤还原酶、4a-羟基四氢生物蝶呤脱水酶以及醌型二氢蝶啶还原酶(表1)。这些酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这些BH4合成和再循环酶通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控情况下引入。

1.10)生物合成途径并入异源酶以用于将L-DOPA脱羧来产生多巴胺。具有这种活性的酶由来自多种生物体(包括细菌、植物和哺乳动物)的基因编码。实例包括：恶臭假单胞菌DOPA脱羧酶(PpDODC)、褐家鼠DOPA脱羧酶(RnDODC)，和罂粟酪氨酸/DOPA脱羧酶(PsTYDC)(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生多巴胺的酶通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控情况下引入。

1.11)用于产生3，4-DHPA的生物合成途径并入异源酶以用于将多巴胺氧化成3，4-DHPA。可用于菌株中的编码这种酶的基因的实例包括人单胺氧化酶A(hMAOA)、大肠杆菌单胺氧化酶(EcMAO)和藤黄微球菌单胺氧化酶(MIMAO)(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生3，4-DHPA的酶通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控情况下引入。

1.11.1)用于产生NC的菌株需要多巴胺和4-HPA，而用于产生NL的菌株需要多巴胺和3，4-DHPA，而不需要4-HPA。用于将产生NC的菌株转化成产生NL的菌株的特异性修饰是将MAO基因整合至编码天然酵母基因ARO10的基因座处的酵母基因组中。这组合负责用于将酪氨酸生物合成前体转化成4-HPA的天然酵母酶的缺失与引入能够将多巴胺转化成3，4-DHPA的酶。

1.11.2)酵母菌株用在诱导型启动子的控制下表达MAO酶(1.11)的基因构建。当所述菌株在诱导物存在下生长时，它可催化多巴胺转化成3，4-DHPA，在诱导物不存在下所述菌株仅产生4-HPA。

1.11.2.1)酵母菌株用诱导型MAO表达(1.11.2)构建，其中诱导系统还包含靶向调控ARO10基因的启动子的DNA结合蛋白(1.3)。控制ARO10的合成启动子因此在控制MAO基因的启动子被活化时受阻抑，并且ARO10仅在MAO基因不具有转录活性时表达。这种系统允许构建仅有条件地产生NC或NL的前体的单一菌株。

开发了用于在酵母中产生BIA分子NC的方法并且展示用于NC的微生物合成的第一系统。使用本文所述的工程化的菌株，NC产生且针对其自身价值积聚或与另外异源酶的生物合成途径组合以用于完成下游BIA的合成。

具体描述：

2.1)酵母菌株在液体培养物中生长至高细胞浓度，之后在含有高浓度多巴胺的成分明确的培养基中回稀释至中间浓度(如通过光密度或OD所测量)。培养基组分仅需要满足用于菌株的生长的条件；使用了各种生长原料(例如，不同糖、氮源)。由这些酵母菌株产生的NC由酵母细胞排泄并且可在用过的培养基中测量。经由细胞溶解和从溶解产物萃取而回收由细胞保留的另外的NC。

2.2)含有如在(1.1-1.8)中所述的修饰的各种组合的酵母菌株在饲喂多巴胺测定中实质上改进从在未修饰的菌株中所述可测量产生NC，如上所述(2.1)。在其中无细胞外酪氨酸可用于酵母培养基的条件下，所述的修饰(1.1-1.8)提供从饲喂多巴胺产生NC；在这些条件下来自未修饰的酵母菌株的NC产生最经常是不可检测的。

2.3)将含有如在(1.10)中所述的修饰时产生NC的酵母菌株如在(2.1)中所述来生长，当添加至培养基的另外BIA前体是L-DOPA而不是多巴胺时。

2.3.1)如在(2.3)中所述含有如在(1.1-1.8)中所述的修饰的不同组合的酵母菌株实质上改进NC的产生。

2.4)当含有用于将酪氨酸转化成多巴胺的异源酶(1.9，1.10)连同以上所述的修饰(1.1-1.8)的不同组合时产生NC的酵母菌株生长在未补充酪氨酸、L-DOPA或多巴胺的培养基中。这一具体实例构成从简单碳源和氮源通过所述菌株完全合成NC。

2.5)酵母菌株如上所述进行修饰和培养(2.1-2.4)，其中生物合成途径包括并入异源酶NCS，或NCS酶的截短型式，以用于立体定向催化反应，从而缩合多巴胺和4-HPA以用于S-NC产生。这种酶可源于几种植物中的一种，如罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生S-NC的酶通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控情况下引入。最终产生的NC将是对映体混合物，其中偏向S-立体异构体。

开发方法来从酵母产生BIA分子NL。使用本文所述的工程化的菌株，NL产生且针对其自身价值积聚或与其他异源酶的生物合成途径组合以用于完成下游BIA的合成。

具体描述：

3.1)含有如在(1.11、1.11.1-1.11.2、1.11.2.1)中所述的修饰的酵母菌株生长在如在(2.1)中描述的液体培养物中以产生NL。

3.2)含有如在(1.7，1.8)中所述的基因缺失的各种组合的酵母菌株在饲喂多巴胺测定中改进从在未修饰的菌株中可测量的NL产生，如上所述(3.1)。

3.3)将含有如在(1.10、1.11、1.11.1-1.11.2、1.11.2.1)中所述的修饰时产生NL的酵母菌株如在(3.1)中所述来生长，当添加至培养基的另外BIA前体是L-DOPA而不是多巴胺时。

3.3.1)如在(3.3)中所述的含有如在(1.7，1.8)中所述的基因缺失的组合的酵母菌株改进NL的产生。

3.4)当含有用于将酪氨酸转化成多巴胺(1.9，1.10)以及将多巴胺转化成3，4-HPA(1.11)的异源酶连同以上所述的修饰(1.1-1.8，1.11.1)的不同组合时产生NL的酵母菌株生长在未补充酪氨酸、L-DOPA或多巴胺的培养基中。这一具体实例构成从简单碳源和氮源通过所述菌株完全合成NL。

3.5)酵母菌株如上所述进行修饰和培养(3.1-3.4)，其中生物合成途径包括并入异源酶NCS，或NCS酶的截短型式(表1)，以用于立体定向催化反应，从而缩合多巴胺和3，4-HPA以用于S-NL产生。这种酶可源于几种植物中的一种，如罂粟、日本黄连和黄唐松草(表1)。所述酶的基因作为遗传整合并入或并入在游离型载体如2μ或着丝粒质粒上。这种产生S-NL的酶通过将酶置于合成启动子的控制下在蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控情况下引入。最终产生的NC是对映体混合物，其中偏向S-立体异构体。

示出从葡萄糖至酪氨酸以及其他BIA前体的生物合成途径的示意图。存在于天然酵母代谢中的芳香族氨基酸中间体以黑色写出。内源性酵母酶以灰色写出(除了TYR、TyrH、DODC和MAO)。异源酶和非天然BIA前体分子包括TYR、TyrH、DODC和MAO。如在(1.1，1.2)中所述，由ARO4和ARO7编码的野生型酵母酶由酪氨酸别构抑制，在此由灰色虚线指示。戊糖磷酸途径和糖酵解中的单独步骤未在此图中明确详述，但是基因TKL1和ZWF1(在1.5、1.6中靶向)参与戊糖磷酸途径，如所指示。

示意图详细说明当葡萄糖是主要碳源时，对TKL1(1.5)和ZWF1(1.6)的修饰如何影响通过酵母中的戊糖磷酸途径的总碳流。图A表示野生型碳流；图B表示修饰的菌株中的碳流的相对变化。

经由皮克特一施彭格勒缩合反应从多巴胺的一个分子和4-HPA的一个分子合成NC。所述反应可自发发生以产生R-和S-NC的外消旋混合物。所述反应可替代地通过植物酶NCS催化，其产生S-NC。

经由皮克特-施彭格勒缩合反应从多巴胺的一个分子和3，4-DHPA的一个分子合成NL。所述反应可自发发生以产生R-和S-NL的外消旋混合物。虽然NCS的天然产物是NC，但所述酶已显示催化S-NL的立体定向产生(参见例如，Rueffer等人(1981)(S)-Norlaudanosoline Synthase-the 1st Enzyme in the BenzylisoquinolineBiosynthetic-Pathway.FebsLett 129(1)：5-9)。

BIA分子的测量通过LC-MS分子进行，其中观察到NC产生(m/z＝+272，19.2分钟保留时间)和NL产生(m/z＝+288，18.9分钟保留时间)，其中离子MS2片段化与标准和公开的检测方法一致(参见例如，Schmidt等人(2007)Poppy alkaloid profiling by electrospraytandem mass spectrometry and electrospray FT-ICR mass spectrometry after[ring-13C6]-tyramine feeding.Phytochemistry 68(2)：189-202)。

NC产生在具有靶向遗传修饰的菌株中在几种浓度的饲喂酪氨酸(包括无饲喂酪氨酸)下展示。将野生型菌株CEN.PK2与赋予四种遗传变化中的一种(如在1.1-1.4中所述)的构建体整合：通过用P

如上所述的一些遗传修饰(1.5，1.6)仅与ARO4

NL产生通过在2μ质粒(1.11)上在表达人MAOA的菌株中缺失竞争性酵母酶(1.7，1.8)并且在含有多巴胺的培养基中生长而得以改进。NL产生被示出为在标准化至WT(具有hMAO，但不具有缺失)的用过的培养基中测量的滴度。产生的改进是WT NL产生的十倍多。

用DNA转化以表达罂粟酪氨酸/DOPA脱羧酶的酵母菌株能够将L-DOPA体内转化成多巴胺。使具有2μ质粒的菌株生长在选择性培养基中且随后回稀释至含有L-DOPA的培养基中。随后针对L-DOPA(保留时间4.8分钟，m/z＝+198)和多巴胺(保留时间4.2分钟，m/z＝+154)的浓度测量用过的培养基。

在多种野生型酵母实验室菌株中在不同酪氨酸浓度下如在(2.1)中所述产生NC。具体地说，将每种酵母菌株接种至单独的液体培养物中且过夜生长至OD

在多种工程化的酵母菌株中在饲喂100mM多巴胺和无酪氨酸下如在(2.1)中所述产生NC。这些数据在来自图5中的那些的单独实验中产生。将菌株CSY977-981工程化以包含在(1.1-1.6)中描述的遗传修饰的组合；在每个菌株名称下方的标记指示哪种修饰并入每个菌株中。菌株CSY981包含对酵母天然代谢的五种遗传修饰并且表现出NC滴度高于野生型菌株CEN.PK2的二十倍增加。

NC产生如在(2.1)中所述(对于黑色菱形)和如在(2.3)中所述(对于灰色圆圈)。在此，NC在另外整合L-DOPA脱羧酶PpDODC(1.10)的工程化的酵母菌株(CSY980)中产生。在单独液体培养物中，此酵母菌株生长在含有不同浓度的多巴胺的YNB基本培养基(黑色菱形)和含有L-DOPA的YNB基本培养基(灰色圆圈；未饲喂多巴胺的培养物)中。黑色实线表示测量的NC与饲喂多巴胺之间的关系的线性回归。将L-DOPA饲喂样品的峰面积测量值沿多巴胺饲喂样品的回归线绘制以示出饲喂L-DOPA的培养物的“等效饲喂多巴胺”量。将L-DOPA培养基混合以实现10mM L-DOPA的靶浓度，然而L-DOPA在所述浓度下不完全可溶，并且溶解的L-DOPA的有效浓度被估计为大约6mM。基于两种L-DOPA饲喂酵母培养物的平均NC滴度，“等效饲喂多巴胺”浓度是大约50mM或饲喂L-DOPA浓度的8倍(由灰色虚线指示)。

哺乳动物酪氨酸羟化酶(TyrH)能够羟化酪氨酸，但依赖于共底物四氢生物蝶呤(BH4)获得活性，如在(1.9.1)中所述。在通过TyrH将酪氨酸催化为L-DOPA期间，分子氧分裂且转移至酪氨酸和BH4，如由反应1所示。BH4被氧化成BH4-4α-甲醇胺(4αOH-BH4)。两种异源酶在酵母中表达以从叶酸合成途径中间体三磷酸二氢新蝶呤合成BH4。首先，6-丙酮酰四氢蝶呤合酶(PTPS)将二氢新蝶呤转化成PTP(反应2)，所述PTP随后通过墨蝶呤还原酶还原成BH4(SepR，反应3)。两种酶负责从其4α-甲醇胺形式再生BH4。首先，蝶呤-4a-甲醇胺脱水酶(PCD)催化水损失反应以形成二氢生物蝶呤(反应4)。二氢生物蝶呤随后通过醌型二氢蝶啶还原酶(QDHPR，反应5)还原成四氢生物蝶呤。

从酵母细胞表达的酪氨酸羟化酶将酪氨酸转化成L-DOPA。将用携带来自人(hTH2)和大鼠(RnTyrH)的酪氨酸羟化酶的质粒转化的酵母菌株生长在液体培养基中且随后在含有酪氨酸和共底物BH4的缓冲液中溶解。在30℃下孵育6小时之后，通过LC-MS测量溶解产物混合物中的L-DOPA。(A)LC-MS色谱图证实酪氨酸依赖于共底物BH4的存在转化成L-DOPA。(B)+198m/z离子峰的片段化进一步证实溶解产物样品中L-DOPA的存在。(参见例如，Lv等人(2010)LC-MS-MS Simultaneous Determination of L-Dopa and its prodrug n-PentylHydrochloride in Rat Plasma.Chromatographia，72(3/4)，239-243)。

酪氨酸羟化酶与BH4生物合成酶的共表达使酪氨酸能够在酵母细胞溶解产物中转化成L-DOPA。将整合有表达大鼠酪氨酸羟化酶(RnTyrH)和大鼠墨蝶呤还原酶(RnSepR)的构建体的工程化酵母菌株生长在液体培养基中且随后在含有酪氨酸、NADPH和BH4生物合成前体墨蝶呤的缓冲液中溶解。TyrH与BH4生物合成基因的共表达在BH4不存在下、但在BH4前体墨蝶呤存在下提供酪氨酸羟化酶的活性。

从NC合成BIA分子乌药碱和N-甲基乌药碱。通过植物甲基转移酶将NC转化成下游BIA分子延伸微生物BIA合成。这些特定BIA分子仅能够经由NC依赖性生物合成方案合成。

工程化的酵母菌株从液体培养物中的L-DOPA产生NC源性BIA分子。将PpDODC的拷贝整合至工程化的酵母菌株CSY979(如在图9中所述)中，从而提供从L-DOPA产生NC(图A，下色谱图)。接着，将罂粟6-O-甲基转移酶(Ps6OMT)基因的拷贝整合至此酵母菌株中以实现从L-DOPA产生乌药碱(图A，中间色谱图)。最后，将Ps6OMT和罂粟乌药碱-N-甲基转移酶(PsCNMT)基因的拷贝整合至携带PpDODC基因的CSY979酵母菌株中以实现从L-DOPA产生N-甲基乌药碱(图A，上色谱图)。NC和乌药碱测量值两者均匹配来自化学标准品的色谱图。N-甲基乌药碱的产生通过将+300m/z离子峰的片段化模式与公开文献中的模式匹配来进一步证实(图B)。(参见例如，Schmidt等人(2007)Poppy alkaloid profiling by electrospraytandem mass spectrometry and electrospray FT-ICR mass spectrometry after[ring-13C6]-tyramine feeding.Phytochemistry 68(2)：189-202)。

尽管具有随附条款，但本文提出的公开内容也由以下条款限定：

1.一种产生苄基异喹啉生物碱(BIA)前体的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含一种或多种选自由以下组成的组的修饰：

对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变；

对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰；

对所述细胞天然的一种或多种酶中的一个或多个失活突变；以及

编码一种或多种酶的一个或多个异源编码序列；

其中当所述细胞包含编码一种或多种酶的一个或多个异源编码序列时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；对所述细胞天然的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及对所述细胞天然的酶中的失活突变。

2.根据条款1所述的宿主细胞，其中所述BIA前体选自由去甲乌药碱(NC)和全去甲劳丹碱(NL)组成的组。

3.根据条款2所述的宿主细胞，其中所述BIA前体是去甲乌药碱(NC)。

4.根据条款2所述的宿主细胞，其中所述BIA前体是全去甲劳丹碱(NL)。

5.根据条款1所述的宿主细胞，其中当所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因的转录调节修饰；对所述细胞天然的酶中的失活突变；以及编码酶的异源编码序列。

6.根据条款1所述的宿主细胞，其中当所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；对所述细胞天然的酶中的失活突变；以及编码酶的异源编码序列。

7.根据条款1所述的宿主细胞，其中当所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种酶中的一个或多个失活突变时，所述细胞包含至少一种选自由以下组成的组的另外修饰：对所述细胞天然的生物合成酶基因中的反馈抑制减轻突变；对所述细胞天然的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及编码酶的异源编码序列。

8.根据条款1所述的宿主细胞，其中所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制减轻突变。

9.根据条款8所述的宿主细胞，其中所述一种或多种生物合成酶基因编码一种或多种选自3-脱氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合酶和分支酸变位酶的酶。

10.根据条款9所述的宿主细胞，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于选自ARO4和ARO7的生物合成酶基因中。

11.根据条款10所述的宿主细胞，其中所述一个或多个反馈抑制减轻突变存在于所述ARO4基因中。

12.根据条款9所述的宿主细胞，其中所述突变选自所述DAHP的位置229的突变和位置166的突变。

13.根据前述条款中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞过度产生一种或多种BIA前体分子。

14.根据条款13所述的宿主细胞，其中所述一种或多种BIA前体分子选自由以下组成的组：酪氨酸、4-羟基苯乙醛(4-HPA)、L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、3，4-二羟基苯乙醛(3，4-DHPA)以及多巴胺。

15.根据条款14所述的宿主细胞，其中所述一种或多种BIA前体分子是3，4-二羟基苯乙醛(3，4-DHPA)和多巴胺。

16.根据条款14所述的宿主细胞，其中所述一种或多种BIA前体分子是4-羟基苯乙醛(4-HPA)和多巴胺。

17.根据条款1所述的宿主细胞，其中所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰。

18.根据条款17所述的宿主细胞，其中所述转录调节修饰是用强启动子取代所述一种或多种生物合成酶基因的天然启动子。

19.根据条款18所述的宿主细胞，其中所述一种或多种生物合成酶基因选自由ARO10、ARO9和TKL组成的组。

20.根据条款1所述的宿主细胞，其中所述细胞包含对所述细胞天然的一种或多种酶中的一个或多个失活突变。

21.根据条款20所述的宿主细胞，其中所述酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

22.根据条款21所述的宿主细胞，其中所述酶是ZWF1。

23.根据条款20所述的宿主细胞，其中所述细胞包含对所述细胞天然的包含醇脱氢酶活性的一种或多种酶中的一个或多个失活突变。

24.根据条款23所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶选自由ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7以及SFA1组成的组。

25.根据条款20所述的宿主细胞，其中所述细胞包含对所述细胞天然的包含醛氧化还原酶活性的一种或多种酶中的一个或多个失活突变。

26.根据条款25所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶选自由ALD2、ALD3、ALD4、ALD5以及ALD6组成的组。

27.根据条款1所述的宿主细胞，其中所述细胞包含编码一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。

28.根据条款27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含NC合酶活性。

29.根据条款27所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含针对NC合酶或其活性片段的异源编码序列。

30.根据条款29所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶或其活性片段将酪氨酸转化成L-DOPA。

31.根据条款27所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶或其活性片段选自由细菌酪氨酸酶、真核酪氨酸酶和酪氨酸羟化酶组成的组。

32.根据条款27所述的宿主细胞，其中所述细胞包含针对将L-DOPA转化成多巴胺的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。

33.根据条款27所述的宿主细胞，其中所述细胞包含针对将多巴胺转化成3，4-DHPA的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。

34.根据条款33所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶是单胺氧化酶(MAO)。

35.根据条款34所述的宿主细胞，其中所述一个或多个异源编码序列包含在编码天然ARO10的基因组基因座处整合的MAO编码序列。

36.根据条款34所述的宿主细胞，其中所述一个或多个异源编码序列包含可操作地连接至诱导型启动子的MAO编码序列。

37.根据条款36所述的宿主细胞，其中所述诱导型启动子是包含靶向调控所述ARO10基因的启动子的DNA结合蛋白的诱导型系统的一部分。

38.根据条款27所述的宿主细胞，其中所述异源编码序列来自选自由以下组成的组的源生物体：罂粟、黄唐松草和日本黄连。

39.根据条款1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

40.根据条款39所述的宿主细胞，其中所述真核细胞是酵母细胞。

41.根据条款40所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母细胞、粟酒裂殖酵母或毕赤酵母细胞。

42.根据条款41所述的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。

43.一种制备苄基异喹啉生物碱(BIA)的方法，所述方法包括：

培养根据条款1至42中任一项所述的宿主细胞：

将生长原料添加至所述细胞培养物；以及

从所述细胞培养物回收所述BIA。

44.根据条款43所述的方法，其中所述BIA是选自全去甲劳丹碱和去甲乌药碱的BIA前体。

45.根据条款43所述的方法，其还包括将起始化合物添加至所述细胞培养物。

46.根据条款43所述的方法，其还包括产生选自牛心果碱、乌药碱、N-甲基乌药碱和去甲牛心果碱的BIA前体。

47.根据条款43所述的方法，其还包括产生一种或多种阿片化合物。

48.根据条款45所述的方法，其中所述一种或多种阿片化合物选自东罂粟碱、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮以及来自蒂巴因的羟吗啡酮。

49.一种试剂盒，其包括：

根据条款1至42中任一项所述的宿主细胞；以及

一种或多种选自以下的组分：起始化合物、生长原料、异源编码序列、克隆载体、多克隆位点(MCS)、双向启动子、内部核糖体进入位点(IRES)以及细胞培养基。

虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例较详细地描述上述发明，但是对一般技术人员来说容易显而易见的是，根据本发明的教义，可以对其进行某些改变和修改而不脱离附加的权利要求书的精神或范畴。

因此，以上仅仅说明本发明的原理。应了解，本领域的技术人员将能够设想各种安排，虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示，但是它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所引用的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别引用的实施例和条件构成限制。此外，本文中引述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。此外，希望此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发出来的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围并非意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。