同时检测两种或三种MPN致病基因突变的引物组以及包含该引物组的试剂盒

摘要

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及同时检测两种或三种MPN致病基因突变的引物组以及包含该引物组的试剂盒。所述引物组包括两对引物，其中第一对引物为JAK2 V617F‑F和JAK2 V617F‑R，第二对引物为MPL‑F和MPL‑R，所述JAK2 V617F‑F的序列如SEQ ID NO.1所示，所述JAK2 V617F‑R的序列如SEQ ID NO.2所示；所述MPL‑F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述MPL‑R的序列如SEQ ID NO.4所示。本发明的优点在于，通过本发明提供的三对特异性引物或包含该三对特异性引物的试剂盒，可快速、准确地在一个PCR中迅速分辨出待测DNA样品属于JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的哪一种突变。

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种同时检测两种或三种MPN致 病基因突变的引物组以及包含该引物组的试剂盒，具体而言涉及同时检测JAK2 V617F、MPLW515L/K和CALR I/II中的两种或三种基因突变的引物组以及包 含该引物组的试剂盒。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是一类以一系或多系髓系细胞(包括红系、粒系 和巨核系)增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病。主要包括慢性髓系白血 病、真性红细胞增多症(polycythemiavera，PV)、原发性血小板增多症 (essentialthrombocythemia,ET)、原发性骨髓纤维化 (primarymyelofibrosis,PMF)。由于患者血细胞过度增殖，可导致高粘滞血症， 成为各种心脑血管疾病的高危因素。PV及ET的早期危险因素是血栓栓塞性疾 病，主要为心肌梗死和脑梗塞，其次是出血和间歇性跛行；晚期可表现为骨髓 衰竭；10％～20％患者最终转化为急性白血病，多为髓系。

MPN限制性驱动基因包括JAK2、钙网素(calreticulin，CALR)和骨髓增 殖性白血病病毒(myeloproliferativeleukemiavirus，MPL)突变，这三个基因突 变导致不正常地激活JAK2/STAT通路和下游通路，引起血细胞过度增殖。最常 见的突变JAK2V617F激活3种主要髓系细胞因子受体(促红细胞生成素受体， 粒细胞集落刺激因子受体和MPL)，而CALR或MPL突变仅限于活化MPL。

JAK2V617F突变是JAK2基因外显子14上的鸟嘌呤点突变为胸腺嘧啶 (c.1849GNT,GTC→TTC)，使得位于JAK2的JH2第617位的缬氨酸错义编码为 苯丙氨酸。见于95％以上的PV、50～60％的ET和55％～60％的PMF患者(Klampfl T,Gisslinger H,Harutyunyan AS,etal.Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.N Engl JMed.2013；369(25):2379-90.)

MPL515体细胞突变为其第10号外显子上的第515位氨基酸错义编码所致， 最常见的两种突变为W515L和W515K，可见于5％的ET和10％的PMF中 (Vannucchi AM,AntonioliE,Guglielmelli P,et al.Characteristics and clinical correlates of MPL 515WL/Kmutation in essential thrombocythemia.Blood. 2009；112:844–7.)。

CALR突变可见于60％～80％JAK2突变阴性的ET患者以及80％～88％JAK2 和MPL突变阴性的PMF患者，很少出现于PV患者，并极少与JAK2V617F突变共 存。最常见的两种突变分别是外显子9上52个碱基对的缺失(p.L367fs*46，I型) 和5个碱基对的插入(p.K385fs*47，II型)，这两型占所有CALR突变的85％～ 90％(Nangalia J,Massie CE,Baxter EJ,et al.Somatic CALR mutations in myeloproferative neoplasms withnonmutated JAK2.N Engl Med. 2013；369(25):2391-405)。

应用于检测JAK2、CALR和MPL基因突变的技术很多，如等位基因特异 性PCR(allele-specificPCR，AS-PCR)、PCR-限制性片段长度多态性 (PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)、PCR-变性高效液 相色谱、PCR-HRM、数字PCR、Sanger测序法和二代测序等。这些方法大多基 于PCR反应，只是引物设计和产物分析手段存在差异。二代测序、数字PCR 和芯片技术未来将在MPN的分子诊断中发挥越来越大的作用，而PCR-HRM检 测灵敏度可以比拟甚至超过当前的一些SNP突变分析技术，其灵敏度也大大高 于测序，是一种快速、闭管、低成本的PCR扩增后检测技术。因此，急需开发 一种可快速、闭管、低成本检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR突变的 产品。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种可快速、闭 管且低成本同时检测两种或三种MPN致病基因突变的引物组以及包含该引物 组的试剂盒，具体而言涉及同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II 中的两种或三种基因突变的引物组以及包含该引物组的试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：

本发明提供一种同时检测JAK2 V617F和MPL W515L/K基因突变的引物 组，所述引物组包括两对引物，其中第一对引物为JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R，第二对引物为MPL-F和MPL-R，所述JAK2 V617F-F的序列如SEQ ID NO.1所示，所述JAK2 V617F-R的序列如SEQID NO.2所示；所述MPL-F 的序列如SEQ ID NO.3所示，所述MPL-R的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供一种同时检测JAK2 V617F和CALR I/II基因突变的引物组，所 述引物组包括两对引物，其中第一对引物为JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R， 第二对引物为CALR-F和CALR-R，所述JAK2 V617F-F的序列如SEQ ID NO.1 所示，所述JAK2 V617F-R的序列如SEQID NO.2所示，所述CALR-F的序列 如SEQ ID NO.5所示，所述CALR-R的序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供一种同时检测MPL W515L/K和CALR I/II基因突变的引物组， 所述引物组包括两对引物，第一对引物为MPL-F和MPL-R，第二对引物为 CALR-F和CALR-R，所述MPL-F的序列如SEQ ID NO.3所示，所述MPL-R 的序列如SEQ ID NO.4所示，所述CALR-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述 CALR-R的序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II基因 突变的引物组，所述引物组包括三对引物，其中第一对引物为JAK2 V617F-F 和JAK2 V617F-R，第二对引物为MPL-F和MPL-R，第三对引物为CALR-F和 CALR-R，所述JAK2 V617F-F的序列如SEQID NO.1所示，所述JAK2 V617F-R 的序列如SEQ ID NO.2所示；所述MPL-F的序列如SEQ IDNO.3所示，所述 MPL-R的序列如SEQ ID NO.4所示，所述CALR-F的序列如SEQ ID NO.5所示，所述CALR-R的序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供一种同时检测JAK2 V617F和MPL W515L/K基因突变的试剂 盒，包括前述本发明所述的引物组、PCR扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品， 其中阳性质控品为DL17D583和MPL W515L/K的DNA，所述阴性质控品为健 康人的DNA。

本发明提供一种同时检测MPL W515L/K和CALR I/II基因突变的试剂盒， 包括前述本发明所述的引物组、PCR扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，其 中阳性质控品为MPLW515L/K和CALR I/II的DNA，所述阴性质控品为健康 人的DNA。

本发明提供一种同时检测JAK2 V617F和CALR I/II基因突变的试剂盒，包 括前述本发明所述的引物组、PCR扩增试剂、阳性质控品和阴性质控品，其中 阳性质控品为DL17D583和CALR I/II的DNA，所述阴性质控品为健康人的 DNA。

本发明提供一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和/或CALR I/II基 因突变的试剂盒，包括前述本发明所述的引物组、PCR扩增试剂、阳性质控品 和阴性质控品，其中阳性质控品为DL17D583、MPL W515L/K和CALR I/II的 DNA，所述阴性质控品为健康人的DNA。

具体的，上述述的同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中 的两种或三种基因突变的试剂盒，所述PCR扩增试剂为2X HRM PCR Master Mix。

本发明还提供一种上述引物组在制备同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALRI/II中的两种或三种基因突变的试剂盒中的用途。

本发明的有益效果为：

通过本发明提供的三对特异性引物，利用多重PCR-HRM技术，可快速、 准确地在一个PCR中迅速分辨出待测DNA样品属于JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的哪一种突变，利用这三对特异性引物，可应用于制 备同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的两种或三种基因突 变的试剂盒，以便于各种合适场合检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II突变。

附图说明

图1是本发明的实施例4中PCR-HRM的峰图。

图2是本发明的实施例5中PCR-HRM的峰图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

实施例1

本实施例的目的是提供同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II 中的两种或三种的引物组。

依据NCBI上公开的人JAK2 V617F基因突变序列、人MPL W515L/K基因 突变序列和人CALR I/II基因突变序列，根据引物设计原则分别设计三对包含各 自突变位点的引物，第一对引物为JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R，其序列分 别如表1中SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；第二对引物为MPL-F和MPL-R， 其序列分别如表1中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，第三对引物为CALR-F 和CALR-R，其序列分别如表1中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。将设计 的三对特异性引物送至Invitrogen公司进行基因合成，分别得到JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R、MPL-F和MPL-R以及CALR-F和CALR-R，对所得到的JAK2 V617F-F和JAK2V617F-R、MPL-F和MPL-R以及CALR-F和CALR-R进行基 因测序验证确认。

表1

实施例2

本实施例目的是提供一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的两种或三种基因突变的试剂盒。

一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的两种或三种 基因突变的试剂盒，包括JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R、MPL-F和MPL-R 以及CALR-F和CALR-R、2XHRM PCR Master Mix、阳性质控品和阴性质控 品，其中阳性质控品为DL17D583、MPLW515L/K和CALR I/II的DNA，所述 阴性质控品为健康人的DNA。

DL17D583为临床收集，MPL W515L/K为Invitrogen公司根据人MPL W515L/K基因突变序列合成，CALR I/II的DNA为Invitrogen公司根据人CALR I/II基因突变序列合成。

任意选择两对引物及其对应的阳性质控品，即可作为同时检测两个基因突 变的试剂盒，选择三对引物及其对应的阳性质控品，即可作为同时检测三个基 因同时突变的试剂盒。

实施例3

本实施例目的是验证一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的两种或三种基因突变的试剂盒的准确性，采用单管PCR-HRM技术，单 独验证每一对引物是否可以灵敏分辨出其野生型和突变型样本。

1、DNA样品的制备：JAK2 V617F突变标本为临床收集(DL17D583)，采 用Lab-Aid820核酸提取仪，搭配Lab-Aid核酸(DNA)分离试剂盒(厦门致善生 物科技股份有限公司)进行全血DNA提取，将所得DNA核酸浓度控制在20～ 40ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0，置-80℃低温冷冻冰箱冻存；MPL W515L/K， CALR I型突变(c1092-1143del)，II型突变(c1154-1155ins)由Invitrogen公司依据 NCBI上公开的人MPL W515L/K基因突变序列和人CALR I/II基因突变序列合 成，冻存于质粒及含相应质粒的甘油菌中，按照质粒提取试剂盒操作步骤提取 质粒DNA，使质粒DNA核酸浓度控制在20～40ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0， 置-80℃低温冷冻冰箱冻存。

2、配制特异性引物：

将按照实施例1中设计并验证的引物JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R、 MPL-F和MPL-R以及CALR-F和CALR-R用双蒸水稀释至0.3μM/L。

3、配制PCR反应液：

取8只PCR反应管，编号依次为1～8号PCR反应管，按下表2中所示加样量在 每个PCR反应管中均分别加入各组分试剂，其中1～8号PCR反应管中的待测DNA 样品如表3所示，1～8号PCR反应管中依次加入JAK2 V617F野生型的DNA、JAK2 V617F突变型的DNA、CALR I型突变的DNA、CALR II型突变的DNA、CALR野 生型的DNA、MPL W515K型突变的DNA、MPL W515L型突变的DNA和MPL野 生型的DNA。使每管PCR反应液终体积为25μL。该实施例中JAK2V617F、MPL 和CALR分别代表JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R、MPL-F和MPL-R以及 CALR-F和CALR-R。

表2

表3

4、PCR反应

将上述配制好的PCR反应液离心混匀，按如下条件进行PCR反应：95℃ 预变性5min；95℃变性10s，一定温度退火30s，72℃延伸20s，共45个循环； 72℃延伸5min。各个引物单独PCR的退火温度如表1中所示。

PCR扩增完成后，采用HR-1高检测率熔解曲线分析系统(Idaho Technology， USA)进行HRM，配合使用PCR毛细管(大菱公司)。HRM体系：15μl扩增产 物，以10μl石蜡油(Sigma，USA)封闭，熔解曲线荧光信号收集温度设定为65℃～ 98℃，0.5℃/s。所得各解链曲线使用配套软件HR-1anaysis tool进行分析。

5、检测

各基因单独PCR检测结果如图1所示，图中标号为1～8的曲线分别表示， JAK2V617F引物检测JAK2 V617F野生型的DNA的熔解峰、JAK2 V617F引物检 测JAK2 V617F突变型的DNA的熔解峰、CALR引物检测CALR I型突变的DNA 的熔解峰、CALR引物检测CALR II型突变的DNA的熔解峰、CALR引物检测 CALR野生型的DNA的熔解峰、MPL引物检测MPL W515K型突变的DNA的熔 解峰、MPL引物检测MPL W515L型突变的DNA的熔解峰和MPL引物检测MPL 野生型的DNA的熔解峰。

由图1可见JAK2 V617F野生型与突变型之间熔解温度相差1.5℃左右， CALR野生型分别与I型、II型突变峰熔解温度相差2℃和0.2℃左右，MPL野生型 与突变型熔解温度相差1℃左右，两突变型之间相差0.1℃左右，表明各基因的 野生型和突变型可以分开，即通过这三对引物可分别鉴别出三个基因的野生型 和突变型。

实施例4

本实施例目的是验证一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的两种或三种基因突变的试剂盒的准确性。即验证三对引物在引物反应终 浓度为0.3μM/L，退火温度为55℃时，是否可以灵敏分辨出三种不同基因的突变 及同一种基因的其野生型和突变型样本。

1、DNA样品的制备：JAK2 V617F突变标本为临床收集(DL17D583)，采 用Lab-Aid820核酸提取仪，搭配Lab-Aid核酸(DNA)分离试剂盒(厦门致善生 物科技股份有限公司)进行全血DNA提取，将所得DNA核酸浓度控制在20～ 40ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0，置-80℃低温冷冻冰箱冻存；MPL W515L/K， CALRI型突变(c1092-1143del)，II型突变(c1154-1155ins)由Invitrogen公司依据 NCBI上公开的人MPL W515L/K基因突变序列和人CALR I/II基因突变序列合 成，冻存于质粒及含相应质粒的甘油菌中，按照质粒提取试剂盒操作步骤提取 质粒DNA，使质粒DNA核酸浓度控制在20～40ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0， 置-80℃低温冷冻冰箱冻存；

2、制备特异性引物：

将按照实施例1中设计并验证的引物JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R、 MPL-F和MPL-R以及CALR-F和CALR-R用双蒸水稀释至0.3μM/L。

3、配制PCR反应液：

取1只PCR反应管，按表4中所示加样量在该PCR反应管中三对引物及其他 试剂。其中DNA样品包括JAK2 V617F野生型的DNA、JAK2 V617F突变型的 DNA、CALR I型突变的DNA、CALR II型突变的DNA、CALR野生型的DNA、 MPL W515K型突变的DNA、MPL W515L型突变的DNA和MPL野生型的DNA。 2X HRM PCR Master Mix和引物的加样量一定，调整双蒸水的加样量将PCR反 应液总体积控制在25μL。该实施例中JAK2 V617F、MPL和CALR分别代表JAK2V617F-F和JAK2 V617F-R、MPL-F和MPL-R以及CALR-F和CALR-R。

表4

4、PCR反应

将上述配制好的PCR反应液离心混匀，按如下条件进行PCR反应：95℃ 预变性5min；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，共45个循环；72℃ 延伸5min。

PCR扩增完成后，采用HR-1高检测率熔解曲线分析系统(Idaho Technology， USA)进行HRM，配合使用PCR毛细管(大菱公司)。HRM体系：15μl扩增产 物，以10μl石蜡油(Sigma，USA)封闭，熔解曲线荧光信号收集温度设定为65℃～ 98℃，0.5℃/s。所得各解链曲线使用配套软件HR-1anaysis tool进行分析。

5、检测

多重PCR-HRM结果如图1所示，图中黄色曲线表示，存在三个不同的峰值， 标号为1的是JAK2 V617的峰，表明JAK2 V617的溶解温度在78℃附近，标号为2 的是CALR的峰，表明CALR的溶解温度在82℃附近，标号为3的是MPL的峰， 表明MPL的溶解温度在90℃附近，由于三个基因的引物的溶解温度差异均在4℃ 以上，表明三对引物在一管多种PCR-HRM体系中可完全被分开，说明该试剂盒 的检测结果准确可靠。

当需要检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II的任意两种基因突变 时，配制PCR反应液时，加入对应的两对引物，即可制同时检测两个基因突变； 当需要检测JAK2V617F、MPL W515L/K和CALR I/II三种基因突变时，配制PCR 反应液时，加入三对引物，即可制同时检测三个基因突变，DNA样品和2X HRM PCR Master Mix的加样量一定，将PCR反应液总体积控制在25μL，当引物加样 量减少时，增加双蒸水的加样量，当引物加样量增多时，减少双蒸水的加样量。

实施例5

本实施例目的是验证一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的两种或三种基因突变的试剂盒的准确性。即验证三对引物在引物反应终 浓度为0.4μM/L，退火温度为55℃时，是否可以灵敏分辨出三种不同基因的突变 及同一种基因的其野生型和突变型样本。

1、DNA样品的制备：JAK2 V617F突变标本为临床收集(DL17D583)，采 用Lab-Aid820核酸提取仪，搭配Lab-Aid核酸(DNA)分离试剂盒(厦门致善生 物科技股份有限公司)进行全血DNA提取，将所得DNA核酸浓度控制在20～ 40ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0，置-80℃低温冷冻冰箱冻存；MPL W515L/K， CALRI型突变(c1092-1143del)，II型突变(c1154-1155ins)由Invitrogen公司依据 NCBI上公开的人MPL W515L/K基因突变序列和人CALR I/II基因突变序列合 成，冻存于质粒及含相应质粒的甘油菌中，按照质粒提取试剂盒操作步骤提取 质粒DNA，使质粒DNA核酸浓度控制在20～40ng/μl，OD260/280介于1.8-2.0， 置-80℃低温冷冻冰箱冻存；

2、制备特异性引物：

将按照实施例1中设计并验证的引物JAK2 V617F-F和JAK2 V617F-R、 MPL-F和MPL-R以及CALR-F和CALR-R用双蒸水稀释至0.3μM/L。

3、配制PCR反应液：

取1只PCR反应管，按表5中所示加样量在每个PCR反应管中均分别加入各 组分试剂。其中DNA样品包括JAK2 V617F野生型的DNA、JAK2 V617F突变型 的DNA、CALR I型突变的DNA、CALR II型突变的DNA、CALR野生型的DNA、 MPL W515K型突变的DNA、MPL W515L型突变的DNA和MPL野生型的DNA。 2X HRM PCR Master Mix和引物的加样量一定，调整双蒸水的加样量将PCR反 应液总体积控制在25μL。该实施例中JAK2 V617F、MPL和CALR分别代表JAK2V617F-F和JAK2 V617F-R、MPL-F和MPL-R以及CALR-F和CALR-R。

表5

4、PCR反应

将上述配制好的PCR反应液离心混匀，按如下条件进行PCR反应：95℃ 预变性5min；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，共45个循环；72℃ 延伸5min。

PCR扩增完成后，采用HR-1高检测率熔解曲线分析系统(Idaho Technology， USA)进行HRM，配合使用PCR毛细管(大菱公司)。HRM体系：15μl扩增产 物，以10μl石蜡油(Sigma，USA)封闭，熔解曲线荧光信号收集温度设定为65℃～ 98℃，0.5℃/s。所得各解链曲线使用配套软件HR-1anaysis tool进行分析。

5、检测

多重PCR-HRM结果如图2所示，图中紫红色曲线表示，存在三个不同的峰 值，标号为1的是JAK2 V617的峰，表明JAK2 V617的溶解温度在78℃附近，标 号为2的是CALR的峰，表明CALR的溶解温度在82℃附近，标号为3的是MPL的 峰，表明MPL的溶解温度在90℃附近，由于三个基因的引物的溶解温度差异均 在4℃以上，表明三对引物在一管多种PCR-HRM体系中可完全被分开，说明该 试剂盒的检测结果准确可靠。

当需要检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II的任意两种基因突变 时，配制PCR反应液时，加入对应的两对引物，即可制同时检测两个基因突变； 当需要检测JAK2V617F、MPL W515L/K和CALR I/II三种基因突变时，配制PCR 反应液时，加入三对引物，即可制同时检测三个基因突变，DNA样品和2X HRM PCR Master Mix的加样量一定，将PCR反应液总体积控制在25μL，当引物加样 量减少时，增加双蒸水的加样量，当引物加样量增多时，减少双蒸水的加样量。

效果例1

本效果例的目的是提供一种同时检测JAK2 V617F、MPL W515L/K和CALR I/II中的两种或三种基因突变的试剂盒的检测结果。

1、制备待测DNA：收集拟诊MPN患者的EDTA抗凝血，采用Lab-Aid 820 核酸提取仪，搭配Lab-Aid核酸(DNA)分离试剂盒(厦门致善生物科技股份有 限公司)进行全血DNA提取，将所得DNA核酸浓度控制在20～40ng/μl， OD260/280介于1.8-2.0，置-80℃低温冷冻冰箱冻存。

2、配制PCR反应液：

取2只PCR反应管，编号为1和2，按表4或表5中所示加样量在每个PCR反应 管中均分别加入各组分试剂，每个PCR管中均加入三对引物。其中编号为1的 PCR中加入的DNA样品包括JAK2 V617F野生型的DNA、JAK2 V617F突变型的 DNA、CALR I型突变的DNA、CALR II型突变的DNA、CALR野生型的DNA、 MPL W515K型突变的DNA、MPL W515L型突变的DNA和MPL野生型的DNA， 编号为2的PCR中加入的DNA样品为待测DNA。2X HRM PCR Master Mix和引物 的加样量一定，调整双蒸水的加样量将PCR反应液总体积控制在25μL。

4、PCR反应

将上述配制好的PCR反应液离心混匀，按如下条件进行PCR反应：95℃ 预变性5min；95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，共45个循环；72℃ 延伸5min。

PCR扩增完成后，采用HR-1高检测率熔解曲线分析系统(Idaho Technology， USA)进行HRM，配合使用PCR毛细管(大菱公司)。HRM体系：15μl扩增产 物，以10μl石蜡油(Sigma，USA)封闭，熔解曲线荧光信号收集温度设定为65℃～ 98℃，0.5℃/s。所得各解链曲线使用配套软件HR-1anaysis tool进行分析。

5、检测

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出 其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限 制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于 解释权利要求书。

序列表

<110> 李建新

<120> 同时检测两种或三种MPN致病基因突变的引物组以及包含该引物组的试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人-JAK2 V617F-F(Homo sapiens)

<400> 1

aagcagcaag tatgatgagc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人-JAK2 V617F-R(Homo sapiens)

<400> 4

agaaaggcat tagaaagcct gta 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人-MPL-F(Homo sapiens)

<400> 4

tctcctagcc tggatctcct t 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人-MPL-R(Homo sapiens)

<400> 4

cagagcgaac caagaatgc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人-CALR-F(Homo sapiens)

<400> 5

ggcagcagag aaacaaatga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人-CALR-R(Homo sapiens)

<400> 6

cttcctcctt gtcctcctca 20