基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法

摘要

本发明开发了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶的快检新方法，在免疫层析试纸条底板上依次搭接粘贴滤纸、样本垫、喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，制成免疫层析试纸条，然后在离心管底固定Fe3O4@PDA@Pd/Pt标记抗体复合物，通过磁分离富集目标物，之后以试纸条定量检测样本中的待测物浓度，该方法可超灵敏检测待检物，同时减少样品基质的干扰。

说明书

技术领域

本发明属于医学检验和食品安全检测领域，具体涉及一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶(Fe

背景技术

免疫层析技术是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法，具有检测速度快、特异性好、操作简单和费用低等优点，相比于其它方法更能满足现场大批量检测的需求，因此近年来发展迅猛，被广泛应用于食品安全、医学检验和环境污染物监测等领域。其中胶体金免疫层析试纸条是应用最广泛的一种免疫层析产品，但其灵敏度较差且易受基质干扰。因此近年来的免疫层析技术主要有三个发展方向：一是采用免疫磁分离富集技术从复杂基质中分离浓缩目标物以避免样品基质的干扰；二是通过信号放大系统(如生物素-链霉亲和素系统等)以提高免疫层析方法的灵敏度；三是采用新型标记物(如荧光微球)，提高信号输出或转变信号输出类型，以达到提高灵敏度的目的。

纳米酶是一类具有酶催化性质的纳米材料，例如贵金属纳米材料、金属氧化物和碳基材料等。相比于传统生物酶，其具备超高的稳定性及酶催化活性，因而广泛应用于临床诊断、生物成像及生物传感器领域。经典的金属纳米酶往往以单一金属组成，例如铂纳米酶和钯纳米酶等，之后又发展了一系列的以碳基材料作为载体的铂碳、钯碳等。近期研究发现，基于双金属协同效应，可大大提高纳米酶的催化活性。

基质效应是影响实际检测准确性的重要因素。磁分离技术是一种通过免疫磁珠捕获目标物，在外加磁场下磁分离后再分散于一定体积的PBS中的样本前处理方法。通过该技术可以同时达到减弱基质效应和富集目标物的目的。

基于上述情况，发明人通过一锅法合成了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶(Fe

发明内容

本发明的一个目的是提供一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶Fe

本发明的另一个目的是提供预固定Fe

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明提供了一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶Fe

(1)Fe

(2)Fe

(3)预固定Fe

进一步的，所述预固定Fe

进一步的，步骤(2)中所述Fe

进一步的，本发明的硝酸纤维素膜上包被有待测物人工偶联抗原或待测物抗体作为检测线，包被有抗鼠抗体或抗兔抗体(二抗)作为质控线；其中，该硝酸纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：

(1)使用0.01～0.5M pH 6.0～8.0的PBS(磷酸盐缓冲溶液)溶液分别调节包被物待测物人工偶联抗原或待测物抗体、抗鼠抗体或抗兔抗体至浓度为0.01～10.0mg/mL；

(2)将调整浓度后的待测物人工偶联抗原或待测物抗体喷涂于硝酸纤维素膜上部，作为检测线，将抗鼠抗体或抗兔抗体喷涂于硝酸纤维素膜下部，作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷量均为0.25～0.74μL/cm；

(3)将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37℃过夜烘干处理后，在室温干燥的环境下保存备用。

进一步的，所述的待测物人工偶联抗原是指小分子待测物与大分子蛋白质通过化学偶联方法制备的具有免疫原性和反应原性的全抗原；其中，所述的小分子待测物涵盖医学检验领域和食品安全检测领域所需要检测的所有小分子物质；所述的偶联方法包括重氮法、碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法、琥珀酸酐法；所述的偶联大分子蛋白包括牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白；所述的偶联比为1:5～1:200，偶联后透析纯化，得到所需的人工偶联抗原。

进一步的，所诉待测物抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体。

进一步的，所述的免疫层析试纸条的组装，包括以下步骤：

(1)在底板上搭接粘贴下述材料：滤纸、样本垫、喷涂有待测物偶联人工抗原或抗体作为检测线和抗鼠抗体/抗兔抗体作为质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，即组装成本发明使用的免疫层析试纸条大板。

(2)组装好的试纸条大板，通过切刀切成需要的宽度，即成本发明使用的免疫层析试纸条，该试纸条可以直接使用，也可以装入塑料卡壳中使用。

本发明提供的一种基于聚多巴胺介导的磁性双金属纳米酶Fe

经过处理后的检测样本加样到本发明制备的免疫层析试纸条，加样体积为50～200μL/条，反应时间为3～20分钟，之后，在试纸条上滴加10～100μL萘乙酸/二氨基联苯胺(CN/DAB，5.5mM)显色液，避光显色1～5min，可以通过读取该试纸条上检测线和质控线的灰度数据，内置标准曲线计算检测样本浓度来实现定量检测，也可以通过肉眼观察检测线和质控线有无显色条带来实现定性判断。

本发明的有益效果是：

本发明制备的免疫层析试纸条首次以Fe

附图说明

图1是基于Fe

图2为合成的Fe

图3为基于Fe

图4为基于Fe

如图1所示，Fe

如图3和4所示，加入CN/DAB显色液后显色强度大大强于直接显色结果，可以大大提高检测方法灵敏度。

具体实施方式

实施例1：Fe

一、Fe

二、Fe

实施例2：一种使用Fe

一、免疫层析试纸条的制备工艺

1.硝酸纤维素膜的制备；

抗HCG多抗和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.4的PBS稀释抗HCG多抗的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用。

2.Fe

取0.5mg Fe

3.组装试纸条：

(1)滤纸和样本垫规格为1×30cm；

(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；

(3)吸水纸，规格为1.2×30cm；

(4)PVC底板，规格为5.5×30cm。

将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。

二、定量检测样本中的HCG

用上述的免疫层析试纸条检测样本中HCG的方法，包括如下的步骤：

1.在试纸条加样孔中加入人血清样本100μL，反应15min，再加入50μL CN/DAB(5.5mM)，避光反应2min；

2.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中HCG的含量，实现样本中HCG的定量检测。

3.建立标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中HCG浓度为：0、1、2、4、6、8、10、15、20、50mIU/mL，R

实施例3：一种使用Fe

一、免疫层析试纸条的制备工艺

1.硝酸纤维素膜的制备；

⑴制备ZEN人工抗原(ZEN-BSA)：

偶联方法为混合酸酐法，偶联蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，偶联比为1:100，偶联后透析纯化，得到ZEN-BSA。

⑵检测线和质控线的制备：

ZEN-BSA偶联物和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.4的PBS稀释ZEN-BSA偶联物的浓度为6mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。

2.Fe

取0.5mg Fe

3.组装试纸条：

(1)滤纸和样本垫规格为1×30cm；

(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；

(3)吸水纸，规格为1.2×30cm；

(4)PVC底板，规格为5.5×30cm。

将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。

二、定量检测样本中的ZEN

用上述的免疫层析试纸条检测样本中ZEN的方法，包括如下的步骤：

1.称取饲料或粮食样本2g，加入10mL提取液后震荡1分钟，取上清液检测；

2.在试纸条加样孔中加入110μL样本，反应5min，再加入50μL CN/DAB(5.5mM)，避光反应2min；

3.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中ZEN的含量，实现阳性样本的定量检测。

4.建立标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中ZEN浓度为：0、0.5、1、2、4、8ppb，计算R

实施例4：一种使用Fe

一、免疫层析试纸条的制备工艺

1.硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：

HBsAg多克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.4的PBS稀释HBsAg多克隆抗体的浓度为2mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为质控线，两线的喷膜量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。

2.Fe

取0.5mg Fe

3.组装试纸条：

(1)滤纸和样本垫规格为1×30cm；

(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；

(3)吸水纸，规格为1.2×30cm；

(4)PVC底板，规格为5.5×30cm。

将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。

二、定量检测样本中的HBsAg

用上述的免疫层析试纸条检测样本中HBsAg的方法，包括如下的步骤：

1.在试纸条加样孔中加入人血清样本100μL，反应20min，再加入50μL CN/DAB(5.5mM)，避光反应2min；

2.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中HBsAg的含量，实现样本中HBsAg的定量检测。

3.调节标准曲线：在阴性基质中加标，加标标准曲线中HBsAg浓度为：0、10、20、40、80、160ppb，计算R

实施例5：一种使用Fe

一、免疫层析试纸条的制备工艺

1.硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：

大肠杆菌O157:H7多克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH7.5的PBS稀释O157:H7多克隆抗体的浓度为2mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为质控线，两线的喷量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。

2.Fe

取0.5mgFe

3.组装试纸条：

(1)滤纸和样本垫规格为1×30cm；

(2)喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；

(3)吸水纸，规格为1.2×30cm；

(4)PVC底板，规格为5.5×30cm。

将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。

二、定量检测样本中的大肠杆菌O157:H7

用上述的免疫层析试纸条检测样本中大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下的步骤：

1.样本前处理：样本按照国标方法进行增菌培养，培养后检测；

2.在试纸条加样孔中加入110μL样本，反应5min，再加入50μL CN/DAB(5.5mM)，避光反应2min；

3.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中大肠杆菌O157:H7的含量，实现样本的定量检测。

4.调节标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中大肠杆菌O157:H7浓度为：0、10

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。