通过肺球体细胞分泌因子的吸入来进行治疗性肺修复

摘要

特发性肺纤维化(IPF)是目前最致命的特发性间质性肺病，其中持续的肺损伤导致疤痕组织形成。提供了用于治疗肺疾病(如纤维化)的方法和组合物。肺球体细胞来源的条件培养基(LSC‑CM)和外泌体(LSC‑EXO)用于治疗不同的肺损伤模型。用LSC‑CM和LSC‑EXO来源的组合物进行吸入治疗可以减轻和/或逆转博来霉素诱导的和二氧化硅诱导的纤维化，重建正常的肺泡结构并减少细胞外基质积聚。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月29日提交的美国临时申请62/691,811的优先权和权益，该临时申请题为“通过肺球体细胞分泌因子的吸入来进行治疗性肺修复”，其全部公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及治疗对干细胞来源的分泌蛋白质组或其部分有响应的肺部病理状况的方法。

背景技术

整个人体及其所有器官都覆盖着一层上皮细胞保护层。肺中的上皮细胞不仅促进氧气交换，而且防止每天持续接触吸入的刺激物和毒素。幸运的是，由于驻留的干细胞和祖细胞群对于维持组织稳态和响应于急性和/或慢性肺损伤的修复至关重要，因此肺具有进行兼性再生的能力。

然而，与呼吸相关的发病率和死亡率正在上升。一些慢性肺损伤与环境因素或生活方式选择(如吸烟)有关。特发性肺纤维化(IPF)是一种进行性和致命性的间质性肺病，其特征为成纤维细胞灶，肺泡蜂窝状和持续性、不间断的纤维化，最终导致肺结构的破坏和最终完全的呼吸衰竭。由于IPF的确切病理机制和病因不明，该病预后不良。IPF的治疗选择仍然很少。迄今为止，美国食品和药物管理局(FDA)批准的疗法只有两种，吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(nintedanib)，然而这些疗法只是治标不治本，只能延缓疾病进展。它们不能阻止或逆转已经形成的纤维化。

随着新的治疗策略的不断发展，基于细胞的治疗已经成为一种有前途的选择，利用干细胞进行了多项临床试验。虽然干细胞具有有益的效应，但其临床应用面临许多挑战，包括大量的劳动力、高成本和安全问题。基于细胞的疗法具有一定的致瘤性和免疫原性风险，以及细胞稳定性问题，因为干细胞和祖细胞在长期体外细胞培养期间都具有固有的转化风险。此外，细胞疗法产品在临床应用前需要仔细保存和处理。越来越多的证据表明，成体干细胞的再生能力主要是由于它们的旁分泌活性。因此，利用干细胞分泌蛋白质组或干细胞条件培养基(CM)代替实际细胞不仅可以减轻这些限制，而且可以保留基于细胞的疗法的再生益处。

发明内容

本公开的一个方面包括药物组合物的实施方案，所述药物组合物包含肺球体细胞条件培养基或肺球体细胞分泌的治疗剂，或肺球体细胞来源的外泌体群，其量在递送至需要其的动物或人类受试者时可有效调节肺部病理状况。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述肺部病理状况是肺部肺纤维化。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，并且其中所述分离的多肽、分离的肽或分离的核酸由培养的肺球体细胞分泌。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含从肺球体细胞条件培养基中分离的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述核酸可以是miRNA。

在本公开这一方面的一些实施方案中，施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以是通过在其中培养肺球体细胞群而产生的冻干条件细胞培养基。

在本公开这一方面的一些实施方案中，通过雾化器施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可以是冻干粉。

本公开的另一方面包括生产药物组合物的方法的实施方案，所述药物组合物包含肺球体细胞条件培养基或肺球体细胞分泌的治疗剂，或肺球体细胞来源的外泌体群，所述方法包括以下步骤：(a)从动物或人类受试者的肺组织获得分离的肺干细胞群；(b)通过在细胞培养基中培养分离的干细胞群来产生条件细胞培养基；和(c)从条件培养基中除去培养的细胞。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括分离条件细胞培养基中的以下中的至少一种的步骤：(a)由培养的肺球体细胞分泌到条件细胞培养基中的分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，或者(b)由培养的肺球体细胞群产生到条件细胞培养基中的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括冻干条件培养基的步骤。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括冻干以下中的至少一种的步骤：(a)由培养的肺球体细胞分泌到条件细胞培养基中的分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，或者(b)由培养的肺球体细胞群产生到条件细胞培养基中的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法的冻干产品可以与药学上可接受的介质结合。

本公开的又一方面包括治疗动物或人肺系统的病理状况的方法的实施方案，其中所述方法包括向动物或人受试者的呼吸道区域施用药物组合物，所述药物组合物包含肺球体细胞条件培养基或肺球体细胞分泌的治疗剂，或肺球体细胞来源的外泌体群，其量在递送至有需要的动物或人受试者时可有效调节肺部病理状况。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述肺部病理状况是肺纤维化。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，并且其中所述分离的多肽、分离的肽或分离的核酸由培养的肺球体细胞分泌。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含从肺球体细胞条件培养基中分离的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述核酸可以是miRNA。

在本公开这一方面的一些实施方案中，施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以是通过在其中培养肺球体细胞群而产生的冻干条件细胞培养基。

在本公开这一方面的一些实施方案中，通过雾化器施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可以是冻干粉。

附图说明

当结合附图阅读下文描述的本公开的各种实施方案的详细描述时，将更容易理解本公开的其他方面。

图1A-1I示出了干细胞条件培养基逆转由慢性博来霉素损伤引起的肺泡上皮细胞损伤。

图1A示出了条件培养基程序示意图和实验研究示意图；n＝6-7只/组。

图1B示出了在研究终点移植肺的宏观视图。

图1C和1D示出了每个治疗组凋亡细胞的代表性Tunel染色(图1C)和Tunel阳性细胞百分比的定量(图1D)；比例尺＝100μm

图1E示出了代表性的H&E染色。顶部:比例尺＝500μm底部:比例尺＝200μm。

图1F示出了用Ashcroft评分量化纤维化；

图1G示出了代表性的Gomori三色染色肌纤维、胶原、细胞核和红细胞。比例尺＝1000μm。

图1H示出了I型和III型胶原的代表性的天狼猩红染色。比例尺＝50μm。

图1I示出了肺羟脯氨酸水平的定量；

图2A-2G示出了LSC-CM吸入治疗促进肺泡修复。

图2A示出了对于von Willebrand因子(vWF)，前表面活性蛋白C(Pro-SPC)和水通道蛋白5(AQP5)的肺切片的代表性免疫染色。比例尺＝100μm。

图2B-2D示出了vWF+(图2B)，ProSPC+(图2C)和AQP5+(图2D)的百分比像素强度的量化。

图2E-2F示出了α平滑肌肌动蛋白(αSMA)(图2E)、基质金属蛋白酶2(MMP2)(图2F)和GAPDH加载对照(蛋白质水平相应定量为假处理对照的倍数)的蛋白质印迹分析；

图2G示出了具有相对强度定量的代表性细胞因子阵列；与假处理对照相比，

图3A-3K示出了二氧化硅损伤后小鼠的肺修复和纤维化。

图3A示出了在A/J小鼠中二氧化硅诱导的纤维化研究的实验研究示意图；n＝10只/组。

图3B示出了每个治疗组凋亡细胞的代表性Tunel染色和Tunel阳性细胞百分比的定量；比例尺＝50μm；每个点代表一只动物的数据；n＝5。

图3C示出了代表性的H&E染色。比例尺＝100μm

图3D示出了用Ashcroft评分量化纤维化；

图3E示出了肌纤维、胶原、细胞核和红细胞的Gomori三色染色。比例尺＝100μm。

图3F示出了I型和III型胶原的天狼猩红染色。比例尺＝100μm。

图3G示出了肺羟脯氨酸水平的定量；

图3H示出了针对水通道蛋白5(AQP5)、前表面活性蛋白C(Pro-SPC)和vonWillebrand因子(vWF)的肺切片的代表性免疫染色。比例尺＝50μm。

图3I-3K示出了AQP5+(图3I)，ProSPC+(图3J)，和vWF+(图3K)的百分比像素强度的量化。

图4A-4D示出了LSC-CM的蛋白质组学分析。

图4A示出了在三种LSC-CM中鉴定的蛋白质的维恩图。

图4B示出了在所有三种LSC-CM中所有常见蛋白质的蛋白质亚细胞定位的饼图。

图4C示出了在所有三种LSC-CM中鉴定的103种细胞外蛋白质中的20种的相对丰度。

图4D示出了与共享的细胞外蛋白质相关的生物过程的基因本体饼图。

图5A-5L示出了外泌体吸入疗法在大鼠Bleo损伤后的治疗潜力。

图5A示出了通过NTA NanoSight对新鲜和冷冻的外泌体颗粒的尺寸分析。

图5B示出了LSC-EXO的代表性透射电子显微照片(TEM)。左比例尺＝0.2μm。右比例尺＝50nm。

图5C示出了在LSC-EXO和MSC-EXO中的CD63、CD81和GAPDH蛋白的蛋白质印迹分析。

图5D示出了在SD大鼠中进行的外泌体研究的实验研究示意图；n＝12只/组。

图5E示出了代表性的H&E染色(顶部:比例尺＝100μm底部:比例尺＝50μm)和Gomori三色染色。比例尺＝100μm(底部)；肌肉纤维、胶原、细胞核和红细胞。

图5F示出了用Ashcroft评分量化纤维化；比例尺＝μm

图5G示出了肺羟脯氨酸水平的定量；

图5H示出了I型和III型胶原的代表性的天狼猩红染色；比例尺＝50μm。

图5I示出了基质金属蛋白酶2(MMP2)、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、SMAD3和GAPDH加载对照的蛋白质印迹分析。

图5J示出了针对水通道蛋白5(AQP5)、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和von Willebrand因子(vWF)的肺切片的代表性免疫染色。比例尺＝75μm。

图5K示出了AQP5和vWF的像素强度的量化。

图5L示出了αSMA的像素强度的量化；

图6A-6L示出了外泌体治疗改善了Bleo后的肺功能和外泌体miRNA分析。

图6A示出了检测来自血清的19种大鼠蛋白的代表性大鼠细胞因子阵列。PBS组

图6B示出了肺功能测量的示意图。

图6C-6G示出了肺功能测量的量化；

图6H示出了用力呼气量(FEV)与用力肺活量(FVC)之比。

图6I示出了LSC-外泌体和MSC-外泌体miRNA含量的主成分分析图。

图6J示出了LSC-外泌体和MSC-外泌体miRNA含量的差异表达的miRNA的火山(Volcano)图。

图6K示出了在LSC-外泌体(顶部)和MSC-外泌体(底部)中的前10个miRNA的分布。

图7A-7C示出了在条件培养基的三种不同培养的肺球体干细胞分泌蛋白质组中发现的蛋白质。

图8示出了在三种培养的肺球体细胞系群体的条件培养基中发现的miRNA的身份。

图9示出了从两种培养的间充质干细胞系群体的条件培养基中发现的miRNA的身份。

图10示出了将肺球体细胞条件培养基递送至博来霉素处理的小鼠后体重的变化。

图11示出了将标记有亚甲蓝染料的雾化液体递送至小鼠肺部的雾化功效的确认。

图12示出了一系列图表，其表明条件培养基或外泌体治疗没有改变肾脏和肝脏功能。

图13示出了在Bleo和二氧化硅研究中对治疗动物器官的组织学分析，该分析未显示由于暴露于条件培养基或源自肺球体细胞的外泌体而导致的损伤或毒性。

图14示出了一系列饼图，其表明来源于三种肺球体细胞群的外泌体中miRNA种类的分布。

图15示出了一系列饼图，其表明来源于两种间充质干细胞群的外泌体中miRNA种类的分布。

具体实施方式

在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不是为了限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求来限制。

在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限以及该范围内的任何其他规定值或中间值之间的每一个中间值，直到下限单位的十分之一，都包含在本公开中，除非上下文另有明确规定。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包含在本公开内容中，受制于所述范围中的任何具体排除的限制。在所述范围包括一个或两个极限的情况下，排除那些包括的极限中的一个或两个的范围也包括在本公开中。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本公开的实践或试验中也可以使用类似于或等同于本文所描述的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利并入本文作为参考，就好像每个单独的出版物或专利被特别地和单独地指出通过参考并入，并且并入本文作为参考以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用均是为了其在申请日之前的公开内容，而不应解释为承认本公开内容无权凭借在先公开内容而早于该出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，这可能需要单独确认。

对于本领域技术人员来说，在阅读本公开内容后，显而易见的是，本文描述和示出的每个单独实施方案都具有分立的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与其他几个实施方案中的任何一个的特征分离或组合，而不脱离本公开内容的范围或精神。任何列举的方法可以按照列举的事件的顺序或者逻辑上可能的任何其他顺序来执行。

除非另有说明，本公开的实施方案将采用本领域技术范围内的医学、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等技术。这种技术在文献中有充分的解释。

必须注意的是，除非上下文另有明确说明，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，“支撑件”包括多个支撑件。在本说明书和随后的权利要求书中，将提及许多术语，这些术语将被定义为具有以下含义，除非相反的意图是明显的。

除非另有说明，否则本文中使用的下列术语具有赋予它们的含义。在本公开中，“包括”、“包含”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法赋予它们的含义，并且可以表示“包括”、“包含”等；“基本上由...组成”等，当应用于本公开所包含的方法和组合物时，是指类似于本文所公开的那些组合物，但是其可以包含额外的结构基团、组成成分或方法步骤(或如上所述的其类似物或衍生物)。然而，这种附加的结构基团、组成成分或方法步骤等与本文公开的相应组合物或方法的特征相比，并不实质性地影响组合物或方法的基本和新颖特征。

在描述各种实施方案之前，提供了以下定义，除非另有说明，否则应当使用这些定义。

本文端点引用的数值范围包括该范围内包含的所有数字和分数(例如,1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应该理解的是，所有数字及其分数都被假定为由术语“大约”修饰。这里使用的“大约”表示数字、数量、时间等不精确或不确定，但与规定值相当接近或几乎相同。因此，术语“大约”是指加或减所参考的数字的0.1至50％、5-50％、或10-40％、优选10-20％、更优选10％或15％。此外，应当理解，“一个”、“该”和“所述”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。因此，例如，包含“一种化合物”的组合物包括两种或多种化合物的混合物。

缩写

αSMA，α平滑肌肌动蛋白；ANGPTL2，血管生成素样蛋白2；AT1，肺泡1型上皮细胞；AT2，肺泡2型上皮细胞；AQP5，水通道蛋白5；Bleo，博来霉素；C1r，补体成分1r；CM，条件培养基；Crs，顺应性；DDK3，dickkopf相关蛋白3；DNA，脱氧核糖核酸；ECM，细胞外基质；Ers，弹性阻力；EV，细胞外囊泡；EXO，外泌体；FDA，食品和药物管理局；FEV，用力呼气量；FSTL1，卵泡抑素样1；FVC，用力肺活量；GAS6，生长停滞特异性蛋白6；H&E、苏木精和伊红；IC，吸气量；IGFBP2，胰岛素样生长因子结合蛋白2；IL，白细胞介素；IPF，特发性肺纤维化；i.t.，气管内；LSC，肺球体细胞；MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1；miR，微小RNA；MMP，基质金属蛋白酶；MSC，间充质干细胞；PCOLCE，前胶原C-肽链内切酶增强子1；ProSPC，前表面活性蛋白C；RNA，核糖核酸；Rrs，阻力；SERPINE1，丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1；SMAD3，母体抗生物皮肤生长因子同系物3(mothers against decapentaplegic homolog 3)；SPARC，呈酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白质；TIMP，金属蛋白酶的组织抑制剂；vWF，von Willebrand因子；

定义

本文使用的术语“施用”化合物或组合物是指向需要治疗的个体提供本公开的组合物。本公开的组合物可以通过口服、肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内、ICV、颅内注射或输注、皮下注射或植入)，通过吸入喷雾、鼻、阴道、直肠、舌下或局部施用途径，并且可以单独或一起配制成合适的剂量单位制剂，所述制剂包含常规的无毒的药学上可接受的适合于各种施用途径的载体、佐剂和媒介物。

术语“同种异体的”是指来源于或起源于另一个受试者或患者。“同种异体移植”是指将细胞或器官从一个受试者收集(例如，分离)并移植到另一个受试者的体内。在某些情况下，“同种异体移植”包括从另一个受试者的细胞中生长或培养的细胞。

术语“自体的”是指来源于或起源于同一受试者或患者。“自体移植”是指受试者自身细胞或器官的收集(例如，分离)和再移植。在某些情况下，“自体移植”包括从受试者自身细胞中生长或培养的细胞。例如，在本公开的方法中，心脏干细胞可以来源于从待治疗患者的心脏切除的心脏组织样品，经培养，根据本公开的方法工程化以与血小板膜囊泡融合，然后施用于同一患者以治疗其中的心血管损伤。

如本文所用的术语“生物相容的”是指在体内不会引起任何不希望的局部或全身效应的材料。

如本文所用的术语“生物材料”和“生物组织”是指体内(例如受试者的细胞或组织)和体外(例如培养的细胞)的细胞或组织。

如本文所用的术语“生物分子种类”是指可能是生物来源的和/或与其接触的细胞相互作用的任何分子。用于本公开的微粒中的生物分子种类可以是但不限于蛋白质、多肽、肽、核酸分子、糖、多糖、细胞因子等，其可以是但不限于增加或减少细胞或细胞系的增殖，可以维持细胞或细胞系的生存力和/或增殖，或者可以引发从干细胞类型、前体细胞类型或祖细胞类型的细胞类型的改变。

如本文所用的术语“细胞”是指动物或人类细胞。本公开的间充质细胞可以从组织中移除(分离)，并且可以被培养以增加细胞的群体大小。动物或人类细胞可以通过在培养基中连续传代培养或通过本领域熟知的方法冷冻保存而保持存活状态。所述细胞可以从已经接受了希望通过施用本公开的工程化细胞来修复的损伤的动物或人类个体获得，或者从不同的个体获得。

预期用于本公开方法的细胞及其细胞外囊泡(如外泌体)可来自待治疗的同一受试者(对于受试者来说是自体的)，或者它们可来自不同的受试者，优选来自同一物种(对于受试者来说是同种异体的)。

市售培养基可用于间充质干细胞的生长、培养和维持。此类培养基包括但不限于Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。这种培养基中对间充质干细胞的生长、培养和维持有用的组分包括但不限于氨基酸、维生素、碳源(天然和非天然)、盐、糖、植物来源的水解产物、丙酮酸钠、表面活性剂、氨、脂质、激素或生长因子、缓冲剂、非天然氨基酸、糖前体、指示剂、核苷和/或核苷酸、丁酸盐或有机物、DMSO、动物来源的产品、基因诱导剂、非天然糖、细胞内pH值调节剂、甜菜碱或渗透保护剂、微量元素、矿物质、非天然维生素。可用于补充市售组织培养基的附加成分包括，例如，动物血清(例如，胎牛血清(FBS)、胎牛血清(FCS)、马血清(HS))、抗生素(例如，包括但不限于青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素B、杀稻瘟菌素、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽、博来霉素、头孢菌素、金霉素、抗菌素(zeocin)和嘌呤霉素)和谷氨酰胺(例如，L-谷氨酰胺)。间充质干细胞的存活和生长也取决于适当有氧环境、pH和温度的维持。间充质干细胞可以使用本领域已知的方法来维持(例如，参见Pittenger etal.,(1999)Science 284:143-147)。

本文使用的术语“细胞疗法”是指将新细胞引入组织中以治疗疾病，并代表用健康组织修复或替换患病组织的方法。

术语“克隆的”是指一个细胞或一组细胞，它们是由一个细胞通过许多轮细胞分裂产生的。克隆群体的细胞在遗传上是相同的。克隆群体可以是异质群体，使得细胞可以在特定的时间点表达不同的基因集。

本文使用的术语“组合物”是指包含指定量的指定成分的产品，以及由指定量的指定成分的组合直接或间接产生的任何产品。这种与药物组合物相关的术语旨在涵盖包含活性成分和构成载体的惰性成分的产品，以及直接或间接由任意两种或更多种成分的组合、络合或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用产生的任何产品。因此，本公开的药物组合物包括通过混合本公开的化合物和药学上可接受的载体制成的任何组合物。

当本公开的化合物与一种或多种其他药物同时使用时，还考虑除了本公开的化合物之外，还包含这种其他药物的药物组合物。因此，本公开的药物组合物还包括那些除了本公开的化合物之外还含有一种或多种其它活性成分的药物组合物。本公开的化合物与第二活性成分的重量比可以变化，并且将取决于每种成分的有效剂量。通常，将使用每一种的有效剂量。因此，例如，但不旨在限制，当本公开的化合物与另一种剂组合时，本公开的化合物与另一种剂的重量比通常在约1000∶1至约1∶1000的范围内，优选在约200∶1至约1∶200的范围内。本公开的化合物和其它活性成分的组合通常也在上述范围内，但在每种情况下，应当使用每种活性成分的有效剂量。以这样的组合，本公开的化合物和其它活性剂可以单独或联合施用。此外，一种成分的施用可以在施用其它剂之前、同时或之后进行。

本文使用的术语“培养”是指在适于存活的受控条件下生长细胞或组织，通常在机体外(例如，离体或体外)。当提到培养过程中的细胞培养时，所述术语包括“扩增”、“传代”、“维持”等。培养细胞可以导致细胞生长、分化和/或分裂。

如本文所用的术语“来源于”是指细胞或生物样品(例如，血液、组织、体液等)，并且表明细胞或生物样品是在某个时间点从所述来源获得的。例如，来源于个体的细胞可以代表直接从个体获得的原代细胞(即，未修饰的)。在一些情况下，来源于给定来源的细胞经历一轮或多轮细胞分裂和/或细胞分化，使得原始细胞不再存在，但继续存在的细胞(例如，所有世代的子细胞)将被理解为来源于相同的来源。所述术语包括直接获得、分离和培养，或获得、冷冻和解冻。所述术语“来源于”也可以指从组织或细胞获得的细胞的成分或片段，包括但不限于蛋白质、核酸、膜或膜的片段等。

术语“解聚(disaggregating)”包括使用机械或酶法破坏来分离、移开(dislodging)或解离细胞或组织，以分离单细胞或小细胞簇。在某些情况下，可以用一种或多种与酶具有基本相同效应的酶替代物来代替酶破坏。

本文所用的术语“有效量”是指足以降低或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间、抑制或防止病症的进展、导致病症消退、抑制或防止与病症相关的一种或多种症状的复发、发展、发作或进展、检测病症、或增强或改善另一种疗法(例如，预防剂或治疗剂)的预防或治疗效应的量。

术语“内皮细胞”是指从现有血管形成和发展新血管(例如,血管生成)所必需的细胞。通常，内皮细胞是衬在血管和淋巴管内表面的薄层细胞。内皮细胞参与多个方面的血管生物学，包括动脉粥样硬化、凝血、炎症、血管生成和血压控制。

本文所用的术语“外泌体”是指小的分泌囊泡(通常为约30nm至约150nm(或最大尺寸，当颗粒不是球体时))，其可包含或在其膜中存在核酸、蛋白质或其他生物分子，并可在机体或生物系统的不同位置之间充当该货物的载体。本文使用的术语“外泌体”有利地指可具有治疗特性的细胞外囊泡，包括但不限于干细胞外泌体，如心脏干细胞或间充质干细胞。

外泌体可以从各种生物来源中分离，包括哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、灵长类动物或人类。外泌体可以从生物液体中分离出来，如血清、血浆、全血、尿液、唾液、母乳、眼泪、汗液、关节液、脑脊液、精液、阴道液、腹水和羊水。外泌体也可以从实验样品中分离，例如取自培养细胞的培养基(“条件培养基”、细胞基和细胞培养基)。

外泌体也可以从组织样品如外科手术样品、活检样品和培养细胞中分离出来。当从组织来源分离外泌体时，可能有必要使组织均质化，以获得单细胞悬液，随后裂解细胞以释放外泌体。当从组织样品中分离外泌体时，选择不会导致外泌体破坏的均质化和裂解程序是很重要的。

外泌体可以从新收集的样品或冷冻或冷藏过的样品中分离出来。虽然不是必须的，但是如果在沉淀前用体积排除聚合物澄清流体样品，以从样品中除去任何碎片，则可以获得更高纯度的外泌体。澄清方法包括离心、超速离心、过滤或超滤。

细胞外囊泡(如外泌体)中的遗传信息可以通过融合到受体细胞的膜上，并将遗传信息释放到细胞中而容易地在细胞内传递。虽然外泌体作为一类化合物代表了巨大的治疗潜力，但外泌体的一般群体是几种核酸和蛋白质的组合，它们具有一系列有利和有害的生物效应。事实上，有超过1000种不同类型的外泌体。

本文使用的术语“细胞外囊泡”可以指由细胞分泌的膜囊泡，其直径可以大于所谓的“外泌体”的直径。细胞外囊泡(也称为“微泡”或“膜囊泡”)的直径(或最大尺寸，当颗粒不是球体时)可在约10nm至约5000nm之间(例如，约50nm至1500nm、约75nm至1500nm、约75nm至1250nm、约50nm至1250nm、约30nm至1000nm、约50nm至1000nm、约100nm至1000nm、约50nm至750nm等)。通常，细胞外囊泡的至少部分膜直接从细胞(也称为供体细胞)获得。适用于本公开组合物和方法的细胞外囊泡可以通过膜转化(membrane inversion)、胞吐、脱落、起泡和/或出芽来源于细胞。细胞外囊泡可能来源于相同的供体细胞群，但不同的细胞外囊泡亚群可能表现出不同的表面/脂质特征。细胞外囊泡的替代名称包括但不限于外泌体(exosomes)、核外颗粒体(ectosomes)、膜颗粒、外泌体样颗粒和凋亡小泡。取决于产生的方式(例如，膜转化、胞吐、脱落或出芽)，本文预期的细胞外囊泡可表现出不同的表面/脂质特征。

本文使用的术语“制剂”是指可以是组分的储备溶液的组合物，或优选包括稀释剂如水或其它可用于分配给患者或医生的药学上可接受的载体的组合物。

本公开提供了提供优势的和/或有益的药代动力学特征，更具体地说是持续药代动力学特征的剂型、制剂和方法。本公开的组合物可以以纯的或基本上纯的形式、其药学上可接受的盐的形式以及包括无水或水合形式在内的其他形式用于剂型中。

有益的药代动力学特征可通过施用适合于一天一次、两次或三次的制剂或剂型，或多次施用来获得，所述制剂或剂型包含一种或多种本公开的组合物，所述组合物以足以向使用环境提供治疗本文公开的疾病(特别是癌症)所需浓度或剂量的组合物的量存在。

本公开的实施方案涉及包含一种或多种本公开组合物的剂型，其可提供约0.001至2mg/ml、0.001至1mg/ml、0.0002至2mg/ml、0.005至2mg/ml、0.01至2mg/ml、0.05至2mg/ml、0.001至0.5mg/ml、0.002至1mg/ml、0.005至1mg/ml、0.01至1mg/ml、0.05至1mg/ml、或0.1至1mg/ml的组合物的峰值血浆浓度。本公开还提供了包含一种或多种本公开的组合物的制剂或剂型，其提供0.5至20h、0.5至15h、0.5至10h、0.5至6h、1至20h、1至15h、1至10h或1至6h的清除t

可以用本公开的一种组合物或多种组合物或其单位剂量以基本上任何期望的方案治疗受试者。它们可以每天施用一次或多次，特别是每天1或2次，每周一次，每月一次或连续施用。然而，可以不那么频繁地对受试者进行治疗，例如每隔一天或每周一次，或更频繁地对其进行治疗。一种组合物或多种组合物可以周期性地或连续地给予受试者约或至少约24小时、2天、3天、1周、2周至4周、2周至6周、2周至8周、2周至10周、2周至12周、2周至14周、2周至16周、2周至6个月、2周至12个月、2周至18个月、2周至24个月或超过24个月。

有益的药代动力学特征可以通过施用适合于一天施用一次、两次或三次，优选一天施用两次的制剂或剂型来获得，所述制剂或剂型包含一种或多种本公开的组合物，其存在量足以提供所需的组合物剂量。本公开的组合物每日施用一次、两次、三次或更多次的所需剂量为约0.01至3000mg/kg、0.01至2000mg/kg、0.5至2000mg/kg、约0.5至1000mg/kg、0.1至1000mg/kg、0.1至500mg/kg、0.1至400mg/kg、0.1至300mg/kg、0.1至200mg/kg、0.1至100mg/kg、0.1至50mg/kg、0.1至20mg/kg、0.1至10mg/kg、0.1至6mg/kg、0.1至5mg/kg、0.1至3mg/kg、0.1至2mg/kg、0.1至1mg/kg、1至1000mg/kg、1至500mg/kg、1至400mg/kg、1至300mg/kg、1至200mg/kg、1至100mg/kg、1至50mg/kg、1至20mg/kg、1至10mg/kg、1至6mg/kg、1至5mg/kg或1至3mg/kg、或1至2.5mg/kg、或少于或约10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、1mg/kg、或0.5mg/kg，每日两次或更少次。

某些剂型和制剂可使本公开组合物的峰值和谷值血浆和/或脑水平之间的差异最小化，特别是提供持续治疗有效量的组合物。

本公开还考虑了包含一定量的一种或多种本公开组合物的制剂或剂型，其在给药期间，特别是24小时的给药期间，产生治疗有效量的组合物。本公开组合物的治疗有效量为约0.1至1000mg/kg、0.1至500mg/kg、0.1至400mg/kg、0.1至300mg/kg、0.1至200mg/kg、0.1至100mg/kg、0.1至75mg/kg、0.1至50mg/kg、0.1至25mg/kg、0.1至20mg/kg、0.1至15mg/kg、0.1至10mg/kg、0.1至9mg/kg、0.1至8mg/kg、0.1至7mg/kg、0.1至6mg/kg、0.1至5mg/kg、0.1至4mg/kg、0.1至3mg/kg、0.1至2mg/kg、或0.1至1mg/kg。

本公开的药物或治疗可以包括单位剂量的至少一种本公开的组合物，以提供治疗效应。“单位剂量”或“剂量单位”是指单位的(即单一的)剂量，其能够给患者施用并且易于处理和包装，保持为物理和化学稳定的单位剂量，所述单位剂量包含活性药物本身或与一种或多种固体或液体药物赋形剂、载体或媒介物的混合物。

如本文所用，术语“产生”(“generate”，“generation”，“generating”)应被赋予其普通含义，并且应指受试者中新细胞的产生以及任选地进一步分化为成熟的功能细胞。细胞的产生可以包括细胞的再生。细胞的产生包括改善细胞的存活、移植和/或增殖。

本文使用的术语“生长因子”是指对细胞具有生长、增殖、分化或营养效应的蛋白质、肽或其他分子。这些因子可用于诱导增殖或分化，并可包括，例如，允许细胞增殖的任何营养因子，包括与细胞表面受体结合以对细胞产生营养或生长诱导效应的任何分子。这些因子包括由干细胞分泌的旁分泌因子，其可以诱导或维持非常接近本公开的仿生微粒的细胞的增殖或分化。因子包括但不限于肾上腺髓质素(AM)；血管生成素(Ang)；自分泌运动因子；骨形态发生蛋白(BMPs)；睫状神经营养因子家族；睫状神经营养因子(CNTF)；白血病抑制因子(LIF)；白细胞介素-6(IL-6)；集落刺激因子；巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；表皮生长因子(EGF)；Ephrin A1；Ephrin A2；Ephrin A3；Ephrin A4；Ephrin A5；Ephrin B1；Ephrin B2；EphrinB3；促红细胞生成素(EPO)；成纤维细胞生长因子(FGF)；胎牛生长激素(FBS)；GDNF配体家族:神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)；Neurturin；Persephin；Artemin；生长分化因子-9(GDF9)；肝细胞生长因子(HGF)；肝癌衍生生长因子(HDGF)；胰岛素；胰岛素样生长因子-1(IGF-1)；胰岛素样生长因子-2(IGF-2)；白细胞介素类:IL-1；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；角质细胞生长因子(KGF)；迁移刺激因子(MSF)；巨噬细胞刺激蛋白(MSP)；肌生长抑制素(GDF-8)；神经调节蛋白类；神经调节蛋白1(NRG1)；神经调节蛋白2(NRG2)；神经调节蛋白3(NRG3)；神经调节蛋白4(NRG 4)；脑源性神经营养因子(BDNF)；神经生长因子(NGF)；神经营养素-3(NT-3)；神经营养素-4(NT-4)；胎盘生长因子(PGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；肾胺酶(RNLS)；T细胞生长因子(TCGF)；促血小板生成素(TPO)；转化生长因子；转化生长因子α(TGF-α)；转化生长因子β(TGF-β)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)等。

当指细胞或分子(例如,核酸或蛋白质)时，术语“分离”或“分离的”表示细胞或分子已经从其天然的、原始的或先前的环境中分离出来。例如，分离的细胞可以从来源于其宿主个体的组织中取出，但是可以存在于其他细胞中(例如，在培养物中)，或者被重新引入其宿主个体。

本文使用的术语“肺祖细胞”和“肺干细胞”可以指来源于人或动物肺组织的祖细胞群体。

本文使用的术语“间充质干细胞(MSC)”是指具有分化为神经元细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌细胞、心脏组织和其他内皮和上皮细胞的能力的祖细胞。(参见例如Wang,(2004)Stem Cells 22:1330-1337；McElreavey(1991)Biochem.Soc.Trans.1:29s；Takechi(1993)Placenta 14:235-245；Yen(2005)StemCells；23:3-9)。这些细胞已经被表征为表达CD13、CD29、CD44、CD49a、b、c、e、f、CD51、CD54、CD58、CD71、CD73、CD90、CD102、CD105、CD106、CDw119、CD120a、CD120b、CD123、CD124、CD126、CD127、CD140a、CD166、P75、TGF-IR、TGF-IIR、HLA-A、B、C、SSEA-3、SSEA-4、D7和PD-L1中的一种或多种，并因此所述一种或多种分子是阳性的。

间充质干细胞可以从多种来源获得，包括但不限于骨髓、血液、骨膜、真皮、脐带血和/或基质(例如，Wharton's Jelly)，还有胎盘。获得间充质干细胞参考的方法的例子可以在例如U.S.Pat.No.5,486,359中找到。

本文使用的术语“调节增殖状态”或“调节增殖”是指化合物改变干细胞或祖细胞群的增殖速率的能力。化合物可能是有毒的，其中细胞的增殖被减缓或停止，或者增殖可以被增强，例如通过向细胞中加入细胞因子或生长因子。

术语“专能(multipotent)”是指具有分化成多种但数量有限的细胞类型或细胞谱系的潜力的细胞。通常，这些细胞被认为是非专门细胞，其具有自我更新并成为具有特定功能和特征的专门细胞的能力。

本文所用的术语“旁分泌信号”是指一种细胞间通讯的形式，其中细胞产生信号以诱导附近细胞的变化，从而改变这些细胞的行为或分化。被称为旁分泌因子的信号分子在相对较短的距离内扩散(局部作用)，与内分泌因子(通过循环系统行进相当长距离的激素)、近分泌相互作用和自分泌信号相反。产生旁分泌因子的细胞将其分泌到紧邻的细胞外环境中。因子随后行进到附近的细胞，在这些细胞中，接收到的因子的梯度决定了结果。

虽然旁分泌信号在被诱导的细胞中引起多种多样的响应，但大多数旁分泌因子利用相对狭窄的一组受体和途径。身体的不同器官，甚至不同物种之间，可以在不同的发育阶段利用相似的旁分泌因子集。基于相似的结构，高度保守的受体和途径可分为四大家族：成纤维细胞生长因子(FGF)家族、Hedgehog家族、Wnt家族和TGF-β超家族。旁分泌因子与其各自受体的结合启动信号转导级联反应，引发不同的响应。

为了使旁分泌因子在接受细胞中诱导响应，该细胞必须在细胞膜上有合适的受体来接收信号，也称为感受态。此外，响应细胞还必须具有被机械诱导的能力。

本文所用的术语“药物组合物”是指可施用于动物或人类患者以治疗或预防患者疾病或病理状况的组合物。所述组合物可以根据制备药学上可用的组合物的已知方法来配制。此外，如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指任何标准的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可包括稀释剂、佐剂和媒介物，以及植入载体，以及惰性、无毒的固体或液体填料、稀释剂或不与本发明活性成分反应的包封材料。实例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水和乳液，例如油/水乳液。所述载体可以是溶剂或分散介质，包含例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。含有药学上可接受的载体的制剂以多种来源进行了描述，这些来源是本领域技术人员众所周知且容易获得的。比如Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin E W,Remington'sPharmaceutical Sciences,Easton Pa.,Mack Publishing Company,19.sup.th ed.,1995)描述了可用于本发明的制剂。适于胃肠外施用的制剂包括，例如，无菌注射水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质(其使得制剂与预期接受者的血液等渗)；以及水性和非水性无菌混悬液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以在使用前在冷冻干燥(冻干)条件下储存，该条件仅需要无菌液体载体(例如注射用水)的条件。临时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒、片剂等制备。应当理解，除了上面特别提到的成分之外，考虑到所讨论的制剂类型，本发明的制剂可以包括本领域中常规的其它剂。

本文所用的术语“药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物”是指不干扰活性成分的有效性或活性的介质，并且该介质对它所施用的宿主无毒，并且是由联邦或州政府的监管机构批准的，或者在美国药典或其他公认的药典中列出的，用于动物，更具体地说，用于人类。载体、赋形剂或媒介物包括稀释剂、结合剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填充剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和制备特定组合物可能需要的杂项材料(如吸收剂)。载体等的例子包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。这种介质和剂用于活性物质在本领域中是众所周知的。

如本文所用的术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指在生物学上或其他方面不是不希望的材料，即，该材料可以在制剂或组合物中被施用于个体，而不会引起任何不希望的生物效应或以有害的方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。

如本文所用的术语“祖细胞”是指具有分化成特定类型细胞的能力以及复制以产生与其自身基本等同的子细胞的能力的细胞。在某些情况下，祖细胞经历有限的自我更新，因此它不会无限期地自我复制。

如本文所用的术语“增殖状态”是指细胞群(包括但不限于间充质干细胞或祖细胞，或其亚群)在静息状态下是否正在分裂并由此增加数量，或者细胞是否没有在增殖、死亡或经历凋亡。

术语“肺纤维化”是指肺的病理性纤维化，无论是由疾病还是损伤引起的。所述术语包括IPF、胸膜纤维化、胸膜下纤维化、肺纤维化、常见间质性肺炎(UIP)和药物诱导的肺纤维化。

本文所用的术语“再生(regenerate,regeneration,regenerating)”是指生长和/或发育新组织以替代例如由病毒感染、化学诱导损伤或其他疾病损伤的组织的过程。组织再生可以包括细胞增殖的激活和/或增强。

本文使用的术语“分泌蛋白质组”是指分泌到细胞外培养基中并从细胞外培养基中收集的多肽，包括生长因子、趋化因子、细胞因子、粘附分子、蛋白酶和脱落受体。据预测，人类蛋白质编码基因(39％，19613个基因)具有信号肽和/或至少一个跨膜区，提示相应蛋白质主动转运出细胞(分泌)或位于细胞众多膜系统之一中。非蛋白质成分(如脂质、微小RNA和信使RNA)也可以由细胞通过从质膜脱落的微泡(直径100nm至超过1000nm)和通过核内体-胞吐事件释放的外泌体(直径约30nm至约150nm)分泌。这些细胞器中存在的因子占分泌蛋白质组的多达42％，并包含在集合体分泌蛋白质组中。因此，本公开的条件细胞培养基可包括由细胞群产生的一些或全部的分泌的蛋白质，核酸，微泡和外泌体，包括但不限于这些的分离实例。

本文使用的术语“自我更新(self-renewal,self-renewing)”是指细胞具有通过许多细胞分裂周期进行分裂并产生具有与亲代细胞相同特征的子代的能力。其他子细胞可以具有与其亲代细胞不同的特征。所述术语包括细胞通过细胞分裂产生其自身的相同遗传拷贝(例如克隆)的能力。例如，自我更新的心脏祖细胞可以分裂以形成一个子代心脏祖细胞和另一个致力于分化为心脏谱系的(例如内皮细胞、平滑肌细胞或心肌细胞)的子细胞。在某些情况下，自我更新的细胞不会永远经历细胞分裂。

本文使用的术语“干细胞”是指具有自我更新和产生分化的后代的能力的细胞。术语“多能干细胞”是指具有完整的分化多功能性(即，生长成任何胎儿或成年哺乳动物身体的大约260种细胞类型的能力)的干细胞。例如，多能干细胞具有分化成三个胚层的潜力：内胚层(例如，血管)、中胚层(例如，肌肉、骨骼和血液)和外胚层(例如，表皮组织和神经系统)，因此可以产生任何胎儿或成人细胞类型。

如本文使用的术语“受试者”和“患者”包括人类、哺乳动物(例如，猫、狗、马等)、活细胞和其他生物体。一个活的生物体可以像单个真核细胞一样简单，也可以像哺乳动物一样复杂。可以施用本公开实施方案的典型宿主将是哺乳动物，尤其是灵长类动物，尤其是人类。对于兽医应用，多种多样的受试者将是合适的，例如，牲畜(如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等)；家禽(如鸡、鸭、鹅、火鸡等)；和家养动物，特别是宠物(如狗和猫)。对于诊断或研究应用，多种哺乳动物将是合适的受试者，包括啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物和猪(如近交猪)等。在一些实施方案中，系统包括样本和受试者。术语“活宿主”是指上面提到的活的和未死的宿主或生物体。术语“活宿主”是指整个宿主或生物体，而不仅仅是从活宿主切除的一部分(例如，肝脏或其他器官)。

本文使用的术语“治疗效应”是指本公开的组合物的效应，特别是本文公开的制剂或剂型或方法的效应。治疗效应可以是持续的治疗效应，其与给药期间(特别是持续给药期间)本公开化合物的连续浓度相关。根据本公开的化合物的效应与不含该化合物的效应的统计学分析，治疗效应可以是统计学上显著的效应。

本文使用的术语“治疗有效量”是指本公开的活性化合物或包含该活性化合物的组合物的量或剂量，其将导致一种或多种期望的效应，特别是一种或多种治疗效应或有益的药代动力学特征。物质的治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及该物质在受试者中引发所需响应的能力等因素而变化。可以调整给药方案以提供最佳的治疗响应或药代动力学特征。例如，可以每天分几次给药，或者根据治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。

如本文所用的术语“组织损伤”是指对动物或人的肺组织的损伤。

术语“治疗”、“疗法”、“改善”等是指症状严重性的任何降低。如本文所使用的，术语“治疗”和“预防”不是绝对术语。治疗可以指任何发病的延迟、症状的改善、患者存活率的提高、心脏组织或血管的修复/再生、存活时间或存活率的增加等。治疗的效应可以与未接受治疗的个体或个体群进行比较。在某些情况下，所述效应可以是对同一患者的治疗前或治疗过程中的不同时间。在一些方面，与例如施用前的个体或未经治疗的对照个体(例如，健康个体或不再患有所述疾病、病症或损伤的个体)相比，疾病、病症或损伤的严重性降低了至少10％。在某些情况下，疾病、病症或损伤的严重性降低了至少20％、25％、50％、75％、80％或90％。在某些情况下，疾病的症状或严重程度已无法通过标准诊断技术检测出来。

说明

本公开的多个方面涉及治疗肺部肺疾病(尤其是肺纤维化)的方法。所述方法包括给患者施用药物组合物，所述药物组合物包含肺球体细胞条件培养基，所述培养基可包含至少一种细胞分泌因子，例如肽、蛋白质或核酸或本文所述的肺球体细胞来源的外泌体，并且其量足以显著减少一种或多种以下病理状况：肺水肿、与肺纤维化相关的肺病理学和羟脯氨酸积聚或纤维化蛋白质(例如胶原蛋白和弹性蛋白)。

已经表明，被称为肺球体细胞(LSC)的治疗性成人肺细胞包含表达肺上皮(Epcam，AQP5，ProSPC和CCSP)和间充质(CD90和CD105)特异性标记的异质细胞群。本研究的目的是检验LSC来源的条件培养基对肺纤维化的治疗效应。据报道，间充质干细胞(MSC)分泌蛋白质组或条件培养基确实能在某些疾病(如骨关节炎、支气管肺发育不良和多发性硬化)中再现MSC细胞疗法中看到的治疗效应。这些研究包括以MSC来源的CM作为比较治疗以测试非劣效性，表明肺球体细胞条件培养基(LSC-CM)促进肺纤维化中的肺修复，其方式优于其MSC对应物。

特发性肺纤维化(IPF)是一种致命的特发性间质性肺病，其中持续的肺损伤导致疤痕组织形成。随着纤维化的加剧，肺组织变得僵硬，失去了促进气体交换和为细胞提供所需氧气的能力。目前，除了肺移植，IPF几乎没有治疗选择，也没有有效的疗法。呈现了使用肺球体细胞来源的条件培养基(LSC-CM)和肺球体细胞外泌体(LSC-EXO)来治疗不同肺损伤模型的本公开方法的实施方案。

已经开发了各种动物模型来模仿人类IPF的病理学标志(hallmark)。由于疾病的原因不明，不存在真正的IPF动物模型。诱导性肺纤维化的Bleo模型被广泛用于IPF研究，它可以说是最具临床相关性的。为了支持在Bleo模型中发现的任何治疗效应，还测试了二氧化硅诱导的肺纤维化模型。

Bleo小鼠模型和二氧化硅小鼠模型都表现出显著的肺泡上皮损伤和ECM沉积(图1E-1I、3C-3G和5E-5H)。大鼠模型显示，Bleo损伤后肺功能显著下降(图6C-6I)。已经证明，与细胞本身相比，来源于干细胞的无细胞CM可以获得类似或更好的保护和再生能力。最新的观察表明，LSC-CM能够逆转Bleo造成的纤维化，以及由二氧化硅颗粒造成的纤维化(图1-3)。然而，LSC-CM的再生效应在Bleo模型中比在二氧化硅模型中更稳健。在凋亡细胞减少、纤维化评分、羟脯氨酸含量以及AT1和AT2细胞群的显著恢复方面，在Bleo灌注小鼠中的LSC-CM吸入治疗能够将受损肺挽救回与健康假处理对照相似的水平(图1C-1I和2A-2D)。

在二氧化硅模型中，CM治疗的效应虽然与未治疗的对照组(PBS治疗)相比逆转了纤维化，但没有将损伤逆转回健康假处理对照组中看到的水平。这可能是由于动物模型的不同。与Bleo诱导的损伤不同，二氧化硅是由沉积在肺中的颗粒的物理存在引起的，导致纤维化结节的形成。组织学检查显示，与PBS对照组相比，CM治疗组中结节周围的纤维化组织减少，但CM疗法不足以解决结节本身(图3C、3E和3F)。七天的治疗可能不足以逆转二氧化硅颗粒造成的损伤。对于某些类型的肺损伤，其中颗粒物质保留在肺中导致功能障碍(例如矽肺病)，其可能需要更长的连续CM治疗才能不仅解决纤维化，而且清除颗粒。

再生医学领域利用许多不同类型的干细胞进行研究和临床应用，但间充质干细胞仍然是应用最广泛的，部分原因是它们的免疫调节能力和易于分离。因此，比较了LSC-CM和MSC-CM的再生优势。因此，在Bleo模型和二氧化硅模型中，都证明了虽然MSC-CM吸入疗法在治疗肺纤维化中具有再生活性，但LSC-CM在所有方面都优于MSC-CM(图1-3)。

通过蛋白质组学分析阐明了CM介导的肺修复的分子机制。这些分析揭示了αSMA(一种肌成纤维细胞标记物)和促炎/促纤维化细胞因子的下调，可能是通过上调MMP2的活性(图2E-2G)。已经显示，MMP活性在PF中具有多种作用，这表明在Bleo诱导的PF的早期，MMP在疾病发病机理中起作用。但在后期，MMP活性可能在修复过程中发挥作用。

对LSC分泌蛋白质组的质谱分析揭示了与补体系统(C1r和核心蛋白聚糖)以及Wnt信号通路(DKK3)相关的蛋白质(图4、图7)。另外，还鉴定了大量的ECM重塑蛋白、促血管生成蛋白和细胞增殖蛋白，这表明LSC-CM包含的蛋白不仅能够分解和逆转已经存在的纤维化，而且还能促进上皮和血管修复。

条件培养基不仅包含可溶性蛋白质，还包含不溶性物质，如外泌体。外泌体是生物医学研究的一个新兴领域，在过去的二十年里，发现和兴趣激增。干细胞的治疗效应已归因于分泌的外泌体中发现的miRNA。因此，我们确定了响应于LSC-CM所观察到的再生益处是否可以由EXO来解释。研究结果表明，LSC-EXO能够再现分离出它们的CM的部分再生能力(图5-6)。还证明了LSC-EXO在逆转肺纤维化和恢复健康肺功能方面优于MSC-EXO。正如预期的那样，所有CM和EXO治疗组在凋亡细胞减少、纤维化严重程度降低、以及肺功能改善和肺泡上皮恢复方面均有显著改善。然而，与MSC-CM和MSC-EXO相比，LSC-CM和LSC-EXO都表现出更好的治疗效应。LSC-CM是唯一能够逆转肺泡损伤、将纤维化评分和羟脯氨酸水平降低至假处理对照组的治疗方法。就肺功能测量而言，只有LSC-EXO显示总呼吸阻力显著恢复。

LSC-EXO和MSC-EXO的RNA测序分析表明，let-7和miR99家族中的miRNA富集，它们都存在于LSC-EXO和MSC-EXO中鉴定的前十种miRNA中(图6K)。所述let-7家族的miRNA是第一个发现的miRNA，并在植物和动物中高度保守。已经发现Let-7miRNA在生物发育、干细胞分化和肿瘤发生中起着重要作用。同样，miRNA的miR99家族(miR99a、miR99b和miR100)也是高度保守的miRNA，发现其在干细胞中高度表达，并发现其在肺损伤和癌症中被下调。在特定的组织、细胞和癌症类型中发现let-7miRNA的不同亚型。Let-7a、-7c、-7g和miR100在肺癌中下调，并且所有四种类型都在LSC-EXO和MSC-EXO中检测到的前10种miRNA类型中。

还发现miR99a、miR100和miR10a响应于DNA损伤和在暴露于香烟烟雾的肺中被调节。与其他已鉴定的miRNA相比，miRNA的miR99家族以及miR-151a、miR-10a和miR-30a在LSC-EXO中显著上调。同样，let-7a和let-7f在MSC-EXO中显著上调。

研究表明，miR-30a的抗纤维化特性是通过逆转转化生长因子-β(TGF-β)诱导的Wnt1诱导信号通路蛋白1(WISP1)和抑制线粒体裂变防止凋亡来实现的。WISP1是IPF患者中已知的促纤维化介质，其显示可增强ECM沉积并促进纤维化进程。尽管miR-30a和let-7和miR99家族的miRNA在LSC-EXO和MSC-EXO中都有被鉴定到，但它们的差异表达可以解释观察到的治疗效应的差异。

为了评估吸入CM和EXO疗法的任何系统性免疫原性或脱靶效应，对系统性细胞因子表达、血液生化分析和所有主要器官的组织学进行了检查(图2G，6A)。所有器官的正常组织学以及正常的肝和肾功能表明，CM和EXO治疗没有引起任何局部或全身免疫反应，也没有引起任何异常的细胞或组织改变。有趣的是，对系统性细胞因子表达的分析显示，被治疗的动物血清中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)下调(图6A)。据报道，促纤维化细胞因子MCP-1在肺部炎症中起关键作用，并且MCP-1水平的升高与IPF患者的不良预后有关。

吸入治疗，其在某些情况下连续七天施用，可通过临床相关的雾化器等方式进行递送。结果显示，LSC-CM和LSC-EXO治疗可通过重建正常肺泡结构、减少细胞外基质积聚和肌成纤维细胞增殖来减轻和逆转博来霉素诱导的纤维化和二氧化硅诱导的纤维化。已经令人惊讶地发现，干细胞来源的条件培养基可以促进肺泡修复并至少部分地通过经EXO递送来解决肺纤维化。此外，与来自骨髓间充质干细胞的其对应物相比，LSC-CM和LSC-EXO显示出更好的治疗益处。因此，LSC-CM和LSC-EXO为肺纤维化提供了有利的治疗选择。

在本公开的一些实施方案中，向有需要的患者施用所述组合物可导致与肺纤维化相关的肺病理学的减少、羟脯氨酸积聚的减少、纤维化蛋白表达的减少，其中有需要的受试者具有以下至少一种情况：原发性或继发性肺纤维化疾病。在一些实施方案中，有效剂量的施用可以导致肺功能测试的改善，包括用力肺活量或氧气扩散。

总之，我们在此报告了新型无细胞治疗剂，即LSC-CM和LSC-EXO，它们在治疗博来霉素诱导的和二氧化硅诱导的啮齿动物肺纤维化中是安全有效的。本文提供的证据表明，CM介导的再生机制可能与EXO、MMP2活性和CM中发现的许多蛋白质有关。条件培养基和EXO的免疫原性比它们的亲代细胞低得多，施用这些因子可以克服干细胞的局限性，同时仍然保持类似的效应。在CM中鉴定miR-30a和miR-99和let-7家族的miRNA值得进一步研究，因为已知miR-30a在IPF患者中被下调，并且miR-99和let-7家族的miRNA也已知在包括肺癌在内的各种癌症中被下调。特发性肺纤维化是一种致命的呼吸系统疾病，发病率和死亡率不断增加；目前没有有效的疗法，LSC-CM和LSC-EXO为IPF疗法的发展提供了有希望的候选物。

干细胞条件培养基减弱和逆转博来霉素诱导的纤维化和成纤维细胞凋亡

为了测试LSC-CM对肺修复和纤维化的影响，使用了具有免疫功能的CD1小鼠的单一高剂量气管内(i.t.)博来霉素(Bleo)注射模型。在整个研究过程中监测体重，以示疾病负担。由于目标是治疗纤维化而不是炎症，因此在开始治疗之前，允许初始炎症阶段通过，纤维化开始形成。在Bleo模型中，炎症在滴注后第7天左右达到峰值，在第9天左右转变为纤维化；在第10天的干预后，开始了Bleo损害(insult)(图1A)。

在第10天，使用雾化器对小鼠进行连续7天的吸入治疗，剂量为每kg体重10mg条件培养基(CM)或等体积的PBS。为了验证雾化物质能够到达远端肺部区域，用雾化亚甲蓝染料测试小鼠。立即采集一组动物在一次雾化处理后的肺以进行组织学检查，并证实染料确实到达了远端肺(图11)。

在治疗效应的最初宏观检查中，所有接受Bleo的组都显示出血性坏死(图1B)，其随LSC-CM治疗或MSC-CM治疗而减少。由于Bleo诱导DNA损伤是其分子机制，因此研究了CM处理对细胞凋亡的影响(图1C和1D)。

与PBS治疗组相比，LSC-CM治疗导致肺中的细胞凋亡减少。LSC-CM和MSC-CM治疗都显示通过保护肺泡上皮结构明显减少纤维化(图1E和1F)和胶原沉积减少(图1G-1I)。通过苏木精和伊红(H&E)染色进行的纤维化组织学检查和相应的Ashcroft评分显示，只有LSC-CM能够减少纤维化面积，并将肺泡上皮损伤逆转回到假处理对照组中观察到的健康水平。

干细胞条件培养基吸入治疗增加MMP2表达，促进血管和肺泡修复

肺泡是远端气道的终端结构。肺泡上皮由肺泡1型上皮细胞(AT1)和肺泡2型上皮细胞(AT2)组成，肺泡1型上皮细胞是肺中介导气体交换的专门的细胞类型，肺泡2型上皮细胞产生并释放肺表面活性剂、抗氧化剂、细胞因子/趋化因子和其他对肺的防御、对损伤的响应和维持肺稳态重要的分子。因此，检查了响应于Bleo损伤后的CM治疗的AT1和AT2分布的变化，以评估上皮损伤和挽救(图2A)。AT1标记水通道蛋白5(AQP5)的免疫染色显示，LSC-CM处理能够逆转由Bleo引起的上皮损伤(图2A和2D)。

此外，LSC-CM处理显著增加表面活性蛋白C(ProSPC)阳性AT2细胞的增殖(图2A和2C)，这些细胞合成和分泌肺表面活性物质，并通过增殖和分化为AT1细胞来维持肺泡结构和完整性。这种响应在MSC-CM处理中仍然发生，但水平较低，与PBS处理组无显著差异。只有LSC-CM处理才能增加PF肺中von Willebrand因子(vWF)阳性血管的表达(图2A和2B)。

同时，纤维化响应通过测量α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)的蛋白水平来检测(图2E)，所述αSMA是IPF中成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的标志。与经PBS处理的对照组相比，经CM处理的两个组的αSMA均显著降低。有趣的是，基质金属蛋白酶2(MMP2)的蛋白表达在两个CM处理组中都有所增加(图2F)。细胞因子阵列用于评估系统性细胞因子表达。与PBS对照相比，只有LSC-CM能够显著降低IL-4的表达(图2G)。

条件培养基疗法在二氧化硅诱导的肺纤维化中的治疗效应

为了测试LSC-CM的再生效应是否可以应用于其他肺损伤模型，使用了建立良好的诱导肺纤维化的二氧化硅模型。与Bleo(Bleo是一种导致直接细胞损伤的生化试剂)不同，向肺部滴注细二氧化硅颗粒会导致颗粒周围形成纤维化结节。同样，因为目标是治疗纤维化，而不是治疗动物模型中先于它的炎症，所以在治疗小鼠之前，有一个延迟，直到炎症期过去，纤维化开始。对于二氧化硅模型，在二氧化硅滴注后第28天开始治疗，并且与之前的Bleo研究一样，通过雾化器连续七天进行CM或盐水吸入治疗(图3A)。

嵌入肺中的颗粒的物理存在有助于纤维化响应的局部化和可视化。就对凋亡细胞的影响而言，任何处理组都没有显著差异(图3B)。然而，与PBS治疗组相比，LSC-CM能够显著降低纤维化的严重程度(图3C和3D)。二氧化硅诱导的结节周围的纤维化组织不太强烈和广泛，但在LSC-CM和MSC-CM治疗组中均持续存在，如图3C、3E和3F所示。与PBS处理相比，CM处理还减少了胶原沉积并防止了肺泡上皮损伤，尽管胶原沉积仍然显著高于健康假处理对照(图3F-3G)。

对AQP5+AT1细胞和ProSPC+AT2细胞的检查显示，在所有二氧化硅损伤的肺中，两种肺泡标记物都显著下降(图3J和3K)。然而，与PBS组相比，LSC-CM能够通过促进ProSPC+AT2细胞表达和维持AQP5+AT1细胞群来减少肺泡上皮损伤(图3I和3J)。纤维化结节不含表达AQP5的AT1细胞，但含有有限表达的ProSPC阳性细胞和vWF阳性细胞(图3K)。

肺球体细胞条件培养基的蛋白质组成

确定了LSC-CM的蛋白质组组成。使用来自三个不同供体LSC系的汇集的CM，并使用液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)分析来检查它们的蛋白质组，并将它们与已知的干细胞分泌蛋白质组相比较(图7A-7C)。

尽管细胞系来自不同性别、种族和年龄的个体，然而这三个LSC系具有相似的蛋白质组(图4A)。在共有的蛋白质中，29.6％被注释为具有已知的膜分泌受体的胞外蛋白质，47.5％被注释为没有已知分泌途径的细胞质蛋白质(图4B)。

细胞质蛋白的高百分比促使我们去验证在CM中鉴定的蛋白是细胞真正分泌的蛋白还是死细胞释放的蛋白。因此，将从CM中鉴定的细胞质蛋白与从裂解细胞中鉴定的那些蛋白进行比较。正如预期的那样，当LSC被裂解时，大多数蛋白质组由注释的细胞质蛋白(65％)和只有5％的注释的胞外蛋白组成。当比较在LSC-CM和裂解的细胞中检测到的细胞质蛋白时，在CM中被分类为细胞质蛋白的222种蛋白中只有56种(约25％)可能来自潜在裂解或死亡的细胞。这些发现表明，在LSC-CM中鉴定的其他约75％的被注释为细胞质蛋白的蛋白质是通过目前未知的机制或途径从细胞中释放的蛋白质。

在所有三个供体中鉴定的103种常见细胞外蛋白中，大多数是生长因子和细胞外基质相关蛋白。该列表中最值得注意的是涉及Wnt信号传导(dickkopf WNT信号传导途径抑制剂3[DKK3])、补体系统(补体C1r亚组分[C1r]和核心蛋白聚糖)、血管生成(血管生成素样2[ANGPTL2]和细胞外基质蛋白1[ECM1])、肺发育(卵泡抑素样1[FSTL1]和巢蛋白2)、细胞增殖(生长停滞特异性6[GAS6]和胰岛素样生长因子结合蛋白2[IGFBP2])和细胞外基质(ECM)重塑(MMP 1、2、3，金属蛋白酶组织抑制剂[TIMP]1、2，前胶原C-内肽酶增强子[PCOLCE]，丝氨酸蛋白酶抑制剂家族E成员1[SERPINE1]和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白[SPARC])的蛋白(图4C)。与LSC分泌蛋白质组相关的生物过程的基因本体论(GO)分析确定了在发育过程、对刺激的响应和细胞成分组织或生物发生中重要的基因(图4D)。

外泌体可以部分再现干细胞条件培养基的治疗效应

已经证明，干细胞CM中的治疗成分不仅包括可溶性蛋白，还包括细胞外囊泡(EV)，尤其是外泌体(EXO)。因此，LSC-EXO和MSC-EXO通过大小、形态和共同的外泌体标记(CD63和CD81)来表征(图5A-5C)。为了测试EXO的功能作用，使用了一种类似于之前提出的小鼠模型的、Bleo诱导的SD大鼠PF模型(图5D)。

所有CM和EXO治疗组在维持正常肺结构方面显示出治疗效应(图5E)并且纤维化(图5f)、肺细胞凋亡和胶原沉积(图5G和5H)减少。值得注意的是，与PBS处理组相比，只有LSC-CM和LSC-EXO显著减少胶原沉积。此外，只有LSC-CM显著降低纤维化(Ashcroft评分)，使其回到如健康的假处理对照组的类似水平。αSMA的蛋白水平在治疗组中显示出不显著的下降趋势(图5I)。LSC-CM和LSC-EXO治疗减轻了肺泡上皮和血管损伤，并减少了纤维化响应，如增加的AQP5

LSC-CM和LSC-EXO疗法对MMP2和MCP-1表达的影响

为了检测对CM和EXO引发的响应的响应中涉及的潜在分子机制，检测了系统性细胞因子表达和MMP2和SMAD3的局部组织蛋白水平。与小鼠Bleo模型不同，未发现治疗动物的肺组织中MMP2蛋白水平有显著变化(图5I)。然而，在PBS组中，治疗动物的肺组织中SMAD3的蛋白水平显著上调，而通过LSC-CM和LSC-EXO治疗，这种上调得以缓解。因为细胞因子的免疫调节作用是全身性的，而不是局部的，所以对治疗动物的血清中的细胞因子水平(图6A)进行了检查。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/CLL2)被Bleo损伤显著上调，而这可以通过干细胞-CM和干细胞-EXO治疗进行挽救。

干细胞条件培养基和外泌体疗法对博来霉素诱导肺纤维化后的肺功能的影响

检查了LSC-CM和LSC-EXO治疗对受损的肺结构和纤维化的临床影响。与吸入治疗同时进行多项肺功能检查，以监测Bleo损伤后肺功能的下降以及各种治疗的任何效应。在Bleo滴注之前立即记录基线读数，在Bleo滴注后第9天(开始治疗的前一天)记录中点读数，在Bleo滴注后第17天(最后一次吸入治疗的后一天)进行终点测量(图6B)。正如预期的那样，吸气量(IC)、阻力(Rrs)、顺应性(Crs)、滞后面积和用力呼气量(FEV)与用力肺活量(FVC)之比都显示中点测量值与基线相比有所下降(分别为图6C-6E、6G、6C-6E和6G)。与此一致地，与顺应性相反的呼吸弹性阻力(Ers)在中点分析时一致地增加(图6F)。总的来说，所有Bleo动物的肺功能都如预期的那样受损，肺损伤导致组织硬度和弹性反冲(弹性阻力)增加。

在终点分析中，通过CM和EXO治疗，肺功能仅得到部分挽救。在LSC-CM、LSC-EXO或MSC-EXO治疗后，吸气量和呼吸顺应性均显著改善。呼吸阻力仅在LSC-EXO治疗后显著恢复。弹性阻力、滞后面积和FEV/FVC比值在治疗后均无明显变化。

条件培养基和外泌体疗法的毒性

除了评估CM和EXO治疗的有效性，对治疗的安全性也进行了评估。发现，所有治疗组的肝和肾功能都在可接受的范围内(图12)。在二氧化硅和Bleo研究中，对治疗动物的心脏、肾脏、肝脏和脾脏组织的组织学分析没有显示任何明显的损伤或毒性(图13)。

MicroRNA-30a、miR-99a和miR-100在LSC-EXO中高度富集

外泌体包含各种不同的RNA、蛋白质和脂质，但是自从miRNA在EXO中被发现以来，它们就引起了人们的兴趣。据信，EXO利用miRNA作为细胞间遗传交换的机制。因此，进行了LSC-EXO和MSC-EXO的总体小RNA深度测序，并分析了它们的miRNA群体的差异。

总之，在这些LSC-EXO和MSC-EXO样本中检测到了600多种独特的miRNA，这表明来自外泌体的miRNA在这些样本中可能具有许多调节作用。去除不太丰富的miRNA后，剩下142种用于下游分析(图6I和6J)。发现，总共有42种miRNA在这两种EXO类型之间差异表达(最小倍数变化为2，调整后p值<0.05)。在LSC-EXO中上调最高的miRNA中有hsa-miR-99a-5p(log2倍数变化1.25，调整后p值0.0005)和hsa-miR-100-5p(log2倍数变化1.27，调整后p值0.0005)(图6J)。它们也是LSC-EXO中最丰富的两种miRNA，是miR-99家族的成员(图6K)。与MSC-EXO相比，抗纤维化miR-30a-3p在LSC-EXO中显著上调(log2倍数变化2.28，调整后p值0.00002)。hsa-let-7a-5p(log2倍数变化1.09，调整后p值0.001)和has-let-7f-5p(log2倍数变化1.28，调整后p值0.008)在MSC-EXO样品中上调最强，是高度保守的let-7家族的一部分(图14和15)。

因此，本公开的一个方面包括药物组合物的实施方案，所述药物组合物包含肺球体细胞条件培养基或肺球体细胞分泌的治疗剂，或肺球体细胞来源的外泌体群，其量在递送至需要其的动物或人类受试者时可有效调节肺部病理状况。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述肺部病理状况是肺部肺纤维化。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，并且其中所述分离的多肽、分离的肽或分离的核酸由培养的肺球体细胞分泌。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含从肺球体细胞条件培养基中分离的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述核酸可以是miRNA。

在本公开这一方面的一些实施方案中，施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以是通过在其中培养肺球体细胞群而产生的冻干条件细胞培养基。

在本公开这一方面的一些实施方案中，通过雾化器施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可以是冻干粉。

本公开的另一方面包括生产药物组合物的方法的实施方案，所述药物组合物包含肺球体细胞条件培养基或肺球体细胞分泌的治疗剂，或肺球体细胞来源的外泌体群，所述方法包括以下步骤：(a)从动物或人类受试者的肺组织获得分离的肺干细胞群；(b)通过在细胞培养基中培养所述分离的干细胞群来产生条件细胞培养基；和(c)从条件培养基中除去培养的细胞。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括分离所述条件细胞培养基中的以下中的至少一种的步骤：(a)由培养的肺球体细胞分泌到条件细胞培养基中的分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，或者(b)由培养的肺球体细胞群体产生到条件细胞培养基中的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括冻干条件培养基的步骤。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法可以进一步包括冻干以下中的至少一种的步骤：(a)由培养的肺球体细胞分泌到条件细胞培养基中的分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，或者(b)由培养的肺球体细胞群产生到条件细胞培养基中的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述方法的冻干产品可以与药学上可接受的介质结合。

本公开的又一方面包括治疗动物或人肺系统的病理状况的方法的实施方案，其中所述方法包括向动物或人受试者的呼吸道区域施用药物组合物，所述药物组合物包含肺球体细胞条件培养基或肺球体细胞分泌的治疗剂，或肺球体细胞来源的外泌体群，其量在递送至有需要的动物或人受试者时可有效调节肺部病理状况。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述肺部病理状况是肺纤维化。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含分离的多肽、分离的肽或分离的核酸中的至少一种，并且其中所述分离的多肽、分离的肽或分离的核酸由培养的肺球体细胞分泌。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以包含从肺球体细胞条件培养基中分离的肺球体细胞来源的外泌体群。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述核酸可以是miRNA。

在本公开这一方面的一些实施方案中，施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。

在本公开这一方面的一些实施方案中，所述药物组合物可以是通过在其中培养肺球体细胞群而产生的冻干条件细胞培养基。

在本公开这一方面的一些实施方案中，通过雾化器施用于动物或人类受试者呼吸道的所述药物组合物可以是冻干粉。

应该强调的是，本公开的实施方案，特别是任何“优选”的实施方案，仅仅是实现的可能例子，仅仅是为了清楚理解本公开的原理而提出的。在实质上不脱离本公开的精神和原理的情况下，可以对本公开的上述实施方案进行许多变化和修改。所有这些修改和变化都旨在包括在本公开的范围内，并由所附权利要求保护。

下面的具体实施例应被理解为仅仅是说明性的，而不是以任何方式限制本公开的其余部分。无需进一步阐述，相信本领域技术人员可以基于本文的描述，最大程度地利用本公开。本文引用的所有出版物的全部内容通过引用并入本文。

提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供完整的公开和描述，说明如何实施本公开公开和要求保护的方法和使用组合物和化合物。已经努力确保数字的准确性(例如，数量、温度等)，但是应该考虑一些错误和偏差。除非另有说明，份数是重量份，温度是℃，压力等于或接近大气压力。标准温度和压力定义为20℃和1个大气压。

应该注意的是，比率、浓度、量和其他数值数据在本文可以用范围格式表示。应当理解，这样的范围格式是为了方便和简洁而使用的，因此，应当以灵活的方式解释为不仅包括作为范围的限制而明确列举的数值，还包括包含在该范围内的所有单个数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确列举一样。为说明起见，“约0.1％至约5％”的浓度范围应解释为不仅包括明确列举的约0.1wt％至约5wt％的浓度，还包括指示范围内的单独的浓度(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。术语“大约”可以包括±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％或更多的数值被修改。

实施例

细胞培养：从全肺样本中产生人LSC，并按照Dinh et al.,(2017)RespiratoryResearch所述进行扩增。人LSC由健康的全肺供体制备，并按图5所述进行扩增。第2-5代LSC用于所有体外和体内试验。使用前还通过流式细胞术分析细胞的适当标记物(CD90+、CD105+、CCSP+、AQP5+、ProSPC+、Epcam+、CD31-、CD34-和CD45-)。

条件培养基的收集和制备：在移除含血清培养基并用无血清培养基(IMDM)替换之前，将人LSC和MSC培养至约75％融合。第二天，细胞用新鲜IMDM洗涤6次，每次30分钟，以在培养基条件化(condition)之前耗尽细胞上的白蛋白，因为白蛋白会干扰一些实验(尤其是LC/MS/MS分析)。在将培养基(IMDM)收获并通过0.22μm过滤器过滤以除去任何细胞和细胞碎片之前，允许所述培养基条件化三天。将过滤后的CM在-80℃下储存至少24小时，或直至变成固体。使用LABCONCO FreeZone 2.5升冷冻干燥系统将冷冻的CM小瓶冷冻干燥过夜或直至样品脱水。一旦样品被冻干，就将它们储存在-20℃直到准备使用。

外泌体的分离和鉴定：外泌体是用超滤法从人LSC-CM中收集和纯化的。LSC-CM首先通过0.22μm过滤器过滤，以去除任何细胞或细胞碎片。然后将过滤后的培养基置于100kDa的MWCO超滤过滤器(Millipore)中，根据体积在5000RCF下离心10-15分钟。通过过滤离心去除任何培养基内容物或小蛋白质，并将剩余的外泌体悬浮在PBS中，然后过滤并洗涤。使用前，所有的外泌体样品都通过纳米颗粒追踪分析(NTA；NanoSight，Malvern)进行了适当大小的分析，并通过透射电子显微镜(TEM)进行了形态分析。此外，通过对已知外泌体标记物(CD63和CD81)的免疫印迹，证实了成功的外泌体分离。

动物实验：6至8周龄雄性CD1小鼠[Crl:CD1(ICR)]和CD(SD)IGS大鼠[Crl:CD(SD)]来自Charles River实验室(Massachusetts,USA)，A/J小鼠来自Jackson实验室(Maine,USA)。在CD1小鼠和CD(SD)大鼠中单次气管内注射3U/kg硫酸博来霉素(EMD；203401)溶液，并在A/J小鼠中单次口咽吸入100mg/kg二氧化硅(MIN-U-SIL-5)悬浮液，以诱导肺纤维化。博来霉素损伤后10天和二氧化硅损伤后28天开始雾化器治疗。使用雾化器(Pari Trek SPortable Compressor Nebulizer Aerosol System；047F45-LCS)连续7天每天进行约30分钟的条件培养基、外泌体或盐水吸入治疗。对动物实施安乐死，收集血液和组织，进行RNA、蛋白质和组织学检查。

大鼠肺功能测试(PFT)：肺功能的测量是在FlexiVent(SCIREQ Inc.,Montreal,加拿大)上进行的。在测量之前，用氯胺酮和赛拉嗪溶液(2∶1的比例)腹膜内注射来麻醉动物。用14号插管给动物插管。

组织学：免疫染色在固定于4％多聚甲醛(PFA)的组织载玻片(ElectronMicroscopy Sciences；15710)上进行，然后透化并用含有0.1％皂苷(Sigma-Aldrich；47036)的Dako蛋白封闭溶液(DAKO；X0909)封闭，然后进行抗体染色。细胞用抗AQP5(ab78486，Abcam)、ProSPC(ab90716，Abcam)、vWF(F3520，Sigma-Aldrich)、αSMA(ab5694，Abcam)的抗体进行染色。根据制造商的说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim,德国)对冷冻切片组织进行Tunel染色。在石蜡包埋的组织切片上进行Gomori三色染色和苏木精伊红染色。苏木精和伊红染色切片用于Ashcroft评分。Ashcroft评分是通过对一名盲法和一名非盲法评分者的评分进行平均来进行的。

蛋白质组分析：为了浓缩样品，将15ml条件培养基冻干。所述样品在24小时内干燥至完全，并重新悬浮在1ml的100mM碳酸氢铵(Sigma Aldrich)缓冲液中，pH 8.6。为进行蛋白质沉淀，向样品中加入10ml冷丙酮(Optima级，ThermoFisher Science)，在-20℃孵育过夜，然后以10,000rpm离心30分钟，以从上清液中分离沉淀的蛋白质。总蛋白浓度用Bradford测定法测定(Pierce,ThermoFisher Scientific)。

将所有样品一式三份(10μl)装载到微量滴定板上，使用Tecan Genios酶标仪在595nm的吸光度下测量，并使用BSA标准蛋白质的参考吸光度来估计蛋白质浓度。使用Wisniewski等人描述的Filter Aided Sample Preparation(FASP)方法消化沉淀的蛋白质。向截留分子量为30kDa的Vivacon过滤器(Satortorius，ThemoFisher Scientific)中加入来自每个样品的约100μg的蛋白质，在56℃下用5mM二硫苏糖醇(ThermoFisherScientific)还原30min，然后用10mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)在室温黑暗中烷基化20min。使用测序级胰蛋白酶(Promega)以1:100的胰蛋白酶与蛋白质比例在37℃过夜进行过滤器上的消化。用100mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.6)从过滤器中去除肽，真空离心蒸发溶剂，然后储存在-20℃用于进一步处理。

所有样品的LC/MS/MS分析在与LTQ Orbitrap Elite质谱仪(ThermoFisherScientific)偶联的Easy nano超高压液相色谱仪上进行。样品被注射到PepMap C18，5μm捕获柱(ThermoFisher Scientific)上，然后通过一系列梯度分离到New Objective SelfPack PicoFrit色谱柱上(内部装有3.0μm Reprosil C18固定相(Dr.Maisch GmbH))。用于分离的线性梯度为：300nl/min流速下，90分钟内，5-40％的流动相B，其中流动相A为2％乙腈/0.1％甲酸的水溶液，流动相B为0.1％甲酸的乙腈溶液。Orbitrap Elite以数据依赖模式运行，在其中选择了五个最强烈的前体进行后续破碎。前体扫描的分辨率(m/z 400-2000)设置为60,000m/z 400，目标值为1×10

原始数据文件是使用Proteome Discoverer(1.4,ThermoFisher Scientific)处理的。使用Mascot(1.4.1.14Matrix Science)在正、反智人UniProt数据库中搜索峰列表。用于鉴定胰蛋白酶肽的参数为：10ppm前体离子质量耐受性，0.01Da片段质量耐受性；多达两个缺失的切割位点；Cys的脲甲基化被设定为固定的修饰；Met的氧化被设定为可变的修饰。Scaffold(4.8.4Proteome software)用于过滤数据，量化肽/蛋白质，并进行统计分析。在肽和蛋白质阈值为95％的情况下，每个蛋白质至少需要2个肽，才能进行高可信度的鉴定。Ingenuity Proteomic Analysis(IPA,QIAGEN Redwood City)用于常见蛋白质的亚细胞定位的分类。使用Panther(通过进化关系进行蛋白质分析)和DAVID(用于注释、可视化和综合发现的数据库)对列出的常见分泌蛋白质进行分类，以探索分子功能、细胞成分和途径。

SDS-PAGE和蛋白质印迹：样品用β-巯基乙醇还原，在90℃变性5分钟。通过在4-15％三甘氨酸无染色凝胶(Bio-Rad)上进行一式三份的凝胶电泳分离蛋白质，同时使用分子量标准(Bio-Rad,Precision Plus Protein Unstained Standards MW Ladder 161-0363)。凝胶在100伏的堆电压下运行约5分钟，随后恒定为200伏。凝胶被激活，并在Bio-Rad成像仪中通过UV光可视化。

Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell系统用于湿转。将SDS-PAGE胶装配到装置中，并在滤纸之间堆叠PVDF膜。转移后，将膜在PBS-T中洗涤三次，每次5分钟，然后用PBS-T中的5％牛奶封闭1小时。对MMP2(ab86607，Abcam)、αSMA(ab5694，Abcam)、SMAD3(MA5-14939，ThermFisher Science)、CD63(nb100-77913，Novus Biologicals)、CD81(MA5-13548，ThermFisher Science)和GAPDH(MA5-15738-HRP，ThermFisher Science)用一抗在4℃孵育过夜，然后用相应的HRP偶联二抗孵育1小时。

小RNA文库的构建和测序：外泌体RNA是用市售的总外泌体RNA分离试剂盒(Qiagen的exoRNeasy Serum Plasma试剂盒)分离的。一旦分离出外泌体RNA，就通过测序进一步分析。RNA量、260/280比率和260/230比率由Nanodrop(ThermoFisher)评估。在Bioanalyzer2100上使用Agilent RNA 6000Nano Assay验证了RNA的完整性。小RNA文库是根据制造商的方案使用NEBNext.RTM Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina(NewEngland Biolabs)制备的。使用Pippen Prep(Sage Science)选择文库的大小，并使用Agilent High Sensitivity DNA试剂盒通过Bioanalyzer进行质量检查。文库通过Quant-iT.RTM dsDNA High Sensitivity Assay Kit(ThermoFisher)量化，并在IlluminaNextSeq500上使用中等输出V2试剂盒进行测序。

miRNA的作图和差异表达分析：使用标准Illumina bcl2fastq转换软件，对原始读数进行解复用和质量调整。使用mirDeep2，读数已移除接头，并使用默认参数进行聚类。然后使用Bowtie将读数与人的rRNA进行比对，剩余的未比对读数也使用Bowtie映射到miRBase 22。对于下游分析，通过要求一个miRNA在五个样品中的至少两个样品中至少有十个读段计数来过滤已鉴定的miRNA。使用edgeR和limma R包和上分位数标准化读段计数进行MSC样品和LSC样品之间的差异表达分析。如果绝对log2倍数变化大于1，并且调整后的p值(FDR)小于0.05，则认为miRNA差异表达。

统计分析：所有结果均以平均值±标准差(SD)表示。两组之间的比较采用双尾Student's t检验。使用非参数单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)比较三个或更多组，并进行额外的Bonferroni事后校正。P值≤0.05时，认为差异具有统计学意义。

表1：培养的肺球体细胞外泌体的鉴定蛋白质