比伐卢定的合成方法

摘要

活性药物成分(API)比伐卢定(Bivalirudin)是20个氨基酸的肽，其含有一个碱基和5个氨基酸残基。化学式为C98H138N24O33，且分子量为2180.3g/mol。比伐卢定也被称为Angiomax。它是被指定用作抗凝剂的直接凝血酶抑制剂。本发明提供合成比伐卢定的方法，特别是提供使用Fmoc‑Leu‑Wang树脂作为载体的通过固相肽合成的比伐卢定合成方法。该方法具有收率高、副产物少和分离纯化简单的优点，且与现有技术相比，该方法节省时间且适用于中试和工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，并且本发明特别是涉及比伐卢定的合成方法。

常规比伐卢定合成方法耗时且工艺复杂，并且不能大规模实现，且因此本领域技术人员致力于开发新的比伐卢定合成方法。

背景技术

固相肽合成(SPPS)是用于多肽合成的快速方法。然而，用于合成大量长肽如比伐卢定的常规SPPS既费时，又产生大量溶剂浪费。作为广泛使用的活性药物成分，比伐卢定是被指定用作抗凝剂的直接凝血酶抑制剂。开发用于制备大量高纯度比伐卢定的高效且经济的SPPS方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供比伐卢定的制备方法。

根据本发明的第一方面，提供用于生产比伐卢定的方法，比伐卢定通过使用固相肽合成(SPPS)来制备，其中该方法使用Fmoc-Leu-Wang树脂或Fmoc-Leu-2CT树脂、Rink酰胺ProTide(LL)树脂和ChemMatrix wang树脂作为载体进行多肽的固相合成。

此外，多肽固相合成方法中使用的偶联剂选自由2-肟氰乙酸乙酯、N,N-二异丙基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基乙胺组成的组。

此外，在Fmoc脱保护方法中，加入哌啶/N,N-二甲基甲酰胺/甲酸(优选1/4体积的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，甲酸5％-20％哌啶体积)/哌嗪，且加热条件优选借助于水浴、油浴或微波加热反应进行2至5分钟。

此外，在反应完成之后，用N,N-二甲基甲酰胺将多肽的固相合成反应中的反应物中的每个洗涤2-3次。

此外，在树脂上的多肽固相合成反应中的氨基酸缩合反应在50至120℃的温度下进行；反应时间根据温度优选为10至30分钟。

此外，进行在固相合成反应中的多肽的氨基酸缩合反应，并在进行裂解反应之前用氮气吹扫树脂。

此外，反应中加入的三氟乙酸的纯度为95％，温度为10-50℃，且裂解反应时间为1-3小时。

此外，在多肽的固相合成反应中，所使用的氨基酸的当量是树脂的摩尔量的两倍。

此外，将粗制的比伐卢定通过Pre-HPLC用100％水至100％乙腈的水/乙腈梯度在20分钟内纯化。

此外，将纯化的比伐卢定溶液通过冻干机在-50至-70℃下冻干18-48小时。

附图说明

图1是比伐卢定分子结构的示意图。

图2是制备的比伐卢定的HPLC分析。

图3是制备的比伐卢定的质谱。

具体实施方式

图1所示的比伐卢定是20个氨基酸的合成肽。现在将参考具体实施例描述本发明。必须理解的是，这些实例仅是对本发明的说明，而无意于限制本发明的范围。除非另有说明，否则百分比和份数均以重量计。除非另有说明，否则以下实例中使用的实验材料和试剂可从商业来源获得。

表1氨基酸缩写的列表

[表1]

表2化学试剂缩写的列表

[表2]

表3中间体和Fmoc保护的氨基酸的列表

[表3]

本发明提供通过固相肽合成的使用Fmoc-Leu-wang树脂的比伐卢定合成方法，包括以下步骤：

步骤1，芴基甲氧基羰基-亮氨酸-Wang树脂可直接购买(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich))，它可减少第一步的合成并加快合成效率；

步骤2：在氮气下将树脂于DMF中溶胀5至15分钟；

步骤3：在以下条件下，除去芴基甲氧基羰基氯保护基：甲酸(5％-20％哌啶体积)/哌嗪在50℃至120℃下于DMF中保持2分钟。

步骤4：制备芴基甲氧基羰基-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂：将步骤1中获得的芴基甲氧基羰基-亮氨酸-Wang树脂脱保护，用DMF洗涤，且使Fmoc-L-Tyr-(叔丁基)-OH在多肽偶联剂的条件下经缩合反应，得到芴基甲氧基羰基-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤5：制备芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂：将步骤2中获得的Fmoc-二肽脱保护并洗涤，且然后使之在肽偶联剂的条件下与Fmoc-L-谷氨酸(叔丁氧基)-OH反应，得到芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤6：制备芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将所得的芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并加入Fmoc-L-谷氨酸(叔丁氧基)-OH，且然后在肽偶联剂的条件下反应，得到芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁基(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-吡啶(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤7：制备芴基甲氧基羰基-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤，且然后在多肽偶联剂的条件下与芴基甲氧基羰基-脯氨酸-OH反应，获得芴基甲氧基羰基-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。谷氨酸-(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤8：制备芴基甲氧基羰基-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸-(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在肽偶联剂的条件下加入芴基甲氧基羰基-异亮氨酸-OH，得到芴基甲氧基羰基-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤9：制备芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将步骤6中获得的芴基甲氧基羰基-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸-(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤，且在肽偶联剂的存在下加入Fmoc-L-Glu(Otbu)-OH并使之反应，得到芴基甲氧基羰基谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤10：制备芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸-(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。向步骤7中获得的芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸-(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂加入Fmoc-L-Glu(Otbu)并使之在多肽偶联剂的条件下经受缩合反应，得到芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤11：制备芴基甲氧基羰基-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将步骤8中获得的肽芴基甲氧基羰基-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤，并在肽偶联剂的条件下使之与芴基甲氧基羰基-苯丙氨酸-OH反应，得到芴基甲氧基羰基-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤12：制备芴基甲氧基羰基天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将步骤9中获得的肽脱保护、洗涤并用芴基甲氧基羰基天冬氨酸(叔丁氧基)-OH处理，得到芴基甲氧基羰基天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤13：制备芴基甲氧基羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将步骤10中获得的肽脱保护、洗涤并在多肽偶联剂的条件下用芴基甲氧基羰基-甘氨酸-OH处理，得到芴基甲氧基羰基-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤14：制备芴基甲氧基羰基-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将步骤11中获得的肽脱保护、洗涤并在肽偶联剂的条件下用芴基甲氧基羰基-天冬酰胺(三苯甲基)-OH处理，得到芴基甲氧基羰基-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤15：制备芴基甲氧基羰基-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将步骤12中获得的肽脱保护、洗涤并在多肽偶联剂的条件下与芴基甲氧基羰基-甘氨酸-OH经受缩合反应，得到芴基甲氧基羰基-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤16：制备芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在肽偶联剂的条件下加入芴基甲氧基羰基-甘氨酸-OH，得到芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤17：制备芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在多肽偶联剂的条件下与芴基甲氧基羰基-甘氨酸-OH经受缩合反应，得到芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤18：制备芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在多肽偶联剂的条件下与芴基甲氧基羰基-甘氨酸-OH经缩合反应，得到芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤19：制备芴基甲氧基羰基-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在多肽偶联剂的条件下加入芴基甲氧基羰基-脯氨酸-OH，得到芴基甲氧基羰基-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤20：制备芴基甲氧基羰基-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在肽偶联剂的条件下加入芴基甲氧基羰基-Arg(Pbf)-OH，得到芴基甲氧基羰基-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤21：制备芴基甲氧基羰基-脯氨酸-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在肽偶联剂的条件下加入芴基甲氧基羰基-脯氨酸-OH，得到芴基甲氧基羰基-脯氨酸-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤22：制备芴基甲氧基羰基-D-Phe-脯氨酸-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂。将芴基甲氧基羰基-脯氨酸-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂脱保护、洗涤并在肽偶联剂的条件下加入芴基甲氧基羰基-D苯丙氨酸-OH，得到芴基甲氧基羰基-D-Phe-脯氨酸-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂；

步骤23：将芴基甲氧基羰基-D-Phe-脯氨酸-Arg(Pbf)-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(三苯甲基)-甘氨酸-天冬氨酸(叔丁氧基)-苯丙氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)异亮氨酸-脯氨酸-谷氨酸(叔丁氧基)-谷氨酸(叔丁氧基)-酪氨酸(叔丁基)-亮氨酸-Wang树脂洗涤并再次脱保护，得到NH

步骤24：将NH

步骤25：将裂解溶液用乙醚沉淀，并以3500-5000rpm离心，得到白色沉淀。将沉淀物洗涤，并再用乙醚离心另外3次，得到最终的沉淀物并在真空下干燥。

步骤26：将粗制的比伐卢定通过制备型HPLC用100％水至100％乙腈的水/乙腈梯度在20分钟内纯化。

步骤27：将纯化的比伐卢定溶液通过冻干机在-50至-70℃下冻干18-48小时，得到纯度高于98％的所制备比伐卢定。

本发明的优势

用于合成比伐卢定的SPPS的常规方法通常产生大量难以分离的副产物，处理费用高昂的大量废物。本方法比所用常规SPPS方法更快，产生的废物更少，且可以高产率获得比伐卢定。

实例1

肽的合成通过采用从Fmoc-Leu-Wang树脂(40g，取代容量0.67meq/g)开始的逐步Fmoc SPPS(固相肽合成)程序进行。Fmoc脱保护通过用甲酸(5％-20％哌啶体积)/哌嗪的DMF溶液进行。序列中的后续其他氨基酸按以下顺序连接：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。氨基酸的偶联和解偶联在50℃-120℃下进行2-3分钟，并通过Kaiser测试进行监控。肽的TFA裂解用TFA/TIS/H

实例2

肽的合成通过采用从Fmoc-Leu-2CT树脂(40g，取代容量0.8meq/g)开始的逐步Fmoc SPPS(固相肽合成)程序进行。将树脂转移到肽合成仪的反应容器中，并使用2摩尔过量的受保护氨基酸与甲酸(5％-20％哌啶体积)/哌嗪的DMF溶液进行合成。Fmoc脱保护反应在50℃-120℃下进行2-3分钟，重复两次。序列中的后续其他氨基酸按以下顺序连接：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。肽的TFA裂解用TFA/TIS/H

实例3

肽的合成通过采用从Fmoc-Feu-2CT树脂(40g，取代容量1.1meq/g)开始的逐步Fmoc SPPS(固相肽合成)程序进行。将树脂转移到肽合成仪的反应容器中。Fmoc脱保护通过用甲酸(5％-20％哌啶体积)/哌嗪的DMF溶液进行。Fmoc脱保护反应在50℃至120℃下进行1分钟，重复两次。序列中的后续其他氨基酸按以下顺序连接：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。氨基酸的偶联和解偶联在50℃-120℃下进行2分钟，并重复两次。肽的TFA裂解用TFA/茴香硫醚/苯酚/H

实例4

肽的合成通过采用从Fmoc-Leu-Chemmatrix树脂(40g，取代容量0.67meq/g)开始的逐步Fmoc SPPS(固相肽合成)程序进行。将树脂转移到肽合成仪的反应容器中。Fmoc脱保护通过用甲酸(5％-20％哌啶体积)/哌嗪的DMF溶液进行。Fmoc脱保护反应在50℃-120℃下进行1分钟，重复两次。序列中的后续其他氨基酸按以下顺序连接：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。氨基酸的偶联和解偶联在50℃-120℃下进行2分钟。肽的TFA裂解用TFA/茴香硫醚/苯酚/H

实例5

肽的合成通过采用从Fmoc-Feu-Wang树脂(40g，取代容量0.67meq/g)开始的逐步Fmoc SPPS(固相肽合成)程序进行。将树脂转移到肽合成仪的反应容器中。Fmoc脱保护通过用甲酸5％-20％哌啶体积)/哌嗪的DMF溶液进行。Fmoc脱保护反应在50℃-120℃下进行1分钟，重复两次。序列中的后续其他氨基酸按以下顺序连接：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-DmBGly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。氨基酸的偶联和解偶联在50℃-120℃下进行2分钟，并在第10个氨基酸之后重复两次。合成时间为4小时20分钟。肽的TFA裂解用TFA/茴香硫醚/苯酚/H

实例6

肽的合成通过采用从CEM树脂的Protide树脂(40g，取代容量0.18meq/g)开始的逐步Fmoc SPPS(固相肽合成)程序进行。将树脂转移至肽合成仪(Cem Liberty Blue)的反应容器中，并在50℃-120℃下用KI和DIPEA的DMF溶液将第一氨基酸与树脂偶联10分钟。Fmoc脱保护用甲酸5％-20％哌啶体积)/哌嗪的DMF溶液进行。Fmoc脱保护在50℃-120℃下进行1分钟，重复两次。序列中的后续其他氨基酸按以下顺序连接：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。氨基酸的偶联和解偶联在50℃-120℃下进行2分钟。肽的TFA裂解用TFA/茴香硫醚/苯酚/H

实例7

肽的合成通过采用从Fmoc-Leu-Wang或2CT树脂(40g，取代容量0.67/1.1meq/g)开始的逐步Fmoc SPPS(固相肽合成)程序进行。将树脂转移到肽合成仪的反应容器中。Fmoc脱保护用甲酸5％-20％哌啶体积)/哌嗪的DMF溶液进行。Fmoc脱保护反应在50℃-120℃下进行1分钟，重复两次。序列中的后续其他氨基酸按以下顺序连接：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。氨基酸的偶联和解偶联在50℃-120℃下进行2分钟。肽的TFA裂解用TFA/TIS/H