对中药制剂进行预处理的方法

摘要

本发明涉及对中药制剂进行预处理的方法。该方法包括如下步骤：在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，将口服固体中药制剂与无菌物料混合，接着将其研碎成均匀混合的细粉，得到中药预处理粉。该中药预处理粉用于测定其中的沙门氏菌并据此测定结果评价所述中药制剂被沙门氏菌污染的状况。沙门氏菌是使用实时荧光PCR法进行检测的，实时荧光PCR法检测沙门氏菌包括如下操作步骤：提供引物和探针，提供前增菌，采用热裂解法提取沙门氏菌DNA，测定浓度和纯度，实时荧光PCR扩增，方法学控制，结果判定与结果表述。本发明方法能够快速有效地检测药品尤其是中药制剂中的沙门氏菌的污染情况。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别是中药技术领域，涉及中药制剂的预处理方法，例如通过该预处理能够使得该中药制剂适宜进行检测，例如适宜对该中药制剂中的沙门氏菌进行检测。经过本发明方法处理中药制剂所得的处理物料，其能够快速有效地检测这些中药制剂中的沙门氏菌的污染情况。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一类常见的具有高度传染性且危害严重的革兰氏阴性杆菌，1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌在自然界中广泛分布，且在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至2年之久。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计，在世界各国的细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌致病因素有侵袭力、内毒素和肠毒素3种，临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。它们除可感染人外，还可感染很多动物包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。沙门氏菌属菌体大小(0.6～0.9)×(1～3)微米，无芽胞，一般无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。营养要求不高，分离培养常采用肠道选择鉴别培养基。生化反应对本属菌的鉴别具有重要参考意义，不液化明胶，不分解尿素，不产生吲哚，不发酵乳糖和蔗糖，能发酵葡萄糖、甘露醇和麦芽糖，大多产酸产气，少数只产酸不产气。VP试验阴性，有赖氨酸脱羧酶。DNA的G+C含量为50～53%。对热抵抗力不强，在60℃15分钟可被杀死，在5%的石炭酸中，5分钟死亡。本属菌按生化反应分为4个亚属。亚属Ⅰ是生化反应典型的和最常见的沙门氏菌；亚属Ⅱ和Ⅳ是生化反应不典型的沙门氏菌；亚属Ⅲ是亚利桑那沙门氏菌。

中药制剂是以中药材为原料，在中医药理论指导下，为了预防及治疗疾病的需要，按规定的处方和制剂工艺将其加工制成一定剂型的中药制品。中药以植物药居多，故有“诸药以草为本”的说法。由于中药材主要来源于天然药及其加工品，包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物。而沙门氏菌又广泛分布于动植物体当中，且大量丸散膏丹的处方中常有原粉入药，因此，检测中药制剂中的沙门氏菌是评价药品质量、保障药品安全的重要手段。《中国药典》2015版四部通则1107非无菌药品微生物限度标准中明确规定，对含药材原粉的中药口服制剂及含脏器提取物的口服制剂均要求不得检出沙门氏菌(10g)。

中国药典2015版四部通则1106中明确了沙门氏菌检查的微生物培养检查法，采用该方法进行检查，供试品需接种至适宜体积胰酪大豆胨液体培养基中，混匀后培养18~24小时；然后取上述培养物0.1ml接种至10ml的RV沙门增菌液体培养基中，培养18~24小时；再取少量RV沙门氏菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，培养18~48小时；如有疑似菌落生长，用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18~24小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。若上述步骤鉴定出阳性菌，还需进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门氏菌。上述鉴定过程需要将培养物依次接种至4种不同的培养基中，操作繁琐且耗时长，仅培养阶段就需要72~120小时。另外，沙门氏菌的检出还可能受到多种外界因素干扰，如药品在生产过程中，经常受到加热、干燥等加工步骤的影响，所污染的沙门氏菌可能受到损伤或呈休眠状态，导致不易检出；药品及防腐剂可能会抑制沙门氏菌的繁殖，导致不易检出；此外，多次接种操作还易引入外源性污染，影响检验结果的准确性。虽然这些方法本身证明是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。因此，在通常需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，难以适用。

实时荧光PCR(Real Time Fluorescence PCR，RT-PCR)法是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新检测技术，实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行分析的方法。荧光PCR的出现，极大地简化了检测的过程，而且真正实现了绝对定量。实时荧光PCR技术与常规PCR相比，它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点，成为分子生物学研究中的重要工具。

目前荧光PCR技术已在临床疾病诊断及疗效评价、动物疾病检测、食品安全及生命科学研究等领域广泛应用。在肝炎、艾滋病、结核、人乳头瘤病毒检测等病毒性疾病临床诊断领域，已广泛采用荧光PCR技术，诊断结果快速、准确；颜善活等建立了肺炎链球菌实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测方法，用于肺炎链球菌检测和流行病学调查，检测结果特异可靠，检测敏感性可达100fg，对200例临床标本检测的阳性率为21%，而培养法仅为8%，差异显著，且荧光PCR法更快速高效；修金生等建立了猪流行性腹泻病毒野毒株和弱毒疫苗株实时荧光PCR方法，结合熔解曲线可直接鉴别猪群中猪流行性腹泻病毒的感染情况和程度，可对免疫猪群野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断。

尽管荧光PCR技术具有一定的检测高效性，然而目前尚未见有采用实时荧光PCR技术有效地检测中药制剂中的沙门氏菌的方法。因此，本领域技术人员期待有一种使用实时荧光PCR技术快速有效地检测中药制剂中的沙门氏菌的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用实时荧光PCR法快速有效地检测中药制剂中的沙门氏菌的方法。已经出人意料地发现，本发明的方案呈现优良的技术效果。本发明基于此类发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了对中药制剂进行预处理的方法，所述方法包括如下步骤：在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，将10重量份口服固体中药制剂、1.25重量份甘氨酸和0.5重量份氯化钾混合，接着将其研碎成均匀混合的细粉，得到中药预处理粉；所述甘氨酸和氯化钾是预先经历无菌处理的。

根据本发明第一方面的方法，其中所述中药制剂选自：健胃消食片、金果含片、女金胶囊、金水宝胶囊、乌鸡白凤丸、大活络丸、四逆散中的一种。

根据本发明第一方面的方法，其所获得的中药预处理粉用于测定其中的沙门氏菌并据此测定结果评价所述中药制剂被沙门氏菌污染的状况。

根据本发明第一方面的方法，其中测定中药预处理粉中的沙门氏菌是使用实时荧光PCR法进行检测的，实时荧光PCR法检测沙门氏菌包括如下操作步骤：

步骤一、提供引物和探针

沙门氏菌实时荧光PCR法检测用的引物和探针的序列为：

5’端引物即上游引物：5’-ACAACCTAACTTCTGCGCCA-3’，

3’端引物即下游引物：5’-TCAGGTTACCGTGGAGGCTA-3’，

探针：5’-FAM-CCTTTGTCGTTTTCACCTCGCTGGCTA-BHQ1-3’，

各引物和探针分别加入适量灭菌去离子水即ddH

步骤二、提供前增菌

供试品溶液：取相当于包含中药制剂10g的中药预混物适量，置无菌锥形瓶中，加入TSB培养基至200mL，混匀，用超声波处理10min，得到供试品溶液；

供试品阳性对照菌液：向上述供试品溶液中加入1mL小于100cfu/mL的沙门氏菌菌液，得到供试品阳性对照菌液；

阳性对照菌液：无菌锥形瓶中加入TSB培养基至200mL，再加入1mL小于100cfu/mL的沙门氏菌菌液，得到阳性对照菌液；

阴性对照：以TSB培养基作为阴性对照；

上述溶液分别置于36℃恒温培养箱中过夜培养16h后，作为实验菌液，用于后续DNA提取；

步骤三、采用热裂解法提取沙门氏菌DNA

分别取上述增菌的实验菌液即供试品溶液、供试品阳性对照菌液、阳性对照菌液、阴性对照各1mL，置1.5mL无菌离心管中，1000rpm离心30s，上清液转移至另一1.5mL无菌离心管中，以12000rpm离心2min，弃上清，菌体沉淀以200μL无菌水重悬，于95℃水浴锅加热10min，再以12000rpm离心5min，取上清液作为PCR反应模板DNA溶液；检测完浓度及纯度后，-20℃保存备用；

步骤四、DNA浓度和纯度的测定

以紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度；

步骤五、实时荧光PCR扩增

反应体系总体积为25μL，按以下比例配制PCR反应液：模板DNA溶液1μL(例如其中包含10ng~100ng的DNA)、Taq酶(例如5U/μL)0.2μL、10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mix 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、探针0.5μL、增补液1μL、ddH2O适量至25μL，

PCR反应条件：

i、95℃：3min预变性；

ii、95℃：10s变性；

iii、64℃：30s退火，采集荧光；以上ii、iii两步进行40次循环；

iv、停止；

检测过程中同时设置阳性对照、供试品阳性对照、阴性对照、空白对照；

计算PCR反应总管数N，按照上述反应体系配制N+1份PCR反应液于一个1.5ml无菌离心管中，充分振荡混匀后，低速离心10s，分装至PCR 8联反应管中，在阳性对照管中加入阳性对照DNA提取液，供试品管中加入供试品DNA提取液，供试品阳性对照管加入供试品阳性对照DNA提取液，阴性对照管加入阴性对照提取液，空白对照管中加入等体积水代替DNA提取液，盖上反应管盖；将PCR反应管中的液体充分混匀后，去除反应管中的气泡后，低速离心30s，备用；

打开荧光定量PCR仪，放入PCR反应管，关闭盖子，运行程序；待程序运行结束后，分析实验结果，确定阈值线，输出包括FAM荧光信号和Ct值的参数的报告；

步骤六、方法学控制：

以下条件有一条不满足时，结果视为无效：

a、空白对照：无FAM荧光信号检出，

b、阴性对照：无FAM荧光信号检出，

c、阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，

d、供试品阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0；

步骤七、结果判定与结果表述：

a、如Ct值≤35.0，则判定为被检样品即所述中药制剂阳性，表述为“检出沙门氏菌”；

b、如Ct值≥40.0，则判定为被检样品即所述中药制剂阴性，表述为“未检出沙门氏菌”；

c、如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次，如再次扩增后Ct值仍为35.0＜Ct值＜40.0，则判定为被检样品即所述中药制剂可疑，表述为“沙门氏菌可疑”。

根据本发明第一方面所述的方法，其中，以紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度的操作方法是：超微量紫外/可见分光光度计开机后，进入检测界面，在检测孔中加入2ul空白溶液，点击参比检测调零，调零后用吸水纸将检测孔中的液体吸干；然后加入2ul待测样品溶液，点击样品检测后，读取并记录得到的DNA浓度值及A280/A260比值，用吸水纸将检测孔中的液体吸干，重复上述操作方法继续检测下一个样品。

根据本发明第一方面所述的方法，所述增补液是包含2µmol/L亚硒酸钠和6mg/ml果糖的水溶液。

根据本发明第一方面所述的方法，所述PCR反应液中的模板DNA溶液每1μL中包含10ng~100ng的DNA。

根据本发明第一方面所述的方法，所述Taq酶的浓度为5U/μL。

根据本发明第一方面所述的方法，所述dNTP Mix中包含的四种脱氧核苷酸的浓度均为10mM。

根据本发明第一方面所述的方法，其检测的DNA浓度在1.5×10

根据本发明第一方面所述的方法，其检测出沙门氏菌而不受其它细菌基因的干扰的特异性大于99%。

根据本发明第一方面所述的方法，其检测10g样品中的沙门氏菌的灵敏度可达1cfu。

根据本发明第一方面所述的方法，其检测10g样品中的沙门氏菌的灵敏度小于1cfu。

进一步的，本发明第二方面提供了一种PCR反应液，其每25μL中包含：模板DNA溶液1μL(其中包含10ng~100ng的DNA)、Taq酶(5U/μL)0.2μL、10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mix 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、探针0.5μL、包含2µmol/L亚硒酸钠和6mg/ml果糖的水溶液1μL、ddH2O适量至25μL。

进一步的，本发明第三方面提供了一种中药预处理粉，其包含口服固体中药制剂、甘氨酸和氯化钾，所述中药预处理粉是按照如下步骤的方法制备得到的：在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，将10重量份口服固体中药制剂、1.25重量份甘氨酸和0.5重量份氯化钾混合，接着将其研碎成均匀混合的细粉，得到中药预处理粉；所述甘氨酸和氯化钾是预先经历无菌处理的。

根据本发明第三方面的中药预处理粉，其中所述中药制剂选自：健胃消食片、金果含片、女金胶囊、金水宝胶囊、乌鸡白凤丸、大活络丸、四逆散中的一种。

本发明第四方面提供了本发明第三方面任一项所述的中药预处理粉在制备用于检测中药制剂沙门氏菌污染状况的检品中的用途；其中检测中药制剂沙门氏菌污染状况的方法采用本发明第一方面所述的实时荧光PCR法。

在本发明的方法步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的实例例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明呈现如本发明说明书所述的技术效果。

附图说明

图1：沙门氏菌DNA溶液10倍梯度稀释检测结果。

图2：特异性检测结果，图中，m为19株沙门菌，n为43株非沙门菌与阴性对照。

图3：18批中药制剂检测结果，图中，X为阳性对照，Y为供试品阳性对照。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

本发明提供了一种中药制剂中沙门氏菌实时荧光PCR法检测的方法，为实现中药制剂中沙门氏菌的快速检测鉴定提供参考。本发明方法的基本原理和操作过程是，中药制剂加入至胰酪大豆胨液体培养基中进行增菌培养，取增菌液提取试样中基因组DNA，以该DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有沙门氏菌。本发明实例中使用的甘氨酸和氯化钾是预先经历无菌处理的，尤其是未污染沙门菌。

制备例1：制备中药预处理粉

在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，分别取表2所述18批中药制剂之一批，按中药制剂：甘氨酸：氯化钾以重量比10：1.25：0.5的比例混合，接着将其研碎成均匀混合的细粉，得到不同产品不同批次的中药预处理粉。

制备例2：制备中药预处理粉

在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，分别取表2所述18批中药制剂之一批，按中药制剂：甘氨酸以重量比10：1.25的比例混合，接着将其研碎成均匀混合的细粉，得到不同产品不同批次的中药预处理粉。

制备例3：制备中药预处理粉

在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，分别取表2所述18批中药制剂之一批，按中药制剂：氯化钾以重量比10：0.5的比例混合，接着将其研碎成均匀混合的细粉，得到不同产品不同批次的中药预处理粉。

制备例4：制备中药预处理粉

在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，分别取表2所述18批中药制剂之一批，将其研碎成均匀的细粉，得到不同产品不同批次的中药预处理粉。

参照实施例1之“2、提供前增菌”中的供试品溶液的制备方法，取一种相当于包含中药制剂10g的制备例1~4的各种中药预混物适量，置无菌锥形瓶中，加入TSB培养基至200mL，混匀，用超声波处理10min，得到供试品溶液。已经出人预料地发现，经过超声波匀化处理之后：制备例2~4的全部预处理粉所得供试品溶液均出现大量不可消除的泡沫(均可预估观察到在锥形瓶中存在50~120ml泡沫，例如制备例4处理四逆散所得供试品溶液中产生大约95ml泡沫)；而制备例1的全部预处理粉所得供试品溶液均未出现泡沫或仅出现微量散在漂浮的泡沫(均可预估观察到在锥形瓶中小于2ml泡沫，例如制备例1处理四逆散所得供试品溶液无泡沫)。这些泡沫对于后续的测定是极为不利的，尤其是由于吸附能力的不同，泡沫部分沾附的微生物量比与供试品溶液主体溶液中的微生物量大0.5~2个数量级，这一点在本发明人的额外试验中得以发现。从这个意义上讲，制备例1中将中药制剂与甘氨酸和氯化钾进行预处理，有利于对中药制剂中的沙门菌进行测定。

实施例1：实时荧光PCR法检测中药制剂中的沙门氏菌

本实施例所涉及的中药预混物，如未另外说明，使用的是以制备例1方法处理获得的。

1、提供引物和探针

沙门氏菌实时荧光PCR法检测用的引物和探针的序列为：

5’端引物(亦称为上游引物)：5’-ACAACCTAACTTCTGCGCCA-3’，

3’端引物(亦称为下游引物)：5’-TCAGGTTACCGTGGAGGCTA-3’，

探针：5’-FAM-CCTTTGTCGTTTTCACCTCGCTGGCTA-BHQ1-3’，

各引物和探针分别加入适量灭菌去离子水(ddH

这些引物和探针的序列可以容易地通过公知的引物合成方法合成得到，亦可以从商用途径获得，例如委托商用引物合成公司进行合成。

另外，提供一些常用的培养基与试剂(列出主要的)：

生理盐水，胰酪大豆胨液体培养基(TSB)，Taq DNA Polymerase，dNTP Mix，10×PCRBuffer，ddH

另外，提供一些常用的仪器和设备荧光定量PCR仪CFX96Touch(美国Bio-Rad伯乐)，超微量紫外/可见分光光度计Spectra Max Quick Drop(美谷分子)，台式高速冷冻离心机5424R(艾本德股份有限公司)，高压蒸汽灭菌器YXQ-LS-50SⅡ(上海博迅实业医疗器械有限公司)，微波炉格兰仕D8523CTL-2W(顺德格兰仕微波炉电器有限公司)，电子天平Sartorius T601-L(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，生物安全柜Heal Force-900C(美国赛默飞世尔科技有限公司)，细菌培养箱PYX-DHS(上海跃进医疗器械厂)，恒温水浴锅、涡旋振荡器、掌上离心机、微量移液器等等。

2、提供前增菌

供试品溶液：取相当于包含中药制剂10g的中药预混物适量，置无菌锥形瓶中，加入TSB培养基至200mL，混匀，用超声波处理10min，得到供试品溶液；

供试品阳性对照菌液：向上述供试品溶液中加入1mL小于100cfu/mL的沙门氏菌菌液，得到供试品阳性对照菌液；

阳性对照菌液：无菌锥形瓶中加入TSB培养基至200mL，再加入1mL小于100cfu/mL的沙门氏菌菌液，得到阳性对照菌液；

阴性对照：以TSB培养基作为阴性对照；

上述溶液分别置于36℃恒温培养箱中过夜培养(16h)后，作为实验菌液，用于后续DNA提取；

3、采用热裂解法提取沙门氏菌DNA

分别取上述增菌的实验菌液即供试品溶液、供试品阳性对照菌液、阳性对照菌液、阴性对照各1mL，置1.5mL无菌离心管中，1000rpm离心30s，上清液转移至另一1.5mL无菌离心管中，以12000rpm离心2min，弃上清，菌体沉淀以200μL无菌水重悬，于95℃水浴锅加热10min，再以12000rpm离心5min，取上清液作为PCR反应模板DNA溶液；检测完浓度及纯度后，-20℃保存备用；

4、DNA浓度和纯度的测定

以紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度(常规操作方法是：超微量紫外/可见分光光度计开机后，进入检测界面，在检测孔中加入2ul空白溶液，点击参比检测调零，调零后用吸水纸将检测孔中的液体吸干；然后加入2ul待测样品溶液，点击样品检测后，读取并记录得到的DNA浓度值及A280/A260比值，用吸水纸将检测孔中的液体吸干，重复上述操作方法继续检测下一个样品)；

5、实时荧光PCR扩增

反应体系总体积为25μL，按以下比例配制PCR反应液：模板DNA溶液1μL(其中包含10ng~100ng的DNA)、Taq酶(5U/μL)0.2μL、10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mix 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、探针0.5μL、增补液1μL、ddH2O适量至25μL；

PCR反应条件：

i、95℃：3min预变性；

ii、95℃：10s变性；

iii、64℃：30s退火，采集荧光；以上ii、iii两步进行40次循环；

iv、停止；

检测过程中同时设置阳性对照、供试品阳性对照、阴性对照、空白对照；

上述增补液是包含2µmol/L亚硒酸钠和6mg/ml果糖的水溶液；

计算PCR反应总管数N，按照上述反应体系配制N+1份PCR反应液于一个1.5ml无菌离心管中，充分振荡混匀后，低速离心10s，分装至PCR 8联反应管中，在阳性对照管中加入阳性对照DNA提取液，供试品管中加入供试品DNA提取液，供试品阳性对照管加入供试品阳性对照DNA提取液，阴性对照管加入阴性对照提取液，空白对照管中加入等体积水代替DNA提取液，盖上反应管盖；将PCR反应管中的液体充分混匀后，去除反应管中的气泡后，低速离心30s，备用。

打开荧光定量PCR仪，放入PCR反应管，关闭盖子，运行程序；待程序运行结束后，分析实验结果，确定阈值线，输出包括FAM荧光信号和Ct值的参数的报告；

6、方法学控制：

以下条件有一条不满足时，结果视为无效：

a、空白对照：无FAM荧光信号检出，

b、阴性对照：无FAM荧光信号检出，

c、阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，

d、供试品阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0；

7、结果判定与结果表述：

a、如Ct值≤35.0，则判定为被检样品即所述中药制剂阳性，表述为“检出沙门氏菌”；

b、如Ct值≥40.0，则判定为被检样品即所述中药制剂阴性，表述为“未检出沙门氏菌”；

c、如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次，如再次扩增后Ct值仍为35.0＜Ct值＜40.0，则判定为被检样品即所述中药制剂可疑，表述为“沙门氏菌可疑”。

实施例2：实时荧光PCR法的方法学评价

为证明本研究中建立的方法适用于中药制剂中沙门氏菌的快速检测，需要对所建立的方法进行了相应的方法学评价研究，包括检测线性范围、检测特异性、检测灵敏度及该方法的实际应用效果评价等等。

本实施例2针对实施例1记载的实时荧光PCR法进行方法学评价。

1、使用菌株

本实施例2使用到以下表1所示的名称和来源的19株沙沙门氏菌和43株非沙门氏菌。

表1：

2、检测线性范围

取乙型副伤寒沙门氏菌阳性对照菌液2mL，按实施例1所述DNA提取法提取DNA后，以超微量紫外可见分光光度计检测核酸浓度及质量。并以该DNA溶液为母液，用无菌水进行10倍梯度稀释，共稀释9个梯度，取上述DNA溶液各2μL，每个浓度两个平行重复，按实施例1所述检测方法检测。分析检测结果，并以CT值为纵坐标，DNA浓度对数值为横坐标进行线性回归分析，评估方法检测线性范围。

结果：阳性对照菌液提取DNA后，以超微量紫外可见分光光度计检测得到核酸浓度为1526μg/mL，A260/280比值为2.096。以该DNA溶液10倍梯度稀释后进行实时荧光定量PCR检测的结果见图1A，各稀释级的平均CT值为：原液(13.12)、10

从图1A可以看出，该检测方法能够准确检测到10

线性试验结果表明实施例1的方法学优良。

3、检测特异性

照实施例1的方法，将上文表格所列19株沙门氏菌和43株非沙门氏菌分别接种至200mL的TSB中，置于36℃恒温培养箱中培养24h后，按DNA提取法提取DNA后，进行检测，以考察分析方法的检测特异性。

19株沙门氏菌及43株非沙门氏菌的检测结果见图2，可见19株沙门氏菌均有典型的S形荧光增长曲线，且CT值均小于22，而43株非沙门氏菌均无荧光增长曲线，说明本方法采用的引物探针能够有针对性的检测出沙门氏菌而不受其它细菌基因的干扰，特异性为100%。

4、方法灵敏度

取过夜培养的乙型副伤寒沙门氏菌菌液1mL，以无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，共稀释10个浓度，各稀释级分别取1mL涂布2个TSA平板(0.5mL/皿)，置于36℃恒温培养箱中培养24h后，点计各平板菌落数，计算菌液浓度。同时将原液及各稀释级菌液1mL分别接种至200mL TSB培养基中，分别置于36℃恒温培养箱中过夜培养(16h)，按实施例1所述方法提取DNA后，进行检测，以评估方法检测灵敏度。

结果：通过平板计数得到过夜培养菌液浓度为4.6×10

本实施例2的结果表明，本发明实施例1方法具有优良的方法学特征，完全能够满足中药制剂中的沙门氏菌的测定要求。

实施例3：使用本发明实时荧光PCR法检测中药制剂中的沙门氏菌

如实施例2所记载的，本发明实施例1方法具有优良的方法学特征，完全能够满足中药制剂中的沙门氏菌的测定要求。基于这些工作，本实施例3中，以18批市售中药制剂(包括片剂8批，丸剂6批，胶囊剂3批，散剂1批，详见表2)按《中国药典》规定需进行沙门氏菌检验的中药制剂为研究对象，按实施例1的方法制备供试液，分别按实施例1所建方法及《中国药典》2015年版四部通则之“1106非无菌产品微生物限度检査：控制菌检査法”节中的方法同时进行检查，评估方法的实际应用效果。

结果：18批中药制剂的实时荧光定量PCR检测结果见图3，阳性对照菌液及所有18批供试品阳性对照菌液均有典型的S形荧光增长曲线，说明18批样品均对乙型副伤寒沙门氏菌的生长无抑制作用；同时所有供试品溶液及阴性对照均无荧光增长曲线，说明18批样品均无沙门氏菌污染。这些检测结果均与按药典方法检测的结果一致(见表2)，说明本发明实施例2建立的方法能够满足中药制剂中沙门氏菌检测的需要，可作为药典方法的有效补充。

表2：两种方法检测18批中药制剂结果比较

表中，-：未检出沙门氏菌，+：检出沙门氏菌；多批以同一符号表示结果时，表示这些批次的结果均与该符号相同。

如上文所述的，根据本发明实施例1~3的结果可见，本发明方法用于检查中药制剂中的沙门氏菌具有优良的效果。《中国药典》2015版中采用细菌培养检查法检查沙门氏菌，2020版药典四部通则中虽增加了分子生物学检查法，但主要是针对中药等的种属鉴定及细菌鉴定，并不涉及控制菌的检查，而中药制剂中沙门氏菌的PCR检测方法目前尚鲜见报导。本研究采用一次增菌，热裂解法提取DNA后，以实时荧光定量PCR法检测中药制剂中的沙门氏菌，检测最快能在18h内完成，以乙型副伤寒沙门氏菌DNA溶液为模板的检测线性范围为1.5×10

另外，在一个补充的实施例(其在本发明中称为实施例1A)中，参照实施例1的方法，不同的仅是所用的增补液中未添加亚硒酸钠；结果：通过平板计数得到过夜培养菌液浓度为7.4×10

中药制剂组方复杂，成分繁多，很多成分可能会对沙门氏菌的生长有抑制作用。因此，与药典检测方法一样，阳性与阴性对照的设置对控制检测结果的质量十分重要，为避免出现假阴性结果，需同时设置阳性对照与供试品阳性对照。一但出现阳性对照结果为阳性，而供试品阳性对照结果为阴性的情况，得到的结果很可能就是假阴性，表明该制剂可能会抑制沙门氏菌的增殖，出现这种情况应进行方法学验证，必要时可采用薄膜过滤法冲洗等消除制剂对沙门氏菌的生长抑制作用后，再进行增菌检测。本发明检测了18批中药制剂，均未发现药物对沙门氏菌生长的明显抑制作用，表明本发明方法是可靠的。另外，在检测中增加内参对照，也可以避免检测过程中出现假阴性的情况。

本研究建立了一种中药制剂中沙门氏菌的实时荧光定量PCR检测方法，采用特异性的引物探针，可特异的检测出样品中是否污染沙门氏菌，不受样品中其它微生物及抑菌成分的干扰，从而省去纯培养步骤；同时，利用实时荧光定量PCR技术的高灵敏度、自动化程度高、反应快速等特点，样本进行过夜增菌后便可用于检测，将检测周期缩短至24h以内；此外，由于减少了传代步骤且PCR反应在封闭体系中进行，不易与外界产生交叉污染。因此，建立中药制剂沙门氏菌实时荧光PCR检查法，可以克服传统细菌培养检查法中存在的诸多弊端，作为一种快检方法，节约药品微生物检验中的时间及劳动力成本，同时，该方法经适当调整后还可用于中药饮片、食品等领域沙门氏菌检测。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 江西省药品检验检测研究院

<120> 对中药制剂进行预处理的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acaacctaac ttctgcgcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaggttacc gtggaggcta 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctttgtcgt tttcacctcg ctggcta 27