研究PHN松果体切除大鼠模型构建用脑室置管及其构建方法

摘要

本发明涉及动物模型构建技术领域，具体是涉及研究PHN松果体切除大鼠模型构建用脑室置管及其构建方法，所述脑室置管由外管、内芯和内针组成，外管一端套接由粘结头，粘结头远离外管的一端为空心连接杆，空心连接杆远离外管的一端开有轴向滑槽，轴向滑槽的尾端切向设置有横向滑槽。本发明优化了动物模型中最关键的脑室置管结构，减小置管体积的同时，改善了置管的稳定性，降低了操作难度，相较于现有置管，本发明设计的脑室置管可以对外管的长度根据不同批次大鼠的体型进行调节，从而保证插入深度准确，提高了实验精度和大鼠成活率。本发明构建的大鼠模型可以有效地研究MT于PHN的疼痛方面的影响，表明本发明构建的大鼠模型效果显著。

说明书

技术领域

本发明涉及动物模型构建技术领域，具体是涉及研究PHN松果体切除大鼠模型构建用脑室置管及其构建方法。

背景技术

动物模型是指在生物医学研究中所建立的可模拟人类疾病或异常功能状态的动物实验对象和材料。

HSV-1和VZV是诱发痛觉超敏的常用方法，来揭示发病、持续时间和病变程度的应答差异性。接种VZV后，痛觉超敏的幅度是基线的30-40％，接种HSV-1后的痛觉超敏幅度是基线的80％，在接种两种病毒动物中的相关行为表现也有显著差异。由于病毒感染扩散到中枢神经系统，HSV-1能够引起皮肤损伤和后肢麻痹，而在感染VZV的动物中没有出现病变或瘫痪的现象。故本发明选择HSV-1来诱导PHN症状，模拟了可观测的人类PHN患者的疼痛反应。

现有的用于研究PHN的松果体切除大鼠模型为了节省成本，所用脑室置管大部分为自制，或者购买于瑞沃德公司，这种置管体积对于大鼠手术而言过大且不方便操作，因此，大鼠术后的成活率不高，严重影响了大鼠模型的构建。

发明内容

为了实现以上目的，本发明提供了一种研究PHN的松果体切除大鼠模型构建方法，可以清楚地发现“MT在缓解PHN的疼痛方面具有明显优势，且侧脑室注射纳洛酮、4P-PDOT和L-精氨酸能够消除MT的镇痛作用，表明阿片受体、褪黑素受体和NO相关信号通路可能参与MT的镇痛作用”这一现象，表明本发明构建的大鼠模型效果显著，具体的技术方案如下：

一、脑室置管的结构

本发明设计的脑室置管，包括由外管、内芯和内针组成的脑室置管；所述外管一端套接由粘结头，所述粘结头远离外管的一端为空心连接杆，所述空心连接杆远离外管的一端开有轴向滑槽，所述轴向滑槽的尾端切向设置有横向滑槽；所述粘结头靠近外管的一端为三瓣螺栓，所述三瓣螺栓上套有螺帽。

所述三瓣螺栓沿空心连接杆至外管方向自然翘起，外径逐渐增大。当螺帽逐渐拧紧时，三瓣螺栓会被迫收紧，从而能够对置管进行位置固定。因此，相较于现有置管，本发明设计的脑室置管可以对外管的长度根据不同批次大鼠的体型进行调节，从而保证插入深度准确，提高了实验精度和大鼠成活率。

所述三瓣螺栓的三个分瓣底端均设置有粘结板，所述粘结板表面设置有漏孔，底面设置有阳纹。粘结板可增大脑室置管与大鼠颅骨表面的接触面积，增强生物胶水对二者的粘结力。且粘结板上的漏孔能够方便生物胶水漏下，而无需改变已经定好位置的外管。相较于现有的脑室置管而言，更方便操作人员对置管进行固定，这种步骤上的优化能够大大提升手术后大鼠的成活率。

所述内芯一端设置有第一连接头；所述第一连接头靠近内芯端侧壁设置有卡翅。通过卡翅结构能够方便地对内芯和外管进行连接、断开操作。这种结构相较于现有的螺帽结构而言，体积更小，术后置管更不容易被大鼠的活动影响，避免了置管偏移甚至脱落的风险。

所述内针一端设置有第二连接头,；所述第二连接头靠近内针端侧壁设置有卡翅，远离内针端连接有导管。通过卡翅结构能够方便地对内芯和外管进行连接、断开操作。

所述内芯和内针的外径相同，且均小于外管的内径。

本发明使用的外管与30G针管内外径参数相同，导管与PE10导管的参数相同。

二、动物模型的构建

本发明设计的脑室置管构建研究PHN松果体切除大鼠模型的方法，主要包括以下步骤：

S1、将预处理后的Wistar大鼠随机分为非治疗组和治疗组；

S11、将所述步骤S1中非治疗组大鼠分为：A实验组：摘除松果体后接种HSV-1；A1对照组：作假手术处理后接种HSV-1；A2对照组：作假手术处理后接种热灭活HSV-1；A3对照组：摘除松果体后接种热灭活HSV-1；

S2、对治疗组大鼠实施与所述步骤S11中实验组大鼠相同的手术处理；

S3、对经过步骤S2手术处理后的大鼠使用所述脑室置管进行脑室置管手术；

S4、对经过步骤S3手术处理7天后的大鼠进行药物干预。

进一步地，所述步骤S1中，大鼠的预处理流程为：3月龄、体重在190～210g之间的Wistar大鼠，在22℃、通风良好的环境下提供饲料和饮水；大鼠光照设备为40瓦日光色荧光灯，光照黑暗周期比为12h：12h。

进一步地，所述步骤S11中，HSV-1或灭活的HSV-1的具体接种方式为：用针头划开大鼠前肢胫骨外皮，将20μL滴度为1×10

进一步地，所述步骤S11中，大鼠松果体切摘除的具体方式为：用2％戊巴比妥钠(剂量为40mg/kg)注射大鼠腹腔，3～5分钟后大鼠进入麻醉状态，用立体定向仪固定大鼠头部，以人字缝尖为中心，切开皮肤和皮下组织后，使用微型磨钻打开颅盖，暴露上矢状窦和横窦交界的y形状接头，用细钳去除松果体，清除骨头碎片后缝合皮肤。

进一步地，所述步骤S3中，进行脑室置管手术的具体步骤如下：

S31、脑室置管在术前用10％溴苄烷铵浸泡24h，并用无菌生理盐水冲洗3次；

S32、大鼠术前12h禁食，使用剂量为40mg/kg的2％戊巴比妥对大鼠腹腔进行注射麻醉；

S33、大鼠固定，术区消毒后，头皮正中切口，清楚暴露前囟；

S34、根据George Paxinos大鼠脑定位图定位脑区，插入脑室置管的；确认脑脊液外流后，封闭所述脑室置管，并使用生物胶水固定；

S35、缝合大鼠手术创面并涂抹红霉素软膏。

进一步地，所述步骤S4中，进行药物干预的大鼠随机分为四组：

B正常组；

B1腹腔注射PHN+x MT组，x表示注射量：

B11：PHN+30mg/kg MT、B12：PHN+60mg/kg MT、B13：PHN+120mg/kg MT、B14：PHN；

B2侧脑室注射PHN+x MT组，x表示注射量：

B21：PHN+0.25mg/kg MT、B22：PHN+0.5mg/kg MT、B23：PHN+1.0mg/kg MT、B24：PHN；

B3：侧脑室注射10μg X+120mg/kg MT组，X表示注射药物种类：

B31：10μg纳洛酮+120mg/kg MT、B32：10μg 4P-PDOT+120mg/kg MT、B33：80μg L精氨酸+120mg/kg MT、B34：120mg/kg MT。

进一步地，所述B31组的具体操作方式为：先在大鼠侧脑室注射纳洛酮、4P-PDOT或L-精氨酸，10min后再在大鼠腹腔注射MT。

进一步地，经过药物干预后大鼠的机械性痛阈值测定方法测定方法具体为：将大鼠置于网状悬浮板上，适应环境20分钟后，将测试探针垂直施加机械刺激到后足，持续5s。

进一步地，经过药物干预后大鼠的缩足潜伏期测定方法测定方法具体为：将大鼠置于实验环境适应20分钟后，后足暴露在热辐射热痛觉测试仪灯束下，通过三次测量的平均值来确定基线潜伏期，将辐射热的红外强度基准线设为1，持续20秒。

与现有的研究PHN的松果体切除大鼠模型相比，本发明的有益效果是：

(1)通过本发明构建的大鼠模型可以有效地研究MT于PHN的疼痛方面的影响，表明本发明构建的大鼠模型效果显著。

(2)本发明优化了动物模型中最关键的脑室置管结构，减小置管体积的同时，改善了置管的稳定性，降低了操作难度，能够有效提升大鼠术后的成活率。

(3)相较于现有置管，本发明设计的脑室置管可以对外管的长度根据不同批次大鼠的体型进行调节，从而保证插入深度准确，提高了实验精度和大鼠成活率。

附图说明

图1是本发明大鼠的热痛潜伏期变化图；

图2是本发明大鼠对0.6g von Frey灯丝机械性痛觉过敏的反应柱状图

图3是本发明大鼠对0.4g von Frey灯丝机械性痛觉过敏的反应柱状图；

图4是本发明测试的HSV-1DNA的表达图

图5是本发明脑室置管的外观图；

图6是本发明脑室置管的结构图；

图7是本发明脑室置管的内芯的结构图；

图8是本发明脑室置管的内针的结构图。

图中：1-脑室置管、11-外管、111-粘接头、1111-空心连接杆、11112-轴向滑槽、11113-横向滑槽、1112-三瓣螺栓、1113-粘结板、11131-漏孔、112-螺帽、12-内芯、121-第一连接头、122-卡翅、13-内针、131-第二连接头、132-导管。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的方式和取得的效果，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚和完整地描述。

具体的实施例一主要是对脑室置管1的结构进行阐明。

本发明设计的脑室置管1，包括由外管11、内芯12和内针13组成的脑室置管1；所述外管11一端套接由粘结头111，所述粘结头111远离外管11的一端为空心连接杆1111，所述空心连接杆1111远离外管11的一端开有轴向滑槽11112，所述轴向滑槽11112的尾端切向设置有横向滑槽11113；所述粘结头111靠近外管11的一端为三瓣螺栓1112，所述三瓣螺栓1112上套有螺帽112。

具体的，所述三瓣螺栓1112沿空心连接杆1111至外管11方向自然翘起，外径逐渐增大。当螺帽112逐渐拧紧时，三瓣螺栓1112会被迫收紧，从而能够对置管1进行位置固定。因此，相较于现有置管，本发明设计的脑室置管可以对外管11的长度根据不同批次大鼠的体型进行调节，从而保证插入深度准确，提高了实验精度和大鼠成活率。

具体的，所述三瓣螺栓1112的三个分瓣底端均设置有粘结板1113，所述粘结板1113表面设置有漏孔11131，底面设置有阳纹。粘结板1113可增大脑室置管1与大鼠颅骨表面的接触面积，增强生物胶水对二者的粘结力。且粘结板1113上的漏孔11131能够方便生物胶水漏下，而无需改变已经定好位置的外管11。相较于现有的脑室置管而言，更方便操作人员对置管进行固定，这种步骤上的优化能够大大提升手术后大鼠的成活率。

具体的，所述内芯12一端设置有第一连接头121；所述第一连接头121靠近内芯12端侧壁设置有卡翅122。通过卡翅122结构能够方便地对内芯12和外管11进行连接、断开操作。这种结构相较于现有的螺帽结构而言，体积更小，术后置管更不容易被大鼠的活动影响，避免了置管偏移甚至脱落的风险。

具体的，所述内针13一端设置有第二连接头131,；所述第二连接头131靠近内针13端侧壁设置有卡翅122，远离内针13端连接有导管132。通过卡翅122结构能够方便地对内芯12和外管11进行连接、断开操作。

具体的，所述内芯12和内针13的外径相同，且均小于外管11的内径。

具体的，本发明使用的外管11与30G针管内外径参数相同，本发明使用的导管132与PE10导管的参数相同。

实施例二

实施例二是以实施例一中脑室置管1的结构为基础进行动物模型构建的，具体内容如下：

1、实验动物

88只健康成年(3月龄)雄性或雌性Wistar大鼠，每只体重约200g，饲养在22℃的环境下，正常提供饲料和饮水。大鼠光照条件为40瓦日光色荧光灯，放在一个特制尺寸、通风良好的位置，光照黑暗周期比为12h：12h，提供约400勒克斯的能量。以上所有操作流程均经过贵阳医学院实验动物保护和使用委员会批准。

2、构建动物模型

S1、将准备好的Wistar大鼠随机分为非治疗组(40只)和治疗组(48只)；

S11、将所述步骤S1中非治疗组大鼠平均分为四组：A实验组：摘除松果体后接种HSV-1；A1对照组：作假手术处理后接种HSV-1；A2对照组：作假手术处理后接种热灭活HSV-1；A3对照组：摘除松果体后接种热灭活HSV-1；

S2、对治疗组大鼠实施与所述步骤S11中实验组大鼠相同的手术处理；

S3、对经过步骤S2手术处理后的大鼠使用脑室置管进行脑室置管手术；

S31、脑室置管在术前用10％溴苄烷铵浸泡24h，并用无菌生理盐水冲洗3次；

S32、大鼠术前12h禁食，使用40mg/kg量的2％戊巴比妥对大鼠腹腔进行注射麻醉；

S33、大鼠固定，术区消毒后，头皮正中切口，清楚暴露前囟；

S34、根据George Paxinos大鼠脑定位图定位脑区，插入脑室置管1的；确认脑脊液外流后，封闭所述脑室置管1，并使用生物胶水固定；

S35、缝合大鼠手术创面并涂抹红霉素软膏；

S4、对经过步骤S3手术处理7天后的大鼠平均分为四组，进行药物干预：

B正常组；

B1腹腔注射PHN+x MT组，x表示注射量：

B11：PHN+30mg/kg MT、B12：PHN+60mg/kg MT、B13：PHN+120mg/kg MT、B14：PHN；

B2侧脑室注射PHN+x MT组，x表示注射量：

B21：PHN+0.25mg/kg MT、B22：PHN+0.5mg/kg MT、B23：PHN+1.0mg/kg MT、B24：PHN；

B3：侧脑室注射10μg X+120mg/kg MT组，X表示注射药物种类：

B31：10μg纳洛酮+120mg/kg MT、B32：10μg 4P-PDOT+120mg/kg MT、B33：80μg L精氨酸+120mg/kg MT、B34：120mg/kg MT。

具体的，所述B31组的具体操作方式为：先在大鼠侧脑室注射纳洛酮、4P-PDOT或L-精氨酸，10min后再在大鼠腹腔注射MT。

具体的，HSV-1或灭活的HSV-1的具体接种方式为：用针头划开大鼠前肢胫骨外皮，将20μL滴度为1×10

具体的，大鼠松果体切除术的具体方式为：

用戊巴比妥钠(剂量为40mg/kg)注射大鼠腹腔，3到5分钟后大鼠进入麻醉状态，用立体定向仪固定大鼠头部，以人字缝尖为中心，切开皮肤和皮下组织后，使用微型磨钻打开颅盖，暴露上矢状窦和横窦交界的y形状接头，用细钳去除松果体，清除骨头碎片后缝合皮肤。

实施例三

实施例三是以实施例一中脑室置管1的结构为基础进行叙述的，旨在阐明大鼠的机械性痛阈值测定方法。

将大鼠分别置于网状悬浮板上，适应环境20分钟后，将测试探针垂直施加0.6g或4.0g的机械刺激到后足，持续5s。根据大鼠的反应排序如下：0，无反应；1，远离von Frey探针；2，畏缩或舔后爪。每只后爪隔3min后施加相同强度的刺激，共计给予6次刺激，平均值作为疼痛相关评分。实验中，当Von Frey探针刺激大鼠时，由于不易区分疼痛相关反应和行走行为，疼痛相关评分为0.5或更高时可视为痛觉超敏，用4.0g的力刺激对照组大鼠时，疼痛相关评分为0.5甚至更低。因此，当大鼠疼痛相关评分大于或等于1.17时视为有痛觉过敏，可作为PHN症状治疗。第30天评估大鼠PHN的发病率。

实施例四

实验例四是以实施例二中构建的大鼠模型为基础进行叙述的，旨在阐明大鼠的热缩足潜伏期测定方法。

大鼠热缩足潜伏期是通过使用红外线热辐射热痛觉测试仪测定，具体过程如下：将大鼠置于实验环境适应20分钟后，后足暴露在热辐射热痛觉测试仪灯束下，通过三次测量的平均值来确定基线潜伏期，将辐射热的红外强度基准线设为1，正常条件约20秒。

实施例五

实验例五是以实施例二中构建的大鼠模型为基础进行叙述的，旨在阐明大鼠RT-PCR的测定方法。本实施例中，所用引物是由上海生物工程股份有限公司合成。

取PHN大鼠脊髓、海马和下丘脑组织进行RT-PCR检测，采用2

δ阿片受体正向序列：5’-GAATCGTCCGGTACACTAAGG-3’；

反向序列：5’-GTCACTGCCATGACCGATG-3’；

MT2受体正向序列：5’-ACAGTGCGACCTACCACCGAG-3；

反向序列：5’-CAGGAGCCCGTAGACAATAGC-3；

GAPDH正向序列：5’-GAGTCTACTGGCGTCTTCACC-3’；

反向序列：5’-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’。

实施例六

实验例六是以实施例二中构建的大鼠模型为基础进行叙述的，旨在阐明NO含量的测定方法。

取大鼠脑组织和脊髓组织，加入预冷生理盐水按照1：9配制成10％匀浆(冰上操作)，离心后取上清液。用考马斯蓝蛋白测定试剂盒检测蛋白质含量，硝酸还原酶法测定NO含量。

实验例一

实验例一是以实施例二中的构建方法为基础进行叙述的，旨在阐明不同组间大鼠皮肤的变化。

A实验组接种HSV-1后，4-6天出疹，7-9天达到高峰，第10天时开始被治愈。A1对照组出现相似症状，但程度较轻。A2对照组和A3对照组的大鼠皮肤未出现相似的变化。

第30天，A实验组PHN的发生率为90％，A1对照组发生率为40％，A2对照组和A3对照组未观察到PHN发生。

实验例二

实验例二是以实施例三、四中的测定方法为基础进行叙述的，旨在阐明HSV-1诱导松果体切除大鼠产生明显痛觉超敏和痛觉过敏的结果。

参见图1，与A2对照组或A3对照组相比，A1对照组的大鼠后爪接种HSV-1后热刺激缩足潜伏期缩短，产生明显的触觉超敏和机械性痛觉过敏，对0.6g或4.0g von-Frey有反应，应答得分远高于A2对照组或A3对照组(p<0.05)。松果体切除大鼠痛觉超敏的发生和峰值与A1对照组的大鼠相似，但疼痛程度增加(参见图2、3)，但差异不显著。

实验例三

实验例三是以实施例五中的测定方法为基础进行叙述的，旨在阐明大鼠HSV-1DNA的检测结果。

参见图4，在A实验组和A1对照组大鼠的背根神经节中均检测到HSV-1DNA，A2对照组和A3对照组均未检测到HSV-1DNA。

实验例四

实验例四是以实施例四中的测定方法为基础进行叙述的，旨在阐明大鼠的热痛潜伏期变化。

如图2所示，PHN大鼠的热痛潜伏期为17.38±3.83天，对照组的热痛潜伏期为40.54±3.83天。两组间的热痛潜伏期有显著性差异，而PHN大鼠的热痛潜伏期缩短(P＜0.05)。

实验例五

实验例五是以实施例二中的大鼠模型为基础进行叙述的，旨在阐明腹腔和侧脑室注射MT对PHN大鼠疼痛行为的影响。

测定MT给药前、给药后的热痛潜伏期(30、60和120mg/kg，ip；0.25、0.5和1.0mg/kg，icv)。结果表明，大鼠的热痛潜伏期随着MT的剂量变化呈现依赖性增加，腹腔注射(120mg/kg)和侧脑室注射(1.0mg/kg)均显著增加热痛潜伏期(P<0.05)，侧脑室注射MT(1.0mg/kg)40分钟后达到最高值。

实验例六

实验例六是以实施例二中的大鼠模型为基础进行叙述的，旨在阐明侧脑室注射纳洛酮、4P-PDOT和L-精氨酸对PHN大鼠疼痛行为的影响。

PHN大鼠腹腔注射MT(120mg/kg)20min、40min、80min和120min的热痛潜伏期分别为32.20±0.91、40.81±5.20、44.4±3.31和46.16±1.22。侧脑室注射纳洛酮(10μg)、4P-PDOT(10μg)和L-精氨酸(80μg)40min后的热痛潜伏期分别为29.18±2.45、23.30±2.14和27.07±1.10。与MT治疗相比，这些疗法均能显著降低疼痛(P<0.05)，说明纳洛酮、4P-PDOT和L-精氨酸可逆转MT的镇痛作用。

实验例六

实验例六是以实施例五中的测定方法为基础进行叙述的，旨在阐明δ受体和MT2受体在大鼠的不同组织中的表达水平。

对照组的大鼠脊髓、下丘脑、海马组织中δ受体和MT2受体表达水平明显低于PHN组(P<0.05)，PHN+MT组(120mg/kg，ip)脊髓、下丘脑、海马组织中δ受体和MT2受体表达水平显著高于PHN组(P<0.05)。

PHN发生后，中枢神经系统δ阿片受体和MT2受体表达水平在降低，腹腔注射MT后使得δ阿片受体和MT2受体表达水平升高，而NO含量下降，我们推测MT2受体和δ阿片受体可能通过cAMP信号通路发挥镇痛作用。侧脑室注射高选择性MT2受体拮抗剂4P-PDOT能显著拮抗大鼠疼痛阈值，MT2受体表达水平的变化与δ阿片受体的变化一致，与Ambriz Tututi

实验例七

实验例七是以实施例二中的大鼠模型为基础进行叙述的，旨在阐明大鼠脑组织和脊髓组织中NO含量变化。

对照组的脑组织和脊髓组织NO含量高于PHN组(P<0.05)，PHN组的大鼠脑组织和脊髓组织NO含量高于PHN+MT组(120mg/kg)(P<0.05)。

PHN的发生会使神经受损，初级传入神经末梢释放的神经肽P物质明显增加，激活神经受体后增加了脊髓和脑组织中NO的合成，实验发现注射MT后会降低NO含量，侧脑室注射L-精氨酸可以明显拮抗MT的镇痛作用，故MT可能通过L-arginine-NO-cGMP途径发挥镇痛作用。NOS是内源性NO产生的主要限速酶，可分为诱导型、神经元型和内皮型，通常有一种或几种NOS亚型参与神经病理性疼痛的形成和维持。本研究中，具体哪些NOS亚型参与了PHN疼痛的调节还有待进一步研究。PHN能激活脊髓角中NMDA受体促进细胞内Ca2

综上所述，通过本发明构建的大鼠模型可以有效地研究MT于PHN的疼痛方面的影响，表明本发明构建的大鼠模型具有显著效果。