一种土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的制备方法及其应用，选用调查土壤所处的植物群落生境下典型凋落物，直接采集凋落物表层下的未分解层多点的混合样品1 kg左右，用塑封袋装好，带回实验室，采用剪刀将凋落物剪碎，按照凋落物与蒸馏水的重量比1:15混合到三角瓶中，利用摇床振荡30 min后，静置10 min，用纱布过滤，其滤液即为凋落物浸提液。通过对已有土壤微生物中细菌、真菌和放线菌培养基配方其余药品不变的情况下，用凋落物浸提液替换10%的蒸馏水用量，经高温灭菌后，即可制成培养基，本发明的方法成本低廉，制作简便，可显著地提高可培养微生物多样性，为土壤可培养微生物分离培养及后续相关研究提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于土壤微生物培养分离研究技术领域，具体地涉及一种土壤可培养微生物培养基制备及应用，同时还涉及土壤微生物培养分离研究中的延伸性研究设计。

背景技术

微生物是土壤重要的生物组分，是土壤生态系统元素地球化学循环的重要驱动力。土壤微生物的生物多样性十分丰富，尽管目前采用微生物非培养技术如高通量测序技术，可以帮助我们了解土壤微生物群落组成结构和多样性等方面的信息，但由于目前已经培养分离的土壤微生物不足自然界实际物种丰度的1％，这对极大地制约着人们对土壤微生物的生物学特性和生态功能与过程等方面的深入认识。因此，不断加强土壤微生物的培养分离和不同微生物物种的生理、生化、生长等生物学特性以及其发挥生态功能等方面的研究，仍然是当今土壤微生物学研究中非常重要且必要的基础性研究工作。

目前，一方面，由于微生物非培养技术在研究土壤微生物可较大提高研究效率、节约人力成本和数据信息丰富等原因，越来越多的土壤微生物研究倾向于选择微生物非培养技术如二代测序和三代测序技术手段开展土壤微生物研究。另一方面，大量采用培养方式研究土壤微生物多样性的研究中，多为简单地选择采用较为成熟培养基配方开展研究，往往忽视了通过改进培养基配方来提升土壤微生物可培养数量方面的探索研究，这与我们希望得到更多土壤微生物具体物种的生理、生化、生长等生物学特性以及其发挥生态功能等方面信息迫切需求构成了较大的矛盾。因此，探索不同土壤微生物培养分离研究技术方法显得尤为重要。

现有技术缺陷：随着对土壤微生物多样性了解的深入，土壤微生物物种的生理、生化、生长等生物学特性以及其发挥生态功能等方面信息的需求极为迫切；因此通过提高土壤微生物培养研究技术方法，已成为土壤微生物学和微生物生态学等领域的重要基础性研究内容。

发明内容

针对目前采用培养方式研究土壤微生物多样性的研究中，多简单地选择采用较为成熟培养基配方，忽视通过改进培养基配方来提升土壤微生物可培养数量方面的探索研究的问题。本发明的目的在于提供一种土壤微生物凋落物浸提液添加培养基制备方法及应用的技术方案，其操作简便有效，成本低廉，效果优良。

本发明是一种土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的制备方法，该方法选用调查土壤所处的植物群落生境下典型凋落物，直接采集凋落物表层下的未分解层(或分别按未分解层和半分解层)5点或者6点的混合样品，用塑封袋装好，带回实验室，采用剪刀将凋落物剪碎，按照凋落物与蒸馏水的重量比1:15混合到三角瓶中，利用摇床振荡30-45min后，静置10-30min，用多层纱布过滤，其滤液即为凋落物浸提液。通过对已有土壤微生物中细菌、真菌和放线菌培养基配方其余药品不变的情况下，用凋落物浸提液替换10％的蒸馏水用量，经高温灭菌后，即可制成培养基。

上述的土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的制备方法，具体步骤是：

(1)土壤样品采集与预处理：根据研究需要选取典型研究样地，用土钻按6点采样法，采集6点混合土壤样品装入塑封袋，利用保鲜盒将土壤样品带回实验室；将土壤鲜样过2mm土筛，充分混匀后，按四分法取300克土壤放入塑封袋，在4℃冰箱内保存，备用；

(2)凋落物采集及浸提液制备：在步骤(1)中选取的研究样地中，按空间离散随机方式选取6个凋落物调查20cm×20cm小样方，按未分解层和半分解层分别收集6点凋落物混合样品，装入塑料袋后带回实验室，用烘箱60℃恒温烘至干重不变后，称重记录凋落物干重；将干燥后的凋落物充分混匀后，抽取30克烘干后凋落物，采用剪刀将凋落物剪碎，按照凋落物与蒸馏水的重量比1：15混合到三角瓶中，利用摇床振荡30min后，静置10min，用多层纱布过滤，其滤液即为凋落物浸提液；

(3)培养基制备：根据试验目的，选取具体土壤微生物类群相关培养基配方，用凋落物浸提液替换培养基配方中蒸馏水用量10％，保持培养基配方其余药品不变，经121℃高温灭菌30min后，即可制成相应凋落物添加培养基。

一种土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的应用，根据试验目的，选取具体土壤，制备不同浓度梯度的土壤溶液，通过涂布平板法或混合平板法接种土壤溶液进行恒温黑暗条件下培养，按照培养菌落计数法原则，以平均菌落数乘以稀释倍数的方式进行计数。

上述的土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的应用，测定土壤中细菌数量时，采用10

上述的土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的应用，测定真菌数量时，采用10

上述的土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基的应用，测定放线菌时，采用10

本发明有益效果：

1、本发明的土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基制备方法可以提高目前已有土壤可培养微生物的测定效果，并且能满足更多土壤微生物具体物种的生理、生化、生长等生物学特性以及其发挥生态功能等方面信息迫切需求。

2、本发明操作简便，成本低廉，为土壤微生物的深入研究提供技术支撑。

附图说明

图1为本发明凋落物浸提液制备流程图；

图2为本发明添加凋落物浸提液培养基制备流程图；

图3为本发明可培养微生物的深入研究思路图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对依据本发明提出的一种土壤微生物的凋落物浸提液添加培养基制备与应用的具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。

通过选取3个马尾松群落样地的土壤微生物为研究对象，开展了土壤微生物的常规培养基与添加凋落物浸提液培养基对比分析。

具体步骤是：

步骤1、马尾松群落的土壤样品采集与预处理：根据研究需要选取3个典型马尾松群落样地，在每块样地建立20m×20m调查样方，样方内，用土钻按6点采样法，采集6点混合土壤样品装入塑封袋，利用保鲜盒将土壤样品待会实验室；将土壤鲜样过2mm土筛，充分混匀后，按四分法取300g土壤放入塑封袋，在4℃冰箱内保存，备用。

步骤2、马尾松群落的凋落物采集及浸提液制备：在马尾松群落调查样方中，按空间离散随机方式选取6个凋落物调查20cm×20cm小样方，按未分解层和半分解层分别收集6点凋落物混合样品，装入塑料袋后带回实验室，用烘箱60℃恒温烘至干重不变后，称重记录凋落物干重；将干燥后的凋落物充分混匀后，抽取30克烘干后凋落物，采用剪刀将凋落物剪碎，按照凋落物与蒸馏水的重量比1：15混合到三角瓶中，利用摇床振荡30min后，静置10min，用多层纱布过滤，其滤液即为凋落物浸提液。

步骤3、培养基制备：根据试验目的，选取具体土壤微生物类群相关培养基配方，制作常规培养基；同时，采用凋落物浸提液替换常规培养基配方中蒸馏水用量10％，保持培养基配方其余药品不变，经121℃高温灭菌30min后，即可制成相应凋落物添加培养基。

步骤4、土壤微生物培养与计数：根据试验目的，选取具体土壤，制备不同浓度梯度的土壤溶液，其中测定土壤中细菌数量时，采用10

表1常规培养基与添加凋落物培养基可培养微生物试验结果

表2常规培养基与添加凋落物培养基可培养微生物试验T检验结果

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。