莲花氏烷型生物碱类化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明属于医药技术领域，涉及莲花氏烷型生物碱类化合物及其制备方法和用途，具体涉及5个莲花氏烷型生物碱类化合物及其制备方法和应用。所述化合物的结构如下：R1、R2、R3、R4为氢、C1‑C4烷基、肉桂酰基、3，4‑二甲氧基苯甲酰基；所述的化合物可以用于制备预防或治疗神经退行性疾病、癌症药物。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及莲花氏烷型生物碱类化合物及其制备方法和用途，具体涉及5个莲花氏烷型生物碱类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

千金藤(Stephania japonica(Thunb.)Miers)为防己科(Menispermaceae)千金藤属(Stephania)植物，又名公老鼠藤、无膏药、小青藤、野桃草等，常见于我国四川、湖北、湖南、及江浙一带。味苦性寒，有祛风活络、利尿消肿等功效。

近年来，对千金藤中生物碱的结构和生物活性报道相对较少。本发明提供了从千金藤中分离鉴定的5个新生物碱的结构、制备方法及其在开发抗肿瘤、治疗神经退行性疾病中药物中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一系列莲花氏烷型生物碱类化合物及其制备方法和新的医药用途。

本发明提供的莲花氏烷类生物碱类化合物及其药学上可接受的盐、异构体或溶剂化物，其具有如下结构：

R

R

本发明优选如下5个具体化合物

本发明还提供了所述莲花氏烷型生物碱1,2,3,4和5的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)千金藤(Stephania japonica(Thunb.)Miers)用乙醇/甲醇经过冷浸或回流提取，回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇粗提物经水溶解后，用有机溶剂萃取，所述有机溶剂为石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇进行萃取；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂、石油醚和丙酮混合溶剂、氯仿和丙酮混合溶剂、二氯甲烷和丙酮混合溶剂、氯仿和甲醇混合溶剂、二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得100:1～100:25流分经ODS色谱分离，以甲醇和水混合溶剂、或乙腈和水混合溶剂为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇和水1:9～9:1、乙腈和水1:9～8:2流分经制备型HPLC-UV色谱进一步分离，以甲醇和水混合溶剂4:6～8:2，或乙腈和水混合溶剂2:8～6:4为流动相洗脱，得到生物碱1,2,3,4和5。

本发明提供的所述的莲花氏烷型生物碱类化合物1,2,3,4和5的制备方法，步骤(1)中所述的提取方法为冷浸或热回流法提取3-6次，每次24h，所用溶剂为：50％～100％的乙醇或甲醇，优选为70％～95％。药材：溶剂重量体积比为1:5～1:15g/mL，优选1:8～1:12g/mL。

本发明提供的所述的莲花氏烷型生物碱类化合物1,2,3,4和5的制备方法，步骤(2)中所述的有机溶剂萃取法，采用水溶解粗提物，按照体积比1:1，分别使用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3-6次，减压回收以上有机溶剂。

本发明提供的所述的莲花氏烷型生物碱1,2,3,4和5的制备方法，步骤(3)中所述洗脱溶剂石油醚和乙酸乙酯混合溶剂、石油醚和丙酮混合溶剂的体积比例为100：10～1：1，优选10:1～10:5；二氯甲烷和丙酮混合溶剂、氯仿和丙酮混合溶剂、二氯甲烷和甲醇混合溶剂、或氯仿和甲醇的混合溶剂的体积比例为100：0～100：15，优选100:3～100:8。

本发明提供的莲花氏烷型生物碱1,2,3,4和5的制备方法，步骤(4)中所述甲醇和水混合溶剂体积比为1:9～9:1，优选3:7～8:2；乙腈和水混合溶剂的体积比例为1：9～8：2，优选1:9～6:4。

本发明提供的所述莲花氏烷型生物碱1,2,3,4和5的制备方法，步骤(5)中所述流动相甲醇和水混合溶剂的比例为4:6～8:2，优选5:5～8:2；乙腈和水混合溶剂的比例为2:8～6:4，优选2:8～5:5。

本发明以LPS诱导的小胶质细胞过度活化模型，对制备得到的新莲花氏烷型生物碱类化合物1,2,3,4和5的抗神经炎症活性进行了评价。结果显示，化合物1,2,3和4能够显著抑制LPS诱导的BV-2小胶质细胞释放NO。

本发明评价了制备得到的新生物碱1,2,3,4和5的抗肺癌活性。结果显示，这些化合物在不影响肺癌细胞A549存活率的情况下，表现出一定的抑制A549细胞生长的作用，从而对肺癌起到预防和治疗的作用。因此，本发明中制备的新生物碱可在开发抗肺癌药物方面应用。

本发明评价了制备得到的新生物碱1,2,3,4和5的抗肝癌活性。结果显示，本发明制备得到的新生物碱在不影响肝癌细胞HepG2存活率的情况下，可显著抑制HepG2细胞的生长，从而对肝癌起到预防和治疗的作用。因此，本发明中制备的新生物碱可在开发抗肝癌药物方面应用。

本发明首次提供了以千金藤全株为原料，制备、鉴定的5个莲花氏烷型生物碱及其制备方法，并系统评价了其在制备预防或治疗神经退行性疾病、癌症药物中的应用。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

(1)千金藤1kg用75％乙醇冷浸3次，每次24h(每次用量:12L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每种溶剂萃取5次，得到萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:3,100:7,100:10,100:15,100:20洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得100:7～100:15流分经ODS色谱分离，以甲醇/水1:9,3:7,5:5,7:3,9:1为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇:水(3:7～9:1)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以甲醇:水(63：37)为流动相洗脱得到化合物1(t

根据新莲花氏烷型生物碱1,2,3,4和5的理化性质和波谱数据鉴定了其结构。

莲花氏烷型生物碱1的结构鉴定数据如下：

无色结晶(CH

莲花氏烷型生物碱2的结构鉴定数据如下：

白色粉末(CH

莲花氏烷型生物碱3的结构鉴定数据如下：

白色粉末(CH

莲花氏烷型生物碱4的结构鉴定数据如下：

黄色粉末(CH

莲花氏烷型生物碱5的结构鉴定数据如下：

白色粉末(CH

表1莲花氏烷型生物碱1，2，3，4和5的

表2莲花氏烷型生物碱1,2,3,4和5的

实施例2

(1)千金藤1kg用85％甲醇冷浸4次，每次24h(每次用量:15L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取4次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:3,100:7,100:10,100:15,100:20洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得100:7～100:15流分经ODS色谱分离，以甲醇/水1:9,3:7,5:5,7:3,9:1为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇:水(3:7～9:1)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以甲醇:水(63：37)为流动相洗脱得到化合物1(t

化合物鉴定数据参见实施例1。

实施例3

(1)千金藤1kg用100％乙醇热回流4次，每次24h(每次用量:12L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取5次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以二氯甲烷和甲醇混合溶剂100:0,100:1,100:3,100:5,100:7,100:10洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得100:1～100:7流分经ODS色谱分离，以乙腈/水1:9,3:7,6:4,8:2为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得乙腈:水(3:7～8:2)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以乙腈:水(45：55)为流动相洗脱得到化合物1(t

化合物鉴定数据参见实施例1。

实施例4

(1)千金藤1kg用65％甲醇热回流5次，每次24h(每次用量:10L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取6次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以氯仿和甲醇混合溶剂100:0,100:1,100:3,100:5,100:7,100:10洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得100:1～100:7流分经ODS色谱分离，以甲醇/水1:9,3:7,5:5,7:3,9:1为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得甲醇:水(3:7～9:1)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以甲醇:水(63：37)为流动相洗脱得到化合物1(t

化合物鉴定数据参见实施例1。

实施例5

(1)千金藤1kg用50％乙醇热回流6次，每次24h(每次用量:8L)，减压回收提取液得粗提物；

(2)步骤(1)所得乙醇提取物经水溶解，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯和正丁醇萃取，提取液与萃取溶剂的体积比为1:1，每个溶剂萃取5次，得到不同极性部位的萃取物；

(3)步骤(2)所得萃取物经硅胶柱色谱法分离，以二氯甲烷和甲醇混合溶剂100:0,100:1,100:3,100:5,100:7,100:10洗脱；

(4)上述步骤(3)中所得100:1～100:7流分经ODS色谱分离，以乙腈/水1:9,3:7,6:4,8:2为流动相梯度洗脱；

(5)上述步骤(4)中所得乙腈:水(3:7～8:2)流分经HPLC-UV色谱分离，210nm检测，流速为4mL/min，以乙腈:水(45：55)为流动相洗脱得到化合物1(t

化合物鉴定数据参见实施例1。

实施例6实施例1-5中制备得到的新莲花氏烷型生物碱类化合物1,2,3,4的抑制小胶质细胞过度活化活性测试

(1)实验原理：小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等。本实验通过建立体外LPS激活BV2小胶质细胞异常活化的筛选模型，以激活小胶质细胞释放NO为指标，评价千金藤提取物和5个莲花氏烷型生物碱1,2,3,4和5的抗炎活性。

(2)实验方法：

①小鼠小胶质细胞系BV2的培养

细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以DMDM培养基作为基础配制成内含10％胎牛血清培养液。小胶质细胞以约4×10

②药物配制方法

5种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为100mM，储存于-20℃。临用时用DMEM培养液将其进行稀释，依次稀释为100μM、30μM、10μM、1μM。DMSO终浓度<1‰。

③Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用

取对数生长期的BV2小胶质细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至0.2×10

④MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响

取对数生长期培养的BV2小胶质细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至0.2×10

细胞成活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％⑤统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

⑥IC

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC

(3)实验结果：见表3

表3新生物碱1，2，3，4和5的小胶质细胞活化作用实验结果

由实验结果可知，实施例1-5中制备得到的新生物碱1-5均不影响小胶质细胞BV2的存活率，化合物1-5均能不同程度抑制过度活化的BV2细胞释放NO，从而对神经炎症起到预防和治疗的作用。而新莲花氏烷型生物碱1，2，3和4可显著抑制过度活化的BV2细胞释放NO，从而对神经炎症起到预防和治疗的作用，其作用更明显。

实施例7.实施例1-5中制备得到的生物碱类化合物1,2,3,4和5的抑制HepG2细胞作用

(1)实验原理

MTT法是以还原基质中的四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)为基础的反应。其原理为琥珀酸脱氢酶使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)从而沉积在细胞中。利用酶标仪在570nm波长处测定结晶紫的吸收值来间接反映活细胞数量。近些年来，该方法已广泛应用于大量的抗肿瘤药物筛选，细胞毒性试验等。

(2)实验方法：

①人肝癌细胞HepG2的培养

将冻存于液氮中的HepG2细胞系复苏，连续传代3次，待细胞生长状态良好且稳定。取生长状态良好的三种细胞，分别接种于不同的96孔板，每孔2.0*10

②药物配制方法

5种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为100mM，储存于-20℃。

③MTT检测化合物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用

将储备液用培养基稀释为梯度浓度：0、10、25、50、100μM，将96孔板中的培养液吸出，加入用培养液稀释后的样品，对HepG2细胞进行加药处理，置于5％CO

将孵育后的细胞与2mg/ml的MTT于37℃下共孵育4h，移除上清液，每孔加入100μLDMSO溶解结晶。轻微震荡至结晶完全溶解，在酶标仪570nm下测定光密度(OD)值，以空白对照组(OD)值＝100％，计算各组细胞抑制率。细胞抑制率％＝[1-(加药组OD值的平均值/对照组OD值的平均值)]×100％。

④统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

⑤IC

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC

表4新生物碱1，2，3，4和5的HepG2抑制作用实验结果

由实验结果可知，实施例1-5中制备得到的新生物碱类化合物1-5均不影响肺癌细胞系HepG2的存活率，化合物1-5均能不同程度地抑制HepG2细胞的生长，从而对肝癌起到预防和治疗的作用。

实施例8.实施例1-5中制备得到的生物碱1,2,3,4和5的抑制A549细胞作用

(1)实验原理

MTT法是以还原基质中的四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)为基础的反应。其原理为琥珀酸脱氢酶使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)从而沉积在细胞中。利用酶标仪在570nm波长处测定结晶紫的吸收值来间接反映活细胞数量。近些年来，该方法已广泛应用于大量的抗肿瘤药物筛选，细胞毒性试验等。

(2)实验方法：

①肺癌细胞系A549的培养

将冻存于液氮中的A549细胞系复苏，连续传代3次，待细胞生长状态良好且稳定。取生长状态良好的三种细胞，分别接种于不同的96孔板，每孔2.0*10

②药物配制方法

6种化合物均为粉末状，用DMSO溶解。配成母液，浓度为100mM，储存于-20℃。

③MTT检测化合物对肺癌细胞系A549的抑制作用

将储备液用培养基稀释为梯度浓度：0、10、25、50、100μM，将96孔板中的培养液吸出，加入用培养液稀释后的样品，对A549细胞进行加药处理，置于5％CO

将孵育后的细胞与2mg/ml的MTT于37℃下共孵育4h，移除上清液，每孔加入100μLDMSO溶解结晶。轻微震荡至结晶完全溶解，在酶标仪570nm下测定光密度(OD)值，以空白对照组(OD)值＝100％，计算各组细胞抑制率。细胞抑制率％＝[1-(加药组OD值的平均值/对照组OD值的平均值)]×100％。

④统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，评价整体性差异，组间均数采用One-Way ANOVA分析法进行方差齐性分析，并结合Dunnett’s test分析方法进行组间比较。多样本方差齐性检验采用Levene检验，当p>0.05，方差是齐的，采用Dunnett’s双侧T检验多组间均数的差异，当p<0.05，方差不齐，采用Dunnett T3检验多组间均数的差异。

⑤IC

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC

表5新生物碱1,2,3,4和5的A549抑制作用实验结果

由实验结果可知，在1μM-100μM范围内，实施例1-5中制备得到的新生物碱1-5对A549细胞的生长具有明显的抑制作用，具有开发预防和治疗肺癌的潜力。