一种利用鸡CEBPζ基因鉴定鸡腹部脂肪量的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种利用鸡CEBPζ基因鉴定鸡腹部脂肪量的方法及其应用，属于动物分子遗传学技术领域。本发明的目的是为了更准确方便地鉴定低脂肉鸡和加速肉鸡的育种进程。本发明根据鸡CEBPζ基因SNP位点g.764T>G上游123bp下游302bp序列设计引物，所得引物对鸡基因组DNA进行PCR扩增，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得鸡腹部脂肪含量的标记基因型。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测，是一种有效的分子标记育种手段，为鸡的标记辅助选择提供了科学依据，采用该方法有助于加快肉鸡育种进程，培育适合市场需求的低脂肉鸡，从而获得较好的经济效益。

说明书

技术领域

本发明属于动物分子遗传学技术领域，具体涉及一种利用鸡CEBPζ基因鉴定鸡腹部脂肪量的方法及其应用。

背景技术

经过长期的选育，肉鸡的生长速度和产肉量得以明显提高，然而肉鸡育种却面临着新的挑战。伴随着快速生长，肉鸡生理性不适症及相关疾病明显增加，如体脂蓄积过多、腹水综合症、猝死症、腿部疾病、机体免疫功能下降等，这些问题给肉鸡生产者造成了巨大的经济损失。肉鸡体脂(尤其是腹脂)蓄积过多已成为一个突出的问题。肉仔鸡体内沉积过多的脂肪有诸多不利：(1)明显降低饲料转化效率，因为沉积单位重量的脂肪比沉积单位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴体瘦肉对脂肪组织的比例，因而降低了分割肉产量；(3)加工者和消费者将肉仔鸡体内沉积的这些脂肪的很大一部分(腹脂垫、肌胃周围脂肪、嗉囔脂肪及肠系膜脂肪等)丢弃，这不仅增加了加工者和消费者的负担，而且增加了废物及处理水中的脂肪含量，从而污染了环境。由此看来，肉仔鸡体内沉积过多的脂肪将会给生产者、加工者和消费者造成显而易见的经济损失。肉种鸡过肥会严重影响产蛋率、受精率和孵化率，并且会诱导脂肪肝综合症(FLHS)的发生，从而加大了产蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在鸡体内的过多蓄积，进一步提高肉鸡的饲料转化效率和胴体质量是亟待研究解决的重大问题。

哺乳动物中，脂肪形成是脂肪细胞数量增加和细胞体积变大的结果。脂肪细胞的数量取决于多能干细胞定向分化为前脂肪细胞的数量，而细胞体积变大取决于细胞分化程度和甘油三酯累积多少。在体内、体外的研究数据表明：CEBPζ基因在脂肪的增值、分化过程中扮演着重要角色。CEBPζ磷酸化对脂肪细胞分化有重要影响，其被反式激活结构域中丝氨酸78和81的丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，使CEBPζ抑制脂肪细胞生成，进而通过影响前脂肪细胞分化来调节脂肪沉积。目前为止，尚未发现有关CEBPζ基因分子标记对鸡腹部脂肪含量进行选择的报道。

发明内容

本发明的目的是为了更准确方便地鉴定低脂肉鸡和加速肉鸡的育种进程，本发明为了解决如何鉴定低脂肉鸡和加速肉鸡的育种进程的技术问题，本发明提供了一种利用鸡CEBPζ基因鉴定鸡腹部脂肪量的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

1)根据鸡CEBPζ基因SNP位点g.764T>G上游123bp和下游302bp序列设计引物，获得扩增引物；所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示；

2)利用步骤1)所得的扩增引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物；

3)利用限制性内切酶Pvu II对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；

4)对步骤3)所得的酶切产物进行电泳分离，获得分离产物；

5)对步骤4)所得的分离产物进行基因型分析，获得鸡腹部脂肪量的标记基因型；所述腹部脂肪量以腹脂重和腹脂率进行计量。

进一步地限定，步骤4)所述电泳分离采用琼脂糖凝胶，所述琼脂糖凝胶的质量浓度为2％。

进一步地限定，步骤5)所述基因型分析通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应方法，对扩增结果进行分析。

进一步地限定，步骤5)所述鸡腹脂含量标记基因型，当鸡CEBPζ基因位点g.764T>G为T碱基时，酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为426bp，将其命名为TT基因型；当鸡CEBPζ基因位点g.764T>G为G碱基时，酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带为两条带，大小为300bp和126bp，将其命名为GG基因型；该位点杂合的个体酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带为三条，大小分别为426bp、300bp、126bp，将其命名为GT基因型。

本发明还提供了上述的鉴定鸡腹部脂肪量的方法获得的鸡腹部脂肪量的标记基因在鸡遗传育种中的应用。

有益效果：本发明证明g.764T>G突变位点的等位基因频率分布在高低脂双向选择品系两系间存在极显著差异(P<0.01)，该方法操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测，高效准确的鉴定低脂肉鸡。利用本发明的分子标记方法对鸡腹部脂肪含量进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹部脂肪性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，能够更全面地理解肉鸡腹脂沉积的分子机理，加速肉鸡的育种进程。

附图说明

图1为CEBPζ基因SNP位点g.764T>G分析图谱，其中TT、GT、GG代表三种不同基因型，M为分子量marker，自上至下，依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

具体实施方式

本发明所涉及的试剂、仪器设备、实验等描述如下：

一、缓冲溶液配制及引物设计

1.实验动物和性状测定

东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择系第十九世代肉鸡329只公鸡(低脂170只，高脂159只)。在7周龄时进行翅静脉采血，EDTA-Na

2.药品和酶

DNA Marker、dNTP、EasyTaq Buffer、Easy Taq购自全式金公司；限制性内切酶PvuII购自Takara公司。

3.主要仪器设备

PCR仪，微量移液器，均购自德国Eppendorf公司；电子秤ACS-30，购自上海华德公司；-20℃/4℃冰箱，购自青岛海尔公司；-80℃冰箱，购自美国Froma公司；电子恒温水浴锅，购自上海一恒科技有限公司；电泳仪、电泳槽，均购自上海Tanon公司；高压蒸汽灭菌锅，购自日本SANYO公司；超净台，购自苏州净化设备有限公司。

4.缓冲液与常用试剂的配制

0.5M EDTA(pH 8.0)：称取186.1g乙二胺四乙酸二钠(EDTANa

5×TBE缓冲液：称取242g Tris碱量取57.1mL冰乙酸和100mL 0.5mol EDTA加水定容至终体积为1L，室温保存。

其他试剂或制备方法如无特殊说明，均可通过商业化途径获得，或通过常规生物学实验记载进行。下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1.鉴定鸡腹部脂肪量的分子标记方法

1.引物的设计与合成：

根据鸡CEBPζ基因SNP位点g.764T>G上游123bp下游302bp序列设计引物，由英俊生物技术有限公司合成，引物序列如下：

CEBPZ-F序列如SEQ ID NO.1所示，即5’-CGTGCTAGGGAGGTGATA-3’；

CEBPZ-R序列如SEQ ID NO.2所示，即5’-TGGACGCTGTGAGAAAGA-3’。

2.利用步骤1所得的扩增引物进行鸡基因组DNA的PCR扩增，获得扩增产物：

DNA的提取、产物扩增：

1)鸡DNA的提取，鸡DNA的小样提取可采用以下两种方法：

方法一：(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。

(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。

(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。

(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。

(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。

(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。

方法二：(1)将20μl全血加入装有700μl 1×SET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。

(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的SDS至终浓度0.5％，55℃消化12h。

(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀

(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。

(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24：23：1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23：1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(7)向水相中加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。

(8)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。

(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。

2)鸡DNA的扩增；

PCR扩增反应体系：

以上述提取获得的鸡DNA为模板进行PCR扩增，反应体系中包含以下溶液或试剂：

将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。95℃变性3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃30sec，35个循环；72℃延伸5min，获得扩增产物。

3.利用限制性内切酶对步骤2所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物：

酶切反应：反应结束后，用Pvu II酶对PCR扩增产物进行强制酶切鉴定分型，反应体

37℃反应0.5h，回收酶切产物。

4.对步骤3所得的酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分离，获得分离产物：

5.检测酶切结果并进行基因分型：

1)统计模型建立：根据高、低脂双向选择品系随机群体的特点，构建如下线性模型：

Y＝μ+Sire(Line)+Dam(Line,Sire)+G+Line+e

Y为性状观察值，μ为群体均值，Sire(Line)为嵌套在品系中公鸡随机效应，Dam(Line,Sire)为嵌套在品系和公鸡中的母鸡随机效应，G为基因型固定效应，Line为品系固定效应，e为剩余值。使用统计软件JMP11.0分析高、低脂双向选择品系肉鸡群体的鸡只基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均数。

2)鸡CEBPζ基因的多态性与肉鸡腹脂双向选择品系鸡只腹部脂肪量的相关性分析：

利用本发明的引物(CEBPZ-F、CEBPZ-R)对东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择品系第十九世代329只公鸡的基因组DNA进行PCR扩增，然后针对位点g.764T>G进行多态性分析。在高、低脂双向选择系中检测到3种基因型，结果如图1所示，对位点g.764T>G进行酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为426bp时，将其命名为TT基因型；酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带大小为126bp和300bp时，将其命名为GG基因型；该位点杂合的个体酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带为三条，大小分别为426bp、300bp、126bp，将其命名为GT基因型。

以东北农业大学选育的肉鸡高、低脂双向选择品系第十九世代为材料，计算g.764T>G位点对腹脂含量性状(腹脂率和腹脂重)的影响。相关分析结果如表1所示，该位点基因型对腹脂率、腹脂重的影响达到极显著水平(p<0.01)，表型贡献率分别为7.05％和4.21％。等位基因频率分析结果如表2所示，该位点的等位基因频率在两系间的分布存在极显著差异(p<0.01)。由此可见，该位点是影响鸡腹部脂肪含量的重要分子标记；TT基因型鸡只的腹脂含量显著低于GT和GG基因型鸡只的腹脂含量，故TT基因型是降低鸡腹部脂肪含量的有利基因型。利用本发明的分子标记方法对鸡腹部脂肪含量进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹部脂肪性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段。

表1g.764T>G基因型对鸡腹部脂肪性状的影响

表2g.764T>G在第十九世代高、低脂双向选择系中等位基因频率分析

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120> 一种利用鸡CEBPζ基因鉴定鸡腹部脂肪量的方法及其应用

<130>

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> CEBPΖ-F

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