治疗与缺氧相关的组织损伤的给药方案

摘要

本文描述了用于治疗受试者中与缺氧相关的组织损伤的方法。更具体的说，所述方法涉及根据特定的给药方案治疗手术程序过程中受试者中的与缺氧相关的组织损伤。特别是，所述方法涉及一种给药方案，所述方案包括在手术程序中向受试者给药，其中在手术程序过程中形成最初的手术切口后的约120分钟内将第一剂施用于受试者。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2018年7月3日提交的美国专利申请No.16/027,080的优先权，其所有内容按引用并入本文中。

技术领域

本发明涉及受试者中与缺氧相关的组织损伤的治疗。更具体地，所述方法涉及根据特定的给药方案在手术程序过程中治疗受试者中的与缺氧相关的组织损伤。具体地，该方法涉及一种给药方案，其包括在手术程序过程中对受试者进行给药，其中在该手术程序过程中进行的最初手术切口后约120分钟内向患者施用第一剂，并任选地在最初切口后对受试者进行一次或多次给药和/或刚好在所有手术切口闭合之前对受试者再次给药。

背景技术

术后粘连是术后疼痛和其它手术并发症的重要原因。氧化应激和缺氧在粘连形成中起着重要作用。缺氧触发一系列反应，其最终导致粘连形成。粘连的发展是一个多步骤过程，包括巨噬细胞驱动的炎症反应、纤维状渗出物的形成、成纤维细胞(这些成纤维细胞被激活以形成肌成纤维细胞)的募集、过量的胶原纤维沉积和随后的血管形成。这些过程发生在低氧环境(缺氧)中，其决定性地调节炎症和愈合。在分子水平上，对缺氧的反应是由缺氧诱导因子(HIF)调控的，该因子由氧依赖性α亚基(HIF-1α，HIF-2α)和氧非依赖性β亚基组成。HIF-α亚基是组成型表达的，并在常氧下迅速降解。然而，在缺氧状态下，HIF-1α和HIF-2α被稳定并形成活性转录复合物。该复合物与许多下游靶基因的启动子区域中的缺氧反应元件(HRE)结合，这共同启动了对缺氧的适应性反应。

在常氧条件下，葡萄糖在胞内分解代谢形成丙酮酸，其通过柠檬酸循环(TCA循环)进一步代谢产生三磷酸腺苷(ATP)。相反，在低氧条件下，进入TCA循环的丙酮酸量减少，并且丙酮酸转化为乳酸。缺氧诱导因子(HIF)激活厌氧糖酵解，其通过改变糖酵解酶将新陈代谢转变为厌氧糖酵解。HIF抑制丙酮酸脱氢酶(其将丙酮酸转化为乙酰辅酶A)，并刺激乳酸脱氢酶(LDH)(其将丙酮酸转化为乳酸)；因此导致乳酸产量增加。乳酸可能通过刺激粘连形成中涉及的其它因子(如VEGF和胶原蛋白)对粘连形成是至关重要的。

美国专利No.9,011,883描述了用于治疗或减少患者腹膜粘连的方法，包括在影响患者腹膜的手术程序过程中或之后施用有效量的L-谷氨酰胺或包含丙氨酰-谷氨酰胺的二肽。

最近，报道了在小鼠模型中，用HIF-1α抑制剂(20mg/kg)单次术中灌洗减少了粘连形成。Strowitzki等，“Pharmacological HIF-inhibition attenuates postoperativeadhesion formation,”Sci.Rep.7(1):13151(2017)。在细胞水平上证实了体内结果，其中在用微摩尔剂量的HIF-1α抑制剂处理时，在体外的正常鼠腹膜成纤维细胞中减弱了几种炎症生物标志物的低氧上调，包括HIF-1α和TGF-β。

在本领域中需要用于治疗和预防粘连，尤其是与缺氧相关的组织损伤的化合物和方法。

发明内容

本文描述了用于治疗受试者中与缺氧相关的组织损伤的方法。在某些实施方案中，所述组织损伤是手术程序过程的结果。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防正接受手术程序过程的受试者中的组织粘连的方法，所述方法包括在手术程序过程中向受治疗者施用治疗有效量的谷氨酰胺源，局部施用于面临粘连形成的组织，其中第一剂谷氨酰胺源在手术程序过程中的最初手术切口后约120分钟内施用。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防正接受手术程序过程的受试者中的与缺氧相关的组织损伤的方法，所述方法包括在手术程序过程中向受治疗者施用治疗有效量的谷氨酰胺源，局部施用于面临与缺氧相关的组织损伤的组织，其中第一剂谷氨酰胺源在手术程序过程中的最初手术切口后约120分钟内施用。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于降低正接受手术程序过程中的受试者中的与缺氧相关的受损组织中的HIF-1α的方法，所述方法包括在手术程序过程中向受治疗者施用治疗有效量的谷氨酰胺源，局部施用于受损组织，其中第一剂谷氨酰胺源在手术程序过程中的最初手术切口后约120分钟内施用。

发明详述

以下段落更详细地定义了本文描述的本发明的实施方案。以下实施方案并不意味着限制本发明或缩小本发明的范围，因为对于本领域的普通技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的范围、实施方案或本文所述的具体方面的情况下可以进行适当的修改和适应性改动。本文引用的所有专利和出版物将其所有内容按引用并入本文中。

术语“谷氨酰胺源”或“谷氨酰胺的来源”包括谷氨酰胺及其生理学上可接受的盐，以及包括谷氨酰胺的谷氨酰胺缀合物和肽，如本文将进一步描述的。

如本文使用的术语“剂量”或“剂”或“剂型”表示含有使用单次给药或多次给药足以产生治疗效果的含量的谷氨酰胺源的任何形式或制剂。

如本文使用的术语“手术切口”表示在手术之前或手术程序过程中，由诸如解剖刀、激光或其它切割器械的切割器械造成的伤口，包括为体腔镜镜或其它微创手术技术形成的切口或切入点。

如本文使用的术语“预防”包括降低的意思。降低的量可以为约0.001％至约100％。

术语“有效量”是获得所需效果的量。例如，在本发明中，一种或多种谷氨酰胺源的有效量是在一次或多次给药后降低或防止与缺氧相关的组织损伤的量。在一些实施方案中，有效量是防止或减少一个或多个组织中的粘连的谷氨酰胺源的有效量。

如本文使用的术语“载药量”是指相对于剂型总质量的谷氨酰胺源的wt％。

如本文使用的术语“制剂”或“组合物”是指与一种或多种药学上可接受的稀释剂和/或赋形剂组合的谷氨酰胺源。

如本文使用的术语“延长释放”或“持续释放”是指在生理条件下或在体外测试中，根据所需的谱在延长的时间段内释放活性成分的组合物。“延长的时间段”是指至少约1小时；约2小时；约4小时；约6小时；约8小时；约10个小时；约12小时；约14小时；约16小时；约18小时；约20小时；约24小时；甚至更长的连续时间段；特别是在生理条件下或在体外测试中约18小时的时间段。

如本文使用的术语“延迟释放”是指在一段时间(例如，几分钟或几小时)后释放活性成分的组合物，使得活性成分没有在最初被释放。延迟释放组合物可以提供例如在生理条件下或在体外测试中在一定时间段后从剂型释放药物或活性成分。

术语“治疗”是指以有效(例如，治疗有效)地改善与疾病相关的病症、症状、失调或参数或其可能性的含量、方式或模式施用疗法。在一些实施方案中，术语治疗是指手术后粘连形成的治疗或预防。在其它实施方案中，术语治疗是指正接受手术程序过程的患者中与缺氧相关的组织损伤的治疗或预防。

术语“预防性地治疗”是指在引起与疾病相关的病症、症状、失调或参数之前以一定的量或以降低其可能性的量施用疗法。

术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括动物和人类。受试者可以是需要其治疗的医学患者。在一个实施方案中，受试者是人。

术语“预防”或“降低”是指预防或降低疾病的进展，如粘连，预防或降低至统计学显著的程度或本领域技术人员可检测的程度。

如本文使用的术语“基本上”表示很大或显著的程度，但不完全。

如本文使用的，“一个(a)”或“一个(an)”表示一种或多种，除非另外指出。

术语如“包括(include)”、“包括(including)”、“含有(contain)”、“含有(containing)”、“具有(having)”等表示“包含(comprising)”。

本文描述了在手术程序过程中形成的最初手术切口后的特定时间，或如果程序超过特定时间长度在手术程序过程中的多个时间点，通过施用谷氨酰胺源，来治疗与缺氧相关的组织损伤的方法，并且特别地预防或治疗正接受手术程序过程的患者中的粘连形成。对组织的伤害(包括手术操作)会导致炎症反应，其导致血纤蛋白沉积和随后的血纤蛋白粘连。如果在由于手术引起的损伤或其它损伤后不能马上防止或降解这种粘连，则包括成纤维细胞在内的修复性细胞会传播到血纤蛋白基质中，从而将其转变为永久性纤维粘连。尽管不受任何特定理论的束缚，但发明人惊奇地发现，在开始缺氧后约60至约120分钟内施用谷氨酰胺源减少了经受缺氧的细胞中HIF-1α蛋白的量。尽管较早或较晚施用谷氨酰胺源确实对HIF-1α蛋白的水平有一定影响，但在开始缺氧后约60至约120分钟内施用谷氨酰胺源时，发现效果更好。

因此，本文描述了用于在正接受手术程序过程的受试者中治疗或防止粘连、与缺氧相关的组织损伤或降低缺氧相关的受损组织中的HIF-1α的方法，所述方法包括在手术程序过程中向受试者施用治疗有效量的谷氨酰胺源，局部施用于面临与缺氧相关的组织损伤的组织，其中在手术程序过程中最初手术切口后约120分钟内施用第一剂谷氨酰胺源。在某些实施方案中，在手术程序过程中最初手术切口后约90分钟内施用第一剂谷氨酰胺源。在另一个实施方案中，在手术程序过程中最初手术切口后约30分钟至约120分钟内，约60分钟至约120分钟内，约30分钟至约90分钟内，或约30分钟至约60分钟内施用第一剂谷氨酰胺源。在再一个实施方案中，在约60分钟内施用谷氨酰胺源。

本文所述的方法包括在指定的时间段内至少一次将谷氨酰胺源施用于受试者。在某些实施方案中，超过一次将谷氨酰胺源施用于受试者。例如，受试者可以在指定的时间段内接受第一剂谷氨酰胺源，接着在指定的时间段、固定的时间间隔和/或刚好在所有手术切口闭合前，接受另外的一剂或多剂谷氨酰胺源。另外剂的谷氨酰胺源的数量可以由外科医生决定，但是通常谷氨酰胺源的剂量数量取决于手术的总时间或受影响的组织经受缺氧相关损伤的时间量。在一个实施方案中，刚好在所有手术切口闭合前，将另外剂的谷氨酰胺源施用于受试者。在某些实施方案中，以固定的时间间隔来施用另外的一剂或多剂谷氨酰胺源。所述时间间隔可以是任何时间间隔，但优选在最初剂的谷氨酰胺源的时间后约15分钟至约120分钟，约30分钟至约120分钟，约30分钟至约90分钟，约30分钟至60分钟，或更具体的说，每约90分钟，每约60分钟，每约45分钟，或每约30分钟的时间间隔。

谷氨酰胺是条件必需氨基酸，其可以被很好地吸收，促进伤口愈合并调节嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的功能。它还用作生产抗氧化剂谷胱甘肽的底物。在分解代谢应激期间(创伤、败血症、烧伤)，谷氨酰胺从肌肉存储中释放到血清中，并且肌肉中谷氨酰胺的细胞内水平降低。组织，特别是在内脏器官中，迅速吸收谷氨酰胺，并且谷氨酰胺血清浓度随后下降。先前的工作已经证明了在大鼠模型中含谷氨酰胺的溶液预防腹膜粘连形成的功效。参见美国专利No.9,011,883。

此外，谷氨酰胺是安全的，吸收良好的，并且没有记录的副作用。已知谷氨酰胺可促进伤口愈合。谷氨酰胺及其二肽已用于危重病人和其它临床环境中的肠胃外和肠内补充成分。谷氨酰胺源的最初用途是通过肠内给药(例如，在食品补充剂中)或通过静脉内途径的肠胃外给药来使用。至少有一项研究描述了将谷氨酰胺施用到高血管区域，如腹膜，其在该区域容易被脉管系统吸收。在这些位置，L-谷氨酰胺防止了由于腹膜缝合引起的血管形成的损失，腹膜缝合会引起脱血管和粘连形成。因此，认为谷氨酰胺可通过在脉管系统中摄取谷氨酰胺来防止纤维化和粘连形成并防止血管化的丧失。

本文描述的一些实施方案是治疗或减少正接受手术程序过程的受试者的粘连形成或与缺氧相关的组织损伤的方法。本文预期涉及的示例性和非限制性手术程序包括影响受试者的头部或颈部、骨盆腔、腹腔、胸腔或受试者的一个或多个肢体的手术和程序。影响盆腔的手术的实例包括但不限于子宫肌瘤切除术、卵巢切除术、子宫切除术、子宫内膜异位症切除术、输卵管结扎术，简而言之，涉及任何生殖器官的任何体腔镜(laparoscopic)、体腔(laparotomic)或开放性手术或程序(包括子宫的阴道内程序，如扩张和刮宫，IVF等)，所述生殖器官包括但不限于子宫、卵巢、输卵管、前列腺、尿道以及膀胱，骨盆结肠和直肠，或涉及骨盆腔的主动脉、静脉、肌肉和神经、膜、韧带或内脏的任何手术。影响腹腔的手术的实例包括但不限于胆囊切除术、肝脏切除术、搭接带手术、结肠吻合术、阑尾切除术，简而言之，涉及胃、肝、胰腺、脾、胆囊、肾，以及大多数小肠和大肠的任何手术，任何涉及腹腔的主动脉、静脉、肌肉和神经、膜、韧带或内脏的手术。影响胸腔的手术的实例包括但不限于体腔镜或体腔手术或开放性心血管手术和程序、肺部手术、肝脏手术、胆囊手术，涉及胸腔的主动脉、静脉、肌肉和神经、膜、韧带、骨或内脏的任何手术。影响受试者一个或多个肢体的手术的实例包括但不限于涉及手臂、腿、肘、肩、脊柱的体腔镜或体腔手术或开放性手术，包括但不限于涉及大动脉、静脉、肌肉和神经、膜、韧带、骨或内脏的任何手术。影响头部和颈部的手术的实例包括但不限于涉及脑眼手术或程序、耳朵、鼻子和喉咙、牙齿、牙龈和颌骨手术或程序，面部、头部和颈部的整容重建手术和程序，牙齿、牙龈和颌骨的整容程序的体腔镜或体腔或开放性手术，涉及头部和颈部的主动脉、静脉、肌肉和神经、膜、韧带、骨或内脏的所有手术。

基于先前涉及静脉内施用L-谷氨酰胺和包含L-谷氨酰胺的二肽的研究，一剂特定的谷氨酰胺源可以提供每天每患者千克约0.01g至约1.0g L-谷氨酰胺。然而，可以选择剂量以超过这些上限和下限量。采用丙氨酰-谷氨酰胺的典型剂量可以是约0.02g至约0.5g二肽/kg/天的范围。在手术程序过程中施用谷氨酰胺源时，对于普通成人患者的典型剂量可以提供约0.02g至约2.0g、或约0.3g至约1.5g的L-谷氨酰胺或L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺。由于谷氨酰胺是一种无害氨基酸，因此可以大量施用而不会产生任何预期的副作用。

在一些实施方案中，谷氨酰胺源包括谷氨酰胺或其任何药学上可接受的盐。在一些实施方案中，谷氨酰胺源包括L-谷氨酰胺，或是L-谷氨酰胺。已知L-谷氨酰胺具有相对低的溶解度(即，室温下约40g/L)和存储过程中较低的稳定性。因此，谷氨酰胺源还可以包括其它载体氨基酸或可以将谷氨酰胺作为寡肽的一部分结合，这可以提高L-谷氨酰胺的溶解度和稳定性中的一种或其二者。寡肽可以包括任何天然产生的或非天然产生的氨基酸。合适的寡肽包括L-谷氨酰胺并且能够代谢来提供L-谷氨酰胺。优选，这样的肽将呈现出L-谷氨酰胺提高的水溶性和提高的稳定性。常常，这样的肽还将呈现出提高的耐受性，以耐受灭菌和存储过程中的分解。包含L-谷氨酰胺的寡肽可以进一步包括本领域已知的可分裂接头肽部分。参见，

在一些实施方案中，谷氨酰胺源是作为二肽的一部分结合的L-谷氨酰胺。这样的肽是包含L-谷氨酰胺和L-丙氨酸、L-谷氨酰胺或L-甘氨酸之一的二肽。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-Ala-L-Gln)二肽(C末端位置的谷氨酰胺残基)在水中的溶解度高(568g/L)。与谷氨酰胺(154g/L)相比，L-甘氨酰-L-谷氨酰胺(L-Gly-L-Gln)二肽(C-末端位置的谷氨酰胺)也显示出增强的在水中的溶解度。还可以使用谷氨酰-谷氨酰胺(L-Glu-L-Gln)二肽。因此，在一个实施方案中，谷氨酰胺源包括L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，谷氨酰胺源作为包含谷氨酰胺的寡肽的一部分来提供，其中谷氨酰胺源的水溶性和水稳定性与单独的谷氨酰胺相同或更高。在其它实施方案中，谷氨酰胺源是谷氨酰胺缀合物，其中至少一个谷氨酰胺残基经由氨基酯键与化合物结合。这样的谷氨酰胺源的实例包括，但不限于，二氯乙酰谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺、丁酰谷氨酰胺、丙酮酰谷氨酰胺、通过肽键与任何其它氨基酸连接的谷氨酰胺、与含有可以与谷氨酰胺的羧基或氨基官能团之一形成肽键的羧基或氨基官能团的小分子连接的谷氨酰胺，以及经由氨基酯键与任何其它合适的有机酸缀合的谷氨酰胺。

L-谷氨酰胺和含有L-谷氨酰胺的肽(包括L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的药学上可接受的制备物是可商购获得的。此外，用于本文所述的方法中的含有L-谷氨酰胺的肽也可以根据已知方法来合成并纯化和灭菌，以用于药物使用。

在一些实施方案中，将谷氨酰胺源与一种或多种其它的活性药物成分一起施用。其它的活性药物成分可以以与谷氨酰胺源相同的方式来施用，或通过不同的合适的胃肠外方法或肠内方法来使用。在一些实施方案中，其它的一种或多种活性药物成分可以在谷氨酰胺源施用之前、同时或之后通过相同的给药方式与谷氨酰胺源一起施用。在其它实施方案中，其它的一种或多种活性药物成分可以在谷氨酰胺源施用之前、同时或之后通过不同的给药方式与谷氨酰胺源一起施用。

在一些实施方案中，包括谷氨酰胺源的制剂可以是包含溶解于水相中的L-谷氨酰胺源的液体、糊剂或凝胶。本文所述的组合物可以是无水的、部分水合或完全水合的形式，并且包括谷氨酰胺源加药学上可接受的载体和/或稀释剂成分，如无菌蒸馏水、无菌等渗液、无菌生理盐水溶液，或无水的缓冲剂和/或盐混合物或浓缩物，当其稀释时形成这样的稀释剂成分。将选择组合物中谷氨酰胺源的含量，以在施用过程中提供完全溶解的氨基酸或肽。此外，为给药而配制时从组合物可利用的L-谷氨酰胺的含量和/或给药的制剂的总量将由熟练的医疗工作者来选择，以向患者提供合适剂量的L-谷氨酰胺。

在某些实施方案中，将谷氨酰胺源制剂增稠，使得制剂将呈现出提高的高于适用于静脉内注射的典型液体制剂的粘度。这样增稠的制剂将是糊剂或凝胶的形式，其可以在手术程序过程中直接施用于选定的组织或区域。合适的药学上可接受的增稠剂是已知的并可以使用。优选，这样的试剂将在水合时形成水凝胶，或接受合适的交联剂并水合时将形成水凝胶。针对其生物相容性来选择这样的凝胶形成组分并且可以是可吸收的。已经用于药物制剂中的本领域技术人员已知的合适的增稠剂和凝胶形成剂的实例包括具有亲水性成分的聚合物，如胶原；聚氧化烯聚合物，如聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚甲基丙烯酸羟乙酯；透明质酸盐；和各种蛋白质，如白蛋白等。也可以使用止血凝胶，包括含有血纤蛋白原或血纤蛋白的那些。

水凝胶制剂允许合适的药物延长的递送，所述合适的药物包括例如L-谷氨酰胺或含有至少一个谷氨酰胺残基的二肽或三肽。水凝胶通常形成仓储(depot)，其进一步允许药物的浓缩应用。可以在施用前产生包含谷氨酰胺源的水凝胶并且用谷氨酰胺源浸渍，用于进一步的植入。或者，在改变环境后在原位形成水凝胶，所述环境包括pH和温度。用于原位水凝胶形成的各种物理和化学交联聚合物是本领域已知的。示例性和非限制性水凝胶可以包括共聚物，其包含环氧丙烷(PPO)、聚(丙交酯-乙醇酸)(PLGA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(丙烯富马酸酯)、聚(己内酯)等的嵌段。参见，例如，Hoare和Kohane,“Hydrogels indrug delivery:Progress and challenges,”Polymer49(8):1993-2007(2008)。合适的水凝胶也可以从天然产生的蛋白质和肽生成。参见，例如，Jonker等，“Peptide-and Protein-Based Hydrogels,”Chem.Mater.24(5):759-773(2011)。特定的水凝胶制剂可以由施用部位来确定。

在一些实施方案中，作为含有谷氨酰胺源的可植入膜的一部分来配制谷氨酰胺源。谷氨酰胺源可以应用于或渗入手术可植入膜或其它手术植入物中。例如，可以作为凝胶的一部分来配制谷氨酰胺源并附着于植入物的外部。可以用本发明的液体或凝胶制剂浸渍由诸如编织的可吸收纤维素的材料构成的植入物，该材料可从Ethicon以

在一些实施方案中，剂型内的谷氨酰胺源的载药量为约2％至约90％，包括指定范围内的每个整数。在一些实施方案中，载药量为约10％至约80％。在一些实施方案中，载药量为约20％至约60％。在一些实施方案中，载药量为约20％至约50％。在一些实施方案中，载药量为约20％至约40％。在一些实施方案中，载药量为约1％，约2％，约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％或约90％。

在一些实施方案中，将药物渗入可植入膜中。在一些实施方案中，可植入膜中的载药量为约2％至约90％，包括指定范围内的每个整数。在一些实施方案中，可植入膜中的载药量为约10％至约80％。在一些实施方案中，可植入膜中的载药量为约20％至约60％。在一些实施方案中，可植入膜中的载药量为约20％至约50％。在一些实施方案中，可植入膜中的载药量为约20％至约40％。在一些实施方案中，可植入膜中的载药量为约1％，约2％，约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85％或约90％。在一个实施方案中，可植入膜中的载药量为约30％。在另一个实施方案中，可植入膜中的载药量为约50％。

在一些实施方案中，包含谷氨酰胺源的剂型稳定长达数月或数年。在一些实施方案中，本文所述的谷氨酰胺源的药物剂型在25℃和60％相对湿度(RH)下稳定约一个月，约两个月，约三个月，约四个月，约五个月，约六个月，约九个月，约十个月，约十一个月，约十二个月，或甚至更长时间。在另一个实施方案中，可以将剂型储存在冷藏条件下，如2-8℃，在这种情况下稳定长达约一个月，约两个月，约三个月，约四个月，约五个月，约六个月，约九个月，约十个月，约十一个月，约十二个月，或甚至更长时间，如约一年，约三年，或长达约五年的任何时间量。

具体实施方式

建立了正常腹膜成纤维细胞(NPF)的原代培养物，并在暴露于阶段性(episodic)低氧环境之前，在常氧条件下抽取低氧前样品以测定HIF-1α和1型胶原蛋白(COL1A1)的水平。将培养的细胞暴露于低氧条件(2％O

通过ELISA测定了HIF-1α和COL1A1水平(分别按照制造商的实验方案，HIF-1αELISA(Thermo-Fisher Scientific)或COL1A1 ELISA(LifeSpan Biosciences))。用单向ANOVA，接着用使用Bonferroni校正的Tukey’s检验，分析了数据。针对HIF-1α的结果显示于表1-3中。

如表3中所证明的，用L-Ala-L-Gln处理的细胞显示出在所有缺氧持续时间与未处理细胞相比在12和24小时时HIF-1α降低。对于COL1A1获得了相似的结果(数据未显示)。尽管在60分钟时看到了对降低HIF-1α的最大效果，但在每个时间点都看到了一些效果，在30分钟至120分钟具有更显著的效果。所有浓度的L-Ala-L-Gln看来都是有效的，尽管较低一些的剂量(例如，1.0mM和2.0mM)显示出略好于较高(例如，10.0mM)的剂量。

尽管已经说明和描述了本发明的某些实施方案，但将清楚本发明不限于本文所述的实施方案。不脱离以下权利要求所述的本发明的精神和范围的各种改变、变化、变更、替换和等价体是本领域技术人员显而易见的。