一种快速检测人体尿液中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺含量的方法

摘要

本发明涉及毒品检测领域，公开了一种快速检测人体尿液中3,4‑亚甲基二氧甲基苯丙胺含量的方法，包括以下步骤：在待测尿液中加入氘代MDMA标准溶液，经预处理后，获得待测样品液；用纳升电喷雾喷头吸取待测样品液进样，用质谱仪在线检测，获得分析物的前体离子和碎片离子，根据质谱图中分析物的定性离子峰强与空白背景的信噪比来确定待测尿液中是否含有MDMA，并根据分析物与内标物的定量离子的峰强度之比，结合标准曲线获得待测样品液中MDMA的浓度。本发明的方法样品预处理过程简单、分析速度快、灵敏度高、检测成本低，可在现场、原位对吸、贩毒者进行快速筛查和药物分析。

说明书

技术领域

本发明涉及毒品检测领域，尤其涉及一种快速检测人体尿液中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺含量的方法。

背景技术

3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)是一种苯丙胺类中枢兴奋剂，具有兴奋和致幻双重作用。MDMA的分子式为C

吸毒者食用MDMA后，大脑皮层会受到药物的控制，当听到音乐时，就会随着音乐的节拍不由自主地手舞足蹈、疯狂地摇头，音乐节奏越强烈，头晃动得越厉害,同时用药者的神智会出现混乱，表现出超乎异常的兴奋，整夜狂舞，不知疲倦，因此被称之为“摇头丸”。“摇头丸”对社会的危害更是十分严重的，长期滥用后脾气会极易狂躁和愤怒，并产生暴力倾向，诱发恶性暴力案件的发生。在使用MDMA过程中还会出现毒性症状如：抑郁、焦虑等精神症状；心率加快、血压升高；还有其他认知障碍甚至猝死。

目前针对尿液中MDMA的测定方法主要有气相色谱质谱法和液相色谱质谱法。中华人民共和国公共安全行业标准中采用液液萃取或固相萃取的方法将尿液进行处理，然后用气相色谱质谱仪进行检测。该方法样品前处理步骤复杂，耗时长，消耗大量有机溶剂，同时一次处理需要消耗大量的尿液。

文献中报道采用高效液相色谱或超高效液相色谱-串联质谱对尿液中的MDMA进行分析，但依然需要采用萃取、浓缩等样品前处理方法。例如，公开号为CN102597763B的中国专利文献公开了一种检测人体中毒品残留的方法和系统，该方法采用液相色谱-芯片-多级质谱和液相色谱-多级质谱来检测毒品残留，包括样品处理、液相色谱分离和质谱检测；尿液样品处理步骤包括：用1mol/L氢氧化钠溶液调节待检尿液pH为9～10，上GDX403柱，固相柱萃取，二氯甲烷作洗脱剂，浓缩，并加入50μL乙腈溶解，进行液相色谱分离。萃取、浓缩等样品前处理过程导致检测操作复杂、耗时较长，无法在现场对吸、贩毒者进行快速筛查和药物分析；此外，高效液相色谱和超高效液相色谱采用的仪器设备比较昂贵，不利于方法的普及和推广。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速检测人体尿液中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺含量的方法。该方法极大地简化了样品预处理过程，且检测成本低，能在现场、原位对尿液中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺进行快速检测。

本发明的具体技术方案为：

一种快速检测人体尿液中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺含量的方法，包括以下步骤：

(1)在待测尿液中加入氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺标准溶液，经预处理后，获得待测样品液；

(2)用纳升电喷雾喷头吸取待测样品液进样，用脉冲直流电喷雾离子源质谱仪在线检测，获得3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的前体离子和碎片离子，根据质谱图中分析物的定性离子峰强与空白背景的信噪比来确定待测尿液中是否含有3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺，并根据分析物与内标物的定量离子的峰强度之比，结合标准曲线获得待测样品液中3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的浓度。

本发明以氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺为内标物，采用电喷雾串联质谱技术检测尿液中的3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)含量，可在30s内完成样品的采样、注入、电离和生成质谱图，分析速度快、操作简便、检测成本低，可在现场、原位对吸、贩毒者进行快速筛查和药物分析；并且，本发明的方法灵敏度高、特异性好，能实现痕量样品(皮升级)的长期、稳定、高强度电离，满足小批量样品的分析要求，且不需要预先对样品进行萃取、浓缩等，极大地简化了样品预处理过程；此外，在电喷雾串联质谱中，离子源设计有一个一次性采样套件，该套件易于操作并能消除交叉污染。

作为优选，步骤(2)中，所述标准曲线的构建方法如下：

(A)将不同浓度梯度的3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺标准溶液分别加入等量阴性尿液中，再分别加入等量氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺标准溶液，混合均匀后，经预处理，获得不同浓度梯度的标准工作溶液，其中，氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的浓度与步骤(1)获得的待测样品液相同；

(B)用纳升电喷雾喷头吸取不同浓度梯度的标准工作溶液进样，用脉冲直流电喷雾离子源质谱仪在线检测，质谱条件与步骤(2)中相同，根据质谱图获得分析物与内标物的定量离子的峰强度之比，构建标准曲线。

作为优选，步骤(2)或(B)中，分析物的定量离子和定性离子、内标物的定量离子的确定方法如下：

(a)用纳升电喷雾喷头吸取3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺溶液进样，用脉冲直流电喷雾离子源质谱仪在线检测，质谱条件与步骤(2)中相同，获得3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的前体离子和碎片离子，从碎片离子中选择分析物的定性离子和定量离子；

(b)将步骤(a)中的3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺溶液换成氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺溶液，用同样的方法确定内标物的定量离子。

作为优选，步骤(a)和(b)中，所述3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺溶液和氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺溶液的浓度为40～60ng/mL。

作为优选，步骤(2)中，质谱条件如下：扫描模式为正离子选择扫描模式，电喷雾电压为3～5kV，传输毛细管温度为250～300℃，传输毛细管电压为2～5V，离子提取透镜电压为20～30V，碰撞气为高纯氦气，碰撞能量为20～40eV。

作为优选，步骤(2)或(B)中，质谱条件如下：扫描模式为正离子选择扫描模式，电喷雾电压为3kV，传输毛细管温度为275℃，传输毛细管电压为3V，离子提取透镜电压为25V，碰撞气为高纯氦气，碰撞能量为30eV。

在脉冲直流电喷雾离子源质谱中，选择合适的质谱条件对检测的灵敏度非常重要。例如，碰撞能量、电喷雾电压会影响电离产生的定量离子和定性离子的数量，进而影响检测的灵敏度。具体而言，碰撞能量过低会导致母离子碎裂不完全，造成定量定性离子的响应值过低；碰撞能量过高会导致定量定性离子被打碎，也会造成其响应值过低，导致检测灵敏度低。电喷雾电压过低会导致喷头中的样品溶液难以喷出，致使溶液电离不完全；电喷雾电压过高会导致样品溶液喷出过快，无法被充分电离，造成出峰不完全，定量定性离子的响应值过低，导致检测灵敏度低。

要使检测的灵敏度达到较高水平，需综合考虑电喷雾电压、传输毛细管温度和电压、离子提取透镜电压、碰撞能量等质谱条件。并且，不同分析物在电喷雾串联质谱中的电离难易程度不同，不同类型的待测样品(如尿液、血液等)中所含的干扰物不同，适用的质谱条件也就不同。本发明针对特定分析物(MDMA)和特定待测样品类型(尿液)的特性，通过大量实验，将质谱条件控制在合适范围内，能使检测具有高准确度和高灵敏度。

作为优选，步骤(2)或(B)中，分析物的定量离子是质荷比为163.00的离子，分析物的定性离子是质荷比为58.00的离子，内标物的定量离子是质荷比为167.00的离子。

本发明在特定质谱条件下，将质荷比为163.00和58.00的离子分别确定为分析物的定量离子和定性离子，将质荷比为167.00的离子确定为内标物的定量离子，能减少其他碎片离子对定量定性离子的干扰，同时能减少尿液中其他成分对MDMA检测的干扰，使检测具有较高的灵敏度。

作为优选，步骤(1)或(A)中，所述预处理包括以下步骤：加入乙酸乙酯，涡旋30～35s后，10000～13000r/min离心3～5min，取上层清液。

进一步地，步骤(1)中，所述乙酸乙酯与待测尿液的体积比为1:1；步骤(a)中，所述乙酸乙酯与阴性尿液的体积比为1:1。

作为优选，步骤(A)中，所述标准工作溶液的浓度为10～500ng/mL。

进一步地，步骤(A)中，所述不同浓度梯度的标准工作溶液的浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL。

作为优选，步骤(1)中，所述待测样品液中，氘代3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的浓度为50ng/mL。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)样品预处理过程简单、分析速度快、灵敏度高、检测成本低，可在现场、原位对吸、贩毒者进行快速筛查和药物分析；

(2)针对特定分析物(MDMA)和特定待测样品类型(尿液)的特性，选择特定质谱条件以及该条件下确定的定量定性离子，能减少其他碎片离子对定量定性离子的干扰，同时能减少尿液中其他成分对MDMA检测的干扰，使检测具有较高的灵敏度。

附图说明

图1为阳性尿液样本的二级质谱图；

图2为50ng/mL MDMA标准溶液的二级质谱图；

图3为50ng/mL MDMA标准溶液的选择离子流图；其中，图(A)为m/z 162.50～163.50的选择离子流图，图(B)为m/z 57.50～58.50的选择离子流图；

图4为50ng/mL氘代MDMA标准溶液的二级质谱图；

图5为50ng/mL氘代MDMA标准溶液的选择离子流图(m/z 166.50～167.50)；

图6为六日的标准曲线；其中，图(A)～(F)分别为第1～6天获得的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1：MDMA和氘代MDMA标准溶液的制备

用含有0.1％甲酸的甲醇将1mg/mL的MDMA标准储备液稀释成500ng/mL、4μg/mL、20μg/mL的MDMA标准溶液。用含有0.1％甲酸的甲醇将100μg/mL的氘代MDMA标准储备液稀释成2μg/mL的氘代MDMA标准溶液。

实施例2：标准工作溶液的制备

准备五个相同规格的离心管，各自吸取人体阴性尿液400μL放入离心管中，随后分别加入8μL 500ng/mL、5μL 4μg/mL、10μL 4μg/mL、5μL 20μg/mL、10μL 20μg/mL的MDMA标准溶液于不同的离心管中，然后向每个离心管中分别加入10μL 2μg/mL的氘代MDMA标准溶液，随后加入400μL乙酸乙酯，涡旋30s后，10000r/min离心3min，取上层清液，获得不同浓度梯度的标准工作溶液(10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL)，其中，内标物氘代MDMA的浓度为50ng/mL。分析之前，所有加标的样品溶液均是新鲜制备的。

实施例3：MDMA的定性和定量离子的选择

用纳升电喷雾喷头吸取微量体积的50ng/mL的MDMA标准溶液，工作时，将一个金属电极插入纳升电喷雾喷头内部，电极与溶液之间并不直接接触，保持有约5mm的距离，将喷头与质谱锥口相对准，在电极通电后，喷头发生脉冲式电喷雾，溶液中物质发生离子化，用脉冲直流电喷雾离子源质谱仪在线检测，得到MDMA标准品的前体离子和碎片离子，二级质谱图和选择离子流图分别如图2和图3所示，因此在碎片离子中选择采用信噪比最高的m/z163.00作为定量离子，m/z 58.00作为定性离子。

上述质谱条件如下：扫描模式为正离子选择扫描模式，电喷雾电压为3kV，传输毛细管温度为275℃，传输毛细管电压为3V，离子提取透镜电压为25V，碰撞气为高纯氦气，碰撞能量为30eV。

实施例4：氘代MDMA的定量离子的选择

用纳升电喷雾喷头吸取微量体积的50ng/mL的氘代MDMA标准溶液，工作时，将一个金属电极插入纳升电喷雾喷头内部，电极与溶液之间并不直接接触，保持有约5mm的距离，将喷头与质谱锥口相对准，在电极通电后，喷头发生脉冲式电喷雾，溶液中物质发生离子化，用脉冲直流电喷雾离子源质谱仪在线检测，得到氘代MDMA标准品的前体离子和碎片离子，二级质谱图和m/z 167.00的选择离子流图分别如图4和图5所示，因此在碎片离子中选择采用信噪比最高的m/z 167.00作为定量离子。

上述质谱条件如下：扫描模式为正离子选择扫描模式，电喷雾电压为3kV，传输毛细管温度为275℃，传输毛细管电压为3V，离子提取透镜电压为25V，碰撞气为高纯氦气，碰撞能量为30eV。

实施例5：方法学考察

(1)检出限和定量限：

通过比较不同浓度的标准工作溶液定性离子和定量离子的信号，确定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。背景信号测量用仅加内标物的空白样品。LOD和LOQ被定义为信噪比分别达到3和10时分析物的浓度。

(2)构建标准曲线：

通过分别检测不同浓度的系列标准工作溶液(10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL)，以m/z 163.00和m/z 167.00分别作为分析物和内标物的定量离子，每组数据至少包含五个校准点，然后以分析物和内标物的定量离子的峰强度之比平均值为Y轴，以分析物在尿液中的浓度为X轴，通过对三组实验数据求平均，构建标准曲线。

(3)准确度和精密度：

取低、中和高浓度的标准工作溶液(10ng/mL，100ng/mL，500ng/mL)；

日内精密度：分早中晚三次实验，每次实验将每种浓度的标准溶液做五个平行，每个浓度进一针，准确度定义为测量浓度(Cm)与样品中分析物实际浓度(Ca)，计算如下：Cm/Ca×100％，精密度用相对标准差(RSD)表示，分别求出高中低三个浓度的精密度；

日间精密度：六天内对同一被测物进行重复测量所得结果间的一致程度。

本实施例中的质谱条件如下：采用脉冲直流电喷雾离子源质谱，扫描模式为正离子选择扫描模式，电喷雾电压为3kV，传输毛细管温度为275℃，传输毛细管电压为3V，离子提取透镜电压为25V，碰撞气为高纯氦气，碰撞能量为30eV。

六天内对系列标准工作溶液进行检测，构建标准曲线，考察该方法的线性、检出限和定量限等参数，结果见表1和图6。从表1中可以看到，MDMA在10～500ng/mL范围内线性良好，R

表1线性、检出限和定量限结果

考察该方法的重现性和精密度，结果见表2。从表2中可以看到，MDMA的重现性和精密度良好，低中高三个浓度的RSD均小于7.65％。

表2重现性和精密度

考察该方法的加标回收率，结果见表3。从表3中可以看到，MDMA的加标回收率都在94.49％～110.36％之间。

表3加标回收率

结合表1、2和3的结果，认为该方法准确性良好，可以用来快速检测人体尿液中的MDMA含量。

实施例5：阳性尿液样本中甲基苯丙胺的检测分析

移取待测尿液400μL放入离心管中，先加入10μL 2μg/mL的氘代MDMA标准溶液，再加入400μL乙酸乙酯，随后涡旋离心30s，10000r/min离心3min，取上层进样，进样步骤与实施例3相同，用脉冲直流电喷雾离子源质谱快速检测，得到的二级质谱图如图1所示，结合标准曲线y＝0.0221x-0.0231获得待测尿液中的MDMA浓度；阴性尿液的质谱图和标准品的定性离子对进行对比定性，采用内标法定量，结果见表4。

上述质谱条件如下：采用脉冲直流电喷雾离子源质谱，扫描模式为正离子选择扫描模式，电喷雾电压为3kV，传输毛细管温度为275℃，传输毛细管电压为3V，离子提取透镜电压为25V，碰撞气为高纯氦气，碰撞能量为30eV。

表4实际样本检测结果

实施例6：质谱条件的优化

制备检测液：吸取人体阴性尿液400μL放入离心管中，随后加入8μL 50ng/mL MDMA标准溶液于离心管中，然后向离心管中加入10μL 2μg/mL的氘代MDMA标准溶液，随后加入400μL乙酸乙酯，涡旋30s后，10000r/min离心3min，取上层清液，获得MDMA的浓度为1ng/mL的检测液，溶液配五组平行样，其中，内标物氘代MDMA的浓度都为50ng/mL。

用纳升电喷雾喷头吸取检测液进样，用脉冲直流电喷雾离子源质谱仪在线检测，获得3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺的前体离子和碎片离子，记录背景、定性离子(m/z 58.00)的响应值和信噪比。选择不同的质谱条件(扫描模式均为正离子选择扫描模式，碰撞气均为高纯氦气)，每种条件下做5个平行样，最终结果取平均值。表5为各组质谱条件，表6为各组质谱条件下1ppb待测溶液中定性离子(m/z 58.00)检测结果。

表5

表6

从#1、#6、#7组结果来看，电喷雾电压过高或过低均会影响检测结果：#6电喷雾电压过低，喷头中的检测液难以喷出，致使溶液无法电离，无法进行检测；#7电喷雾电压过高，碎片离子的响应值和信噪比减小，这反映了检测的灵敏度下降，原因在于：电喷雾电压过高会导致样品溶液喷出过快，无法被充分电离，造成出峰不完全，碎片离子的响应值和信噪比过低，导致检测灵敏度低。

从#1、#8、#9组结果来看，碰撞能量过高或高低均会导致检测的灵敏度下降。原因在于：碰撞能量过低会导致母离子碎裂不完全，造成获得的碎片离子的数量过少，响应值和信噪比过低；碰撞能量过高会导致碎片离子被打碎，也会造成其响应值和信噪比过低，导致检测灵敏度低。

从#1～#5结果来看，将质谱条件控制在本发明的范围内(电喷雾电压为3～5kV，传输毛细管温度为250～300℃，传输毛细管电压为2～5V，离子提取透镜电压为20～30V，碰撞能量为20～40eV)，能使检测具有高灵敏度和高准确度；采用#1的质谱条件时，检测灵敏度和准确度最佳。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。