用于支持患有癌症的动物的组合物

摘要

本公开涉及一种狗食品组合物，包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约60％的蛋白质，所述重量百分比基于组合物干物质的总重量。

说明书

本申请要求于2018年6月14日提交的欧洲专利申请第EP18177847.3号的优先权权益，其全部内容通过引用合并于此。

技术领域

本公开涉及用于患有癌症的狗的食品组合物的领域。

背景技术

动物健康的维持和改善是本领域不断进行的目标。与它们的对应的人类一样，生活在发达国家的宠物的预期寿命一直在延长。因此，全球癌症负担继续增加，主要是由于狗种群的衰老和数量增长。例如，据估计，狗种群中癌症的发病率是每100,000只狗282.2例至958例。狗中最常见的肿瘤是雌性狗的乳腺肿瘤(占所有癌症的70.5％)、非霍奇金淋巴瘤(雌性为8.4％且雄性为20.1％)和皮肤肿瘤(雌性为4％且雄性为19.9％)。此外，根据欧洲兽医肿瘤学会，年龄超过十岁的狗有50％会死于与癌症相关的疾病。

化疗越来越多地用于动物肿瘤学。利用人类癌症治疗的医学进步优势，越来越多的分子(例如长春新碱、环磷酰胺、卡铂或顺铂)可用于治疗伴侣动物。在兽医领域，抗癌药物特别用于治疗源自造血组织的肿瘤(淋巴瘤、白血病)。例如，基于CHOP的方案结合了环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松，目前用于治疗多种淋巴瘤。化学治疗剂在将患癌症动物的寿命从几周延长到几个月方面能特别有效(用CHOP方案治疗的狗的中位生存时间为13个月)。

确实，宠物主人尤其是诸如狗等伴侣动物的主人，越来越多地选择用化疗治疗他们的宠物以尽可能长地延长良好的生活质量(Quality Of Life，QOL)。狗会出现食欲不振、恶心或腹泻等形式的胃肠不适，这会降低它们的QOL，并可以导致治疗方法改变甚至终止治疗。

管理癌症患者的综合方法应针对支持肿瘤发展并使正常组织毒性最小化的多种生化和生理途径。营养干预是增强治疗反应和改善QOL的关键组成部分。而且，特定的营养素能用作降低与抗癌治疗相关的毒性的有力工具。

患癌症宠物的主人经常询问哪种饮食最适合喂养以在癌症治疗期间帮助支持宠物，并且互联网和其他资源描述了许多“癌症饮食”(例如生食饮食、高蛋白或适量蛋白/低碳水化合物饮食、“生酮”饮食、高脂肪、欧米加-3脂肪酸补充剂(omega-3fatty acidsupplimentation))据称可改善患癌症的狗的预后或最大程度地减少治疗的副作用。

旨在解决此问题的唯一现有产品存在于被称为“处方饮食

目前并没有市售的饮食是专门配制并经临床验证来支持患有癌症的宠物的最佳营养状况和生活质量，并有助于减少化疗的胃肠副作用。

发明内容

本公开涉及一种宠物食品组合物，包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约60重量％的蛋白质，所述重量百分比基于组合物干物质的总重量。

在一些实施方案中，本公开的宠物食品组合物由湿宠物食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的宠物食品组合物由半湿的宠物食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的宠物食品组合物由干宠物食品组合物组成。

在一些实施方案中，本公开的宠物食品组合物由湿的狗食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的宠物食品组合物由半湿的狗食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的宠物食品组合物由干的狗食品组合物组成。

本公开还涉及一种狗食品组合物，包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约50重量％的蛋白质，所述重量百分比基于组合物干物质的总重量。

在一些实施方案中，本公开的上述宠物食品组合物由湿的狗食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的上述宠物食品组合物由半湿的狗食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的上述宠物食品组合物由干的狗食品组合物组成。

在一些实施方案中，根据本公开的所述食品组合物还包含基于组合物的干物质的总重量，约15重量％至约40重量％的量的碳水化合物。

在一些实施方案中，所述食品组合物还包含抗氧化剂的源。

在一些实施方案中，抗氧化剂的源包括一种或多种选自由维生素C、维生素E和类胡萝卜素组成的组中的维生素。

在最优选的实施方案中，所述食品组合物由干宠物食品组合物组成，并且抗氧化剂的源包含维生素C，其中维生素C在食品组合物中以基于干物质的约220ppm至约440ppm的量存在，和/或维生素E，其中维生素E在食品组合物中以干物质为基础以约660ppm至约1100ppm的量存在，和/或类胡萝卜素，其中类胡萝卜素在食品组合物中以干物质为基础以约2ppm至约12ppm的量存在。

在其他最优选的实施方案中，所述食品组合物由湿宠物食品组合物组成，并且抗氧化剂的源包含维生素C，其中维生素C在食品组合物中以干物质为基础以约200至约600ppm的量存在，和/或维生素E，其中维生素E在食品组合物中以干物质为基础以约600ppm至约2000ppm的量存在，和/或类胡萝卜素，其中类胡萝卜素在食品组合物中以干物质为基础以约30ppm至约100ppm的量存在。

在一些实施方案中，所述食品组合物是包含抗氧化剂的源的干的狗食品组合物，并且其中源抗氧化剂的源可以包含喂食时约200ppm至约400ppm的量的维生素C，和/或喂食时约600ppm至约1000ppm的量的维生素E，和/或喂食时约2ppm至约10ppm的量的类胡萝卜素。

在一些实施方案中，所述食品组合物还包含姜黄素类化合物的源。

在最优选的实施方案中，所述食品组合物包含以干物质为基础约250ppm至约2000ppm的量的姜黄素类化合物(curcuminoids)。

在一些实施方案中，所述食品组合物还包含姜黄提取物，例如在喂食时以约300ppm至约700ppm的量。

在一些实施方案中，所述食品组合物还包含鼠尾草酸/鼠尾草酚的源。

在一些实施方案中，所述食品组合物还包含迷迭香提取物，作为鼠尾草酸和鼠尾草酚的源。至于宠物食品组合物中的其他成分，宠物食品组合物中存在的迷迭香提取物的量可以根据鼠尾草酸和鼠尾草酚中所述提取物的含量而改变。

在一些实施方案中，所述食品还包含迷迭香提取物，该迷迭香提取物可以以约50ppm至约120ppm的喂食时的量存在。

在最优选的实施方案中，所述食品组合物包含以干物质为基础的约20ppm至约90ppm的量的鼠尾草酸和鼠尾草酚。

在一些实施方案中，所述食品组合物还包含胡椒碱的源。

在一些实施方案中，所述食品组合物是干的狗食品并且还包含胡椒碱的源。

在一些实施方案中，胡椒碱的源可以由胡椒提取物组成。

在根据本公开的食品组合物的一些实施方案中，胡椒碱的源由胡椒提取物组成，并且胡椒提取物在组合物中以喂食时约15ppm至约35ppm的量存在。

在最优选的实施方案中，根据本公开的食品组合物包含以干物质为基础的14ppm至60ppm的量的胡椒碱。

在一些实施方案中，根据本公开的食品组合物，胡椒碱(peperidine)的源由胡椒提取物组成。

取决于胡椒碱中的所述胡椒提取物的含量，该胡椒提取物最优选地以适合于获得食品组合物中的最终含量(以干物质为基础)的14ppm至60ppm的量存在于组合物中。

在其中所述宠物食品组合物是干的狗食品组合物的实施方案中，所述干的狗食品组合物包含胡椒提取物形式的胡椒碱的源，胡椒提取物在干的狗食品组合物中以15ppm至35ppm的喂食时的量存在。

在一些实施方案中，所述食品组合物包含姜黄提取物和/或迷迭香提取物，和/或胡椒提取物，和/或绿茶提取物，和/或石榴提取物。在这些实施方案的其中一些中，所述食品组合物包含姜黄素类化合物和迷迭香提取物的源，以及可选地还有胡椒碱的源。在一些实施方案中，所述食品组合物为干的狗食品组合物。

本公开还涉及贯穿本说明书所定义的食品组合物，其用于支持患有癌症并正在经受化疗的狗。

附图说明

图1说明了用适度的脂肪营养组合物喂食的动物的随时间变化的粪便分数。

纵坐标：每周粪便分数的平均值。

横坐标：(i)左边系列(left panel)：动物试验组；(ii)右边系列：动物对照组。在左边系列和右边系列的每一个中，以及每个系列的从左至右：开始给动物饲喂组合物(左边系列)或常规组合物(右边系列)后的时间段：(i)第1周，(ii)第2周，(iii)第3周，(iv)第4周，(v)第5周，(vi)第6周，(vii)第7周，(viii)第8周。

图2说明了用适度的脂肪营养组合物喂食的动物随时间变化的总体QOL分数值。

纵坐标：病例的百分数

横坐标：(1)从左至右每组成对的条形：(i)喂食适度的脂肪营养组合物的动物，(ii)饲喂常规营养组合物的动物。(2)从左至右成对的条形的组：(i)基准线，(ii)第2周，(iii)第4周，(iv)第6周，(v)第8周。在每个条形中的从上到下的彩色部分：(i)差，(ii)中等，(iii)良好，(iv)很好，(v)极好。在每个部分中的数字表示动物的数量。

图3：植物提取物对各种狗肿瘤细胞系的抗增殖效果。

图3A说明了石榴40％鞣花酸提取物

图3B说明了绿茶提取物(Naturex)对多种狗肿瘤细胞系的抗增殖活性。从图的上部到下部的纵坐标：BACA、BR、C2、CF33.MT、CF41.Mg、CLBL-1、D17、HMPOS、K9。横坐标：细胞培养物中的提取物的最终浓度，以μg/ml表示。

图3C说明了黑胡椒提取物

图3D说明了迷迭香提取物

图3E说明了姜黄根(Naturex)提取物对多种狗肿瘤细胞系的抗增殖活性。从图的上部到下部的纵坐标：BACA、BR、C2、CF33.MT、CF41.Mg、CLBL-1、D17、HMPOS、K9。横坐标：细胞培养物中的提取物的最终浓度，以μg/ml表示。

图3F说明了石榴40％石榴苷(punicosides)提取物

图4说明了两种植物提取物的组合对多种狗肿瘤细胞系的抗增殖效果。

图4A说明了迷迭香提取物和姜黄提取物的组合对C2癌细胞系的增殖的抗增殖效果。曲线：(i)短划线(dashed line)：姜黄提取物，(ii)点虚线(dotted line)：70％w/w鼠尾草酸的迷迭香提取物；(iii)实线：姜黄提取物和70％w/w鼠尾草酸的迷迭香提取物的组合。纵坐标：与没有这些提取物的对照培养物相比，增殖细胞的百分比。横坐标：细胞培养物中的提取物组合的最终浓度，以μg/ml表示。

图4B说明了迷迭香提取物和姜黄提取物的组合对CMT-12癌细胞系的增殖的抗增殖效果。曲线：(i)短划线(dashed line)：姜黄提取物，(ii)点虚线(dotted line)：70％w/w鼠尾草酸的迷迭香提取物；(iii)实线：70％w/w鼠尾草酸的姜黄提取物和迷迭香提取物的组合。纵坐标：与没有这些提取物的对照培养物相比，增殖细胞的百分比。横坐标：细胞培养物中的提取物组合的最终浓度，以μg/ml表示。

图4C说明了迷迭香提取物和姜黄提取物的组合对D17癌细胞系的增殖的抗增殖效果。曲线：(i)短划线(dashed line)：姜黄提取物，(ii)点虚线(dotted line)：鼠尾草酸含量为70％w/w的迷迭香提取物；(iii)实线：70％w/w鼠尾草酸的姜黄提取物和迷迭香提取物的组合。纵坐标：与没有这些提取物的对照培养物相比，增殖细胞的百分比。横坐标：细胞培养物中的提取物组合的最终浓度，以μg/ml表示。

图5说明了来自不同来源的不同植物提取物对多种狗肿瘤细胞系的抗增殖活性。

图5A说明了以下提取物组合对狗肿瘤细胞系C2的抗增殖活性：(i)姜黄提取物(Naturex)和迷迭香提取物

图5B说明了以下提取物组合对狗肿瘤细胞系CMT-12的抗增殖活性：(i)姜黄提取物和迷迭香提取物

图5C说明了以下提取物组合对狗肿瘤细胞系D17的抗增殖活性：(i)姜黄提取物和迷迭香提取物

图6说明了软琼脂集落形成试验中的天然提取物的抗增殖活性。纵坐标：与在没有提取物的情况下进行的对照培养物相比的活细胞百分比。横坐标中从左到右的条形：(i)对照(DMSO)，(ii)0.4μg/ml姜黄素提取物(来自Naturex的姜黄提取物)，(iii)0.8μg/ml迷迭香

图7说明了多种植物提取物对犬类细胞的细胞毒活性。纵坐标：与没有所述植物提取物的对照培养物相比的活细胞的百分比。横坐标：(1)从左到右成组的条形表示下列狗肿瘤细胞系：(i)CDF，(ii)C2，(iii)CMT-12，(iv)D17；(2)在每组条形中，从左到右：(i)对照(DMSO)，(ii)6.3μg/ml姜黄提取物(Naturex)，(iii)6.3μg/ml迷迭香提取物

图8说明了植物提取物的抗增殖活性和细胞毒性作用的机制。

图8A至图8D由流式细胞术试验的结果组成，其中每个象限表示对应于以下事件的数量(i)左下象限：被评估为存活的细胞，(ii)右下象限被评估为早期凋亡的细胞，(iii)右上象限：被评估为晚期凋亡/坏死的细胞。纵坐标：表达7-AAD的细胞的荧光信号，以任意单位表示。横坐标：膜联蛋白-V阳性细胞的荧光信号，以任意单位表示。

图8E说明了早期凋亡细胞(膜联蛋白V阳性和7-AAD阴性细胞的右下象限)的百分比，表示为平均值±标准差3次独立重复。在每个细胞系内，具有不同字母的平均值彼此显著不同(p<0.05)。纵坐标：凋亡细胞百分比。横坐标：(1)成组的条形，从左至右表示下列狗肿瘤细胞系：C2、CMT-12和D17。(2)每组条形从左到右：(i)对照(DMSO)，(ii)6.3μg/ml姜黄提取物(Naturex)，(iii)6.3μg/ml迷迭香提取物

图9说明了植物提取物的凋亡活性。纵坐标：激活的半胱天冬酶3/7的差异倍数。横坐标：(1)成组的条形，从左至右表示下列狗肿瘤细胞系：C2、CMT-12和D17。(2)每组条形从左到右：(i)对照(DMSO)，(ii)6.3μg/ml姜黄提取物(Naturex)，(iii)6.3μg/ml迷迭香提取物

图10说明了植物提取物的抗氧化活性。纵坐标：活性氧(ROS)产量的差异倍数。横坐标：(1)成组的条形，从左至右表示下列狗肿瘤细胞系：C2、CMT-12和D17。(2)每组条形从左到右：(i)对照(DMSO)，(ii)6.3μg/ml姜黄提取物(Naturex)，(iii)6.3μg/ml迷迭香提取物

图11说明了植物提取物对SAPK/JNK通道的激活。

图11A表示用C2细胞系进行的蛋白质印迹实验的结果。图11B表示用CMT-12细胞系进行的蛋白质印迹实验的结果。

图11A和图11B，从左至右的泳道：(i)孵育12h后的对照(DMSO)，(ii)孵育24h后的对照(DMSO)，(iii)孵育12h后的6.3μg/ml的姜黄提取物(Naturex)，(iv)孵育24h后的6.3μg/ml的姜黄提取物(Naturex)，(v)孵育12h后的6.3μg/ml的迷迭香提取物

图12说明了由迷迭香提取物处理的细胞对姜黄素的积累。

图12A：对C2细胞系的作用。图12B：对CMT-12细胞系的作用。图12C：对D17细胞系的作用。

在图12A、图12B和图12C中。纵坐标：与没有迷迭香提取物的对照培养物相比，姜黄素的差异倍数。横坐标，从左到右的条形：(i)对照(DMSO)，(ii)3.1μg/ml的姜黄提取物(Naturex)，(iii)3.1μg/ml的迷迭香提取物

具体实施方式

本公开旨在为(i)正在进行化疗和/或(ii)经过化疗的治疗期之后(每日消耗)的被诊断为患有癌症的狗提供营养产品。这种食物组合物应能够维持良好的QOL，限制化疗的副作用(例如通过“支持治疗”帮助狗抗击它们的抗癌)并维持良好的营养状态(体重维持，良好的消化健康)。

通过提供一种具有高含量的蛋白质和适量的碳水化合物以及适量的脂肪的营养组合物，已经实现了该目标。如本文的实施例中所示，当将这种营养组合物提供给患有癌症的狗尤其是给进行抗癌化学治疗的狗时，其耐受性良好，并显著减少了疾病病症且显著改善了它们的生活质量。此外，用本文公开的以高蛋白/适量碳水化合物和脂肪喂养的狗的生活质量的改善在该饮食疗法开始后的短时间后很容易出现，通常在该饮食疗法开始仅四周后就出现。

本公开涉及具有高含量蛋白质和适量碳水化合物和脂肪的食品组合物。这种组合物可用于支持患有癌症的动物，并且更特别地用于支持患有癌症正在进行治疗(例如化疗)的动物。该食品组合物还可以用于支持患有癌症正在进行治疗(例如化疗)的动物的方法中。该组合物还可以用于治疗癌症的方法中。

本公开涉及一种食品组合物，其包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约60重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

在一些实施方案中，本公开的食品组合物由湿宠物食品组合物例如湿的狗食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的食品组合物由半湿的宠物食品组合物例如半湿的狗食品组合物组成。

在一些其他实施方案中，本公开的食品组合物由干的宠物食品组合物组成例如干的狗食品组合物。

如本文所用，“约”或“大约”意指如本领域普通技术人员所确定的在特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可以表示在三个或三个以上的标准偏差。可替代地，“约”可以表示给定值的至多20％、优选地至多10％、更优选地至多5％、并且更优选地至多1％的范围。同样地，特别是对于生物系统或过程，该术语可以表示值的数量级内，优选在五倍以内，更优选在两倍以内。

如本文所用，术语“干宠物食品”，“干食品”，“湿宠物食品”，“湿食品”，“半湿宠物食品”和“半湿食品”指定营养全面的宠物食品组合物，其包括宠物动物在它的饮食中食用的任何产品。宠物食品组合物优选是熟的产品。它可以加入肉或动物衍生的材料(例如牛肉、鸡肉、火鸡、羊肉、鱼肉、血浆、髓骨等或其中一种或多种)。宠物食品组合物可替代地可以是不含肉的(优选包括肉类替代品，例如大豆、玉米麸质或大豆产品)以提供蛋白质的源。

如本文所用，“干”宠物食品组合物具有15％或更低的水分含量，例如水分含量为1％至15％。

如本文所用，“半湿”宠物食品组合物具有大于15％至50％的水分含量。

如本文所用，“湿”宠物食品组合物具有90％或更低的水分含量，例如水分含量大于50％至90％。

在其一些方面，本公开涉及可用于患有癌症的狗的食品组合物，其包含脂肪、纤维和蛋白质，其特征在于，其包含以干物质为基础的约10％至约20％的量的脂肪，以干物质为基础的约5％至约15％的量的脂肪，以及以干物质为基础的约30％至约50％的量的蛋白质。

本公开涉及包含脂肪、纤维和蛋白质的食品组合物，并且其中以组合物的干物质的总重量计，脂肪以约10重量％至约20重量％的量被包含，纤维以约5重量％至15重量％的量被包含，以及蛋白质以约30重量％至约50重量％的量被包含。

本公开涉及一种食品组合物，其包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约50重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

表述“干物质(DM)为基础”必须解释为一种通过表示相对于其干物质含量的其浓度来表示饲料中营养素或成分的浓度的方法(水分一旦去除后剩余的浓度)。相反地，表述“喂食时”必须解释为一种通过表示其被喂食的状态的浓度来表示饲料中营养物或成分的浓度的方法(包括水分)。

如前所述，本公开的食品组合物可以由干宠物食品组合物或半湿宠物食品组合物或湿宠物食品组合物组成。

本文所述的宠物食品组合物中的脂肪、纤维、蛋白质和碳水化合物的各自含量根据所述组合物干物质的总重量表示，因此与所述宠物食品组合物的水分含量无关。

贯穿本说明书描述的食品组合物可以包含的其他成分可以用“ppm”单位(也称为“百万分之一”)表示，这是说明组合物中所含物质的量的另一种常规方法，包括当包含在宠物食品组合物中时。

在本说明书通篇中，以“ppm”为单位表示的给定物质的量是指(i)“喂食时”的组合物中的量或(ii)如将要说明的，以“干物质为基础”以ppm表示的量。

当给定物质的量在本文中以“喂食时”的ppm表示时，以ppm为单位的量值可以根据宠物食品组合物的水分含量而改变。说明性地，如果以干物质为基础，具有50％水分含量并且包含100ppm“喂食时”给定物质的宠物食品组合物与具有30％水分含量并且包含140ppm“喂食时”所述给定物质的宠物食品组合物，具有相同量的所述给定物质，即在两种情况下，宠物食品组合物均包含以干物质为基础的200ppm的所述给定物质。

如本领域中通常的，以“喂食时的ppm”表示的宠物食品组合物中包含的给定物质的量使用以下公式很容易转换成以该宠物食品组合物的总的干物质计表示的所述给定物质的量：

Y mg/100g DM＝(X ppm“喂食时”)*100/(％干物质)，其中

-Y是宠物食品组合物中包含的每100g干物质(“DM”)中所述给定物质的以mg位的量。

-X是宠物食品组合物中所述给定物质的以ppm为单位的量，

-％干物质是宠物食品成分中干物质的百分比，

也可以使用下面的其他公式：

(％X“喂食时”)*100/(％干物质)＝Y g/100g DM，其中

-％X是“即食”宠物食品组合物中所述给定物质的以重量百分比表示的量，

-％干物质是“即食”宠物食品组合物中干物质的百分比，

-Y是“即用”宠物食品组合物中包含的每100g干物质(“DM”)中所述给定物质的以g为单位的量。

至于本公开的目的，除非另有说明，干的狗食品组合物中包含的物质的百分比由基于所述组合物的干物质的总重量的重量百分比组成。

如本文所述的食品组合物的第一方面由其中包含的适当水平的脂肪组成。如上所述，科学界普遍认为，正在进行癌症治疗的动物应该对高含量的脂肪的食物产生真正的兴趣，因为它代表不容易被癌细胞利用的能量来源。本公开的一个具体创新方面是，与该偏见相反，首次描述了一种包含相对适当水平的脂肪的组合物。发明人已经定义了食品组合物中应包含的最佳脂肪含量，该组合物用于患有癌症的狗特别是正在接受抗癌治疗(例如通过化疗进行的癌症治疗)的患癌的狗。发明人在本文中确定脂肪含量不应太低，以使所得到的狗食品组合物在卡路里含量上具有至少最低的要求。然而，发明人在本文中还确定脂肪的含量不应太高，以使癌症病患的动物很好地耐受所得到的狗食品组合物。众所周知，患病动物的癌症治疗会引起消化系统功能的改变。因此，发明人在设计被患癌狗良好耐受特别是被进行癌症治疗的患癌狗类良好耐受的组合物时格外小心。

在优选的实施方案中，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，本文所述的干的狗食品组合物包含10重量％至20重量％的量的脂肪，优选12重量％至16重量％，并且还更优选为约13重量％的量。

本说明书中使用的表述“脂肪”或“脂肪来源”包括任何食品可接受的脂肪和/或油，而与它们在室温下的稠度无关，即与所述“脂肪来源”以实质上流体形式或以实质上固体形式存在无关。根据本公开的组合物可以包含动物和/或植物来源的脂肪。脂肪可以通过本领域技术人员已知的多种来源中的任何一种来提供。植物脂肪来源包括但不限于小麦、向日葵、红花、油菜籽、橄榄、琉璃苣、亚麻籽、花生、黑加仑子、棉籽、小麦、胚芽、玉米胚芽以及源自这些和其他植物脂肪来源的油。动物来源包括例如但不限于鸡脂肪、火鸡脂肪、牛脂肪、鸭脂肪、猪脂肪、羊脂肪等，鱼油或任何肉类、肉类副产品、海鲜、乳制品、蛋等。食物的脂肪含量可以通过本领域技术人员已知的许多方法来确定。

如本文所述的食品组合物的第二具体方面由其中包含的纤维水平组成。

表述“纤维”类似于“膳食纤维”，并且出于本公开的目的应解释为总纤维，意指其包括可溶性纤维和不溶性纤维。可溶性纤维(也称为可发酵纤维)可以定义为在小肠中抵抗消化和吸收，而在大肠中进行完全或部分发酵。作为可溶性纤维的非限制性实施例，可以提及甜菜浆、瓜尔豆胶、菊苣根、车前草、果胶、蓝莓、蔓越莓、南瓜、苹果、燕麦、豆、柑橘、大麦或豌豆。优选的可溶性纤维是菊苣浆。通过向结肠细胞提供短链脂肪酸作为能量来源，可溶性纤维被认为具有益生元作用。相反地，不溶性纤维(也称为非发酵性纤维)可以定义为在小肠中抵抗消化和吸收并且在大肠中抵抗发酵的非淀粉多糖。作为不溶性纤维的非限制性实施例，可以提及纤维素、全麦产品、燕麦、玉米麸、亚麻籽、葡萄、芹菜、绿豆、花椰菜、土豆皮、水果皮、蔬菜皮、花生壳和大豆纤维。优选的不溶性纤维是纤维素。不溶性纤维被认为对运输和压载效果有用。在一个优选实施方案中，以干物质为基础，本公开的组合物包含5至15％量的纤维，优选为7至10％，并且还更优选为约8.9％。

在另一个实施方案中，本文所述的食品组合物还可包含用于改善消化健康的车前草，因为车前草将赋予液体粪便稠度并软化干燥的粪便。优选地，以干物质为基础，即基于组合物的干物质的总重量，本文公开的干的狗食品组合物包含0.2重量％至1重量％的量的车前草，更优选地为约0.5重量％的量。

本文公开的食品组合物的第三个具体方面由其中包含的蛋白质的水平组成。蛋白质水平应高，以确保维持瘦体质量。根据本公开的食品组合物可以包含一种或多种不同的蛋白质。通常，本文所述的食品组合物包含多种蛋白质，该多种蛋白质包含在制造工艺中使用的蛋白质来源中。在一些实施方案中，食品组合物中包含的蛋白质为天然形式。在一些其他实施方案中，蛋白质可以以至少部分水解的形式存在，其包括几乎完全水解的蛋白质。根据本公开的食品组合物可以加入以肉或动物衍生材料(例如牛肉、鸡肉、火鸡、羊肉、鱼肉、血浆、髓骨等或其一种或多种)形式的蛋白质。在一些其他实施方案中，本文所述的食品组合物可以不含肉，并且优选包含肉类替代品蛋白质源例如大豆、玉米麸质或任何其他含蛋白质的大豆产品，以提供蛋白质源。本文公开的食品组合物可包含附加的蛋白质源，例如大豆浓缩蛋白、牛奶蛋白、麸质等。

在一些实施方案中，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，本文所述的食品组合物还包含约15重量％至约40重量％的量的碳水化合物。

如本文所用的表述“碳水化合物”包括在体内水解时被代谢为能量的多糖和糖。食品的碳水化合物含量可以通过本领域技术人员已知的许多方法确定。但是，在本说明书中，除非明确说明相反的含义，碳水化合物百分比计算为无氮提取物(“NFE”)，可以如下所示计算：

NFE＝100％-水分％-蛋白质％-脂肪％-灰分％-粗纤维％。

碳水化合物可以本领域技术人员已知的多种碳水化合物源中的任何一种形式提供，包括燕麦纤维、纤维素、花生壳、甜菜浆、蒸谷米、玉米淀粉、玉米麸质粉以及那些源的任何组合。供应碳水化合物的谷物包括但不限于小麦、玉米、大麦和大米。

在根据本公开的食品的优选实施方案中，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，根据本公开的干宠物食品组合物的水分含量在1重量％至15重量％范围内，有利地在5重量％至12重量％的范围内，更优选为8重量％至10重量％的范围内。在最优选的实施方案中，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，水分含量为约9.5重量％。

在一些实施方案中，根据本公开的食品组合物还包含抗氧化剂的源。

表述“抗氧化剂”是指能够与自由基反应并中和它们的物质或成分。这种物质的说明性实施例包括但不限于类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素)、番茄红素和叶黄素、硒、辅酶Q10(泛醌)、生育三烯酚、大豆异黄酮、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰半胱氨酸、维生素E、维生素C、硫辛酸和左旋肉碱。

在一个优选实施方案中，食品组合物包含维生素C。

在一个优选实施方案中，食品组合物包含维生素E。

在一个优选实施方案中，食品组合物包含类胡萝卜素。优选地类胡萝卜素是叶黄素和β-胡萝卜素。

在一个优选的实施方案中，食品组合物还包含叶黄素。

在一些实施方案中，食品组合物包含这种抗氧化剂的组合，例如维生素C和/或维生素E和/或类胡萝卜素和/或牛磺酸的组合。在一些优选实施方案中，食品组合物包含维生素C和维生素E和类胡萝卜素的组合。

在一些优选实施方案中，根据本公开的食品组合物还包含含有维生素C的抗氧化剂的源。

在最优选实施方案中，根据本公开的食品组合物包含以干物质为基础200ppm至600ppm的量的维生素C。

在一些最优选实施方案中，根据本公开的食品组合物是干宠物食品组合物并且包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包含维生素C，并且其中维生素C以干物质为基础以220ppm至440ppm的量存在。

在一些最优选实施方案中，根据本公开的食品组合物是湿宠物食品组合物并且还包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包含维生素C，并且其中维生素C以干物质为基础以200ppm至600ppm的量存在。

在一些优选实施方案中，根据本公开的食品组合物是干宠物食品组合物并且还包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包含维生素E，并且其中食品组合物中维生素E的最终量是以干物质为基础的660ppm至1100ppm的量。

在一些优选实施方案中，根据本公开的食品组合物是湿宠物食品组合物并且还包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包含维生素E，并且其中食品组合物中维生素E的最终量是以干物质为基础的600ppm至2000ppm的量，包括800ppm至1300ppm的量。

在一些优选实施方案中，根据本公开的食品组合物是干宠物食品组合物并且还包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包含类胡萝卜素。

在根据本公开的干宠物食品的最优选实施方案中，食品组合物中的类胡萝卜素以干物质为基础以2ppm至12ppm的量存在。

在一些其他优选实施方案中，根据本公开的食品组合物是湿宠物食品组合物并且还包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包含类胡萝卜素。

在一些其他优选实施方案中，根据本公开的食品组合物是湿宠物食品组合物并且还包含类胡萝卜素，并且其中在湿宠物食品中类胡萝卜素以干物质为基础以2ppm至100ppm的量存在，包括30ppm至100ppm的量。

作为非限制性实施方案，可以使用称为“CELT鸡尾酒(CELT cocktail)”的抗氧化剂的组合，其包含维生素C(约300ppm)、维生素E(约800ppm)、叶黄素(约5ppm)、牛磺酸(约0.625g/MCal)和维生素D3(约1000IU/kg)。

在另一个实施方案中，根据本公开的食品组合物还可包含丁酸钠，作为短链脂肪酸和结肠细胞的能量来源用于益生元作用。优选地，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，食品组合物包含0.2重量％至1重量％的丁酸钠，更优选约0.5重量％的丁酸钠。

与上述丁酸钠的目的相同，根据本公开的食品组合物还可包含沸石以改善粪便稠度。优选地，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，食品组合物包含0.5重量％至1.5重量％的沸石，更优选约1重量％。

在一些优选实施方案中，如本文所述的食品组合物还可包含精氨酸作为补充剂以增强特异性免疫。优选地，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，食品组合物包含1重量％至4重量％的精氨酸，更优选2重量％至3重量％，并且还更优选约2.7重量％。

在另一个实施方案中，食品组合物还可包含EPA/DHA以改善代谢状态并产生抗炎作用。优选地，以干物质为基础，即基于组合物干物质的总重量，食品组合物包含0.4重量％至0.8重量％的EPA/DHA，更优选约0.6重量％。

如本文的实施例所示，根据本公开的食品组合物可能还需要包含一种或多种赋有抗癌活性的提取物，包括对癌细胞具有细胞毒性的物质，包括对癌细胞具有抗增殖和/或促凋亡作用的物质，如在本文的实施例中还示出的，根据本公开的干狗食品组合物还需要包含两种或多种赋有抗癌活性的物质的组合，并且尤其是已确定具有协同抗癌活性的两种或多种具有抗癌活性的物质的组合。赋有抗癌活性的物质的组合包括赋有抗癌活性的两种物质的组合以及赋有抗癌活性的三种物质的组合，特别是具有协同抗癌活性的物质的组合。

本文公开的食品组合物的另一个特定和优选的实施方案是包含姜黄素类化合物。

因此，在一些实施方案中，本文所述的食品组合物还包含姜黄素类化合物的源。

姜黄素类化合物包括姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素和/或四氢姜黄素。姜黄素类化合物是特别是存在于印度香料姜黄中的天然酚。姜黄来自植物姜黄的根。在植物科姜黄属姜科的其他物种的根中也发现了姜黄素类化合物。特别地，姜黄包含60-80％的姜黄素、15-30％的去甲氧基姜黄素和2-6％的双去甲氧基姜黄素。本公开的组合物中的姜黄素类化合物可以是任何形式，包括粉末或脂质提取物。

在最优选的实施方案中，根据本公开的食品组合物，姜黄素类化合物以干物质为基础为以250ppm至约2000ppm的量存在。

在一个优选的实施方案中，姜黄素类化合物的源包括姜黄提取物(CurcumaLonga)。作为非限制性实施例，可以提及(i)由Arjuna商业化的姜黄提取物

如技术人员容易理解的，根据本公开的宠物食品组合物中包含的姜黄提取物的量取决于浓度。

说明性地，包含约1000ppm姜黄素类化合物的宠物食品组合物可以选自(i)包含约1163ppm姜黄提取物的宠物食品组合物，所述姜黄提取物具有86％wt/wt的姜黄素类化合物，(ii)包含约1176ppm姜黄提取物的宠物食品组合物，所述姜黄提取物具有85％wt/wt的姜黄素类化合物，或(iii)包含约5000ppm姜黄提取物的宠物食品组合物，所述姜黄提取物具有20％wt/wt的姜黄素类化合物。

在其中食品组合物是干的狗食品组合物的实施方案中，所述姜黄提取物在干食品组合物中以喂食时的300ppm至700ppm的量存在，优选地喂食时的400ppm至600ppm，并且还更优选地喂食时的500ppm的量。

所述姜黄提取物在干的狗食品组合物中以喂食时的300ppm至700ppm的量存在，优选地喂食时的400ppm至700ppm，并且还更优选地是喂食时的500ppm的量。

在其中食品组合物是干的狗食品组合物的另一个优选实施方案中，宠物食品组合物可以包含以约300ppm至约700ppm的量存在的所述姜黄提取物。

在最优选的实施方案中，根据本公开的食品组合物，姜黄素类化合物以干物质为基础以约250ppm至约2000ppm的量存在。

根据一些其他实施方案，本文所述的食品组合物可包含鼠尾草酸/鼠尾草酚。在一些优选的方面，如本文公开的食品组合物还包含鼠尾草酸/鼠尾草酚的源。

在一个优选的实施方案中，鼠尾草酸/鼠尾草酚的源由迷迭香提取物(Rosmarinusofficinalis)组成。作为非限制性实施例，可以提及来自Vitiva的迷迭香提取物

所述迷迭香提取物以干物质为基础可以以55ppm至140ppm的量存在于具有10％水分含量的干宠物食品组合物中，优选80ppm至120ppm，并且还更优选以干物质为基础约100ppm的量。在又一个优选的实施方案中，食品组合物迷迭香提取物以干物质为基础以约55ppm至约140ppm的量存在。鼠尾草酸/鼠尾草酚的其他可用源也可以选自鼠尾草提取物(Salvia Officinalis)，选自唇形科植物家族，如百里香、牛至、萨韦罗(savero)、柠檬香蜂草或牛膝草。

在根据本公开的食物的一些实施方案中，所述食物还可以包含以干物质为基础量为约20至约90ppm的鼠尾草酸和鼠尾草酚。

如本文所用，“鼠尾草酸和鼠尾草酚”的量意指由宠物食品组合物中的(i)鼠尾草酸的量和(ii)鼠尾草酚的量总和得到的总量。

本公开的另一个特定和优选的实施方案是胡椒碱的包含。在一个优选的方面，本文公开的食品组合物还包含胡椒碱的源。

在根据本公开的食品组合物的最优选的实施方案中，所述组合物可以包含以干物质为基础14ppm至60ppm的量的胡椒碱。

在一个优选的实施方案中，胡椒碱的源由黑胡椒提取物(Piper nigrum)组成。作为非限制性实施例，可以提及来自Sabinsa的胡椒提取物

在又一个优选的实施方案中，根据本公开的食品组合物可以包含约15ppm至约35ppm的量的胡椒提取物。胡椒碱的其他可用源也可以选自绿和白胡椒、胡椒属或长胡椒(荜拨(Piper longum)和假荜拔(Piper officinarum))。在又一个优选的实施方案中，根据本公开的食品组合物的特征在于，所述组合物中姜黄提取物以约300ppm至约700ppm的量存在，和/或所述组合物中迷迭香提取物以约50ppm至约110ppm的量存在，和/或所述组合物中胡椒提取物以约15ppm至约35ppm的量存在。

姜黄提取物(富含姜黄素)和迷迭香提取物(富含鼠尾草酸)协同作用以减少赘生性细胞生长(如以下实施例所示)。该提取物组合通过半胱天冬酶3/7激活导致细胞凋亡。两种提取物均具有抗氧化作用，可减少活性氧(ROS)。此外，姜黄提取物和迷迭香提取物暴露增加了活化的c-Jun N末端激酶(JNK)。经进一步检查，已发现迷迭香治疗引起姜黄素的细胞积累显著增加。细胞内这种姜黄素水平的增加可以在协同作用中起作用。富含胡椒碱的胡椒提取物还能够减少各种肿瘤细胞的增殖(如实施例所证明)，此外，它提高姜黄素等多种营养素的吸收率和生物利用度。

在一些实施方案中，根据本公开的食品组合物还可包含多酚的源例如儿茶素。儿茶素(黄酮类化合物)的源可以优选地由绿茶提取物(Camellia sinensis)组成。作为非限制性实施例，可以提及来自Naturex的提取物。绿茶提取物是指来自绿茶叶的草药衍生物。绿茶提取物可以通过软泡、软提取物、干提取物和部分纯化提取技术制成。绿茶提取物可包含绿茶儿茶素(GTC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和黄酮类化合物如山奈酚、槲皮素和杨梅素。多酚的其他常见源是，但不限于可可、矢车菊根、茶树(包括白茶、红茶和乌龙茶)以及葡萄酒。

在一些其他实施方案中，根据本公开的食品组合物还可包含鞣花酸/安石榴苷的源。鞣花酸/安石榴苷的源可优选由石榴提取物(Punica granatum)组成。作为非限制性实施例，可以提及来自Polinat的提取物

在一个优选的实施方案中，根据本公开的食品组合物还包含姜黄提取物和/或迷迭香提取物，和/或胡椒提取物，和/或绿茶提取物，和/或石榴提取物。

在一些实施方案中，本文公开的食品组合物包含姜黄素类化合物源和迷迭香提取物的组合。在这些实施方案的一些中，所述宠物食品组合物还包含胡椒碱源。

本说明书包括用于制备食品组合物的方法。可以根据本领域已知的任何方法来实现所述的食品的制造方法。

如本公开中的其他部分所述，根据本公开的干宠物食品组合物具有小于15％的水分含量，例如1％至15％的水分含量，例如约10％的水分含量，或例如约12％的水分含量。

因此，本公开包括干宠物食品组合物，所述干宠物食品组合物包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约60重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

本公开尤其涉及干的狗食品组合物，所述干的狗食品组合物包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约50重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

在一些实施方案中，所述干宠物食品组合物包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包括维生素C，并且其中维生素C以喂食时的约200ppm至约400ppm的量存在，和/或维生素E，以喂食时的约600ppm至约1000ppm的量存在，和/或类胡萝卜素，以喂食时的约2ppm至约10ppm的量存在。

在一些实施方案中，品组合物包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包括维生素C，其中维生素C以干物质为基础以约220ppm至约440ppm的量存在，和/或维生素E，其中维生素E以约660ppm至约1100ppm的量存在，和/或类胡萝卜素，其中类胡萝卜素以约2ppm至约12ppm的量存在，以ppm为单位的量以干物质为基础表示。

在一些实施方案中，所述干宠物食品组合物包含姜黄提取物，姜黄提取物在干的狗食品组合物中以喂食时的300ppm至700ppm的量存在，优选为喂食时的400ppm至600ppm，而且还更优选为喂食时的500ppm。

在一些实施方案中，所述干宠物食品组合物包含姜黄提取物，姜黄提取物在干狗食品组合物中以干物质为基础可以以360ppm至780ppm的量存在，优选以干物质为基础以440ppm至670pm，并且更优选以干物质为基础以550ppm。

在最优选的实施方案中，所述干宠物食品组合物包含姜黄素类化合物，其以干物质为基础以约250ppm至约2000ppm的量存在。

在一些实施方案中，所述干宠物食品组合物还包含鼠尾草酸/鼠尾草酚的源，例如迷迭香提取物。所述迷迭香提取物在所述干的狗食品组合物中以喂食时的50至120ppm的量存在，优选以喂食时的70至100ppm，并且还更优选以喂食时的约90ppm的量。在又一个优选的实施方案中，干宠物食品组合物迷迭香提取物以喂食时的约50ppm至约120ppm的量存在。

在一些实施方案中，所述干宠物食品组合物还包含鼠尾草酸/鼠尾草酚的源，例如迷迭香提取物。所述迷迭香提取物在所述干的狗食品组合物中可以干物质为基础以约55ppm至约130ppm的量存在。

在干宠物食品组合物的最优选的实施方案中，所述组合物包含鼠尾草酸和鼠尾草酚，其存在的量以干物质为基础为20ppm至90ppm。

如本文所用，“鼠尾草酸和鼠尾草酚”的量是指由(i)鼠尾草酸的量和(ii)鼠尾草酚的量之和得出的总量。

在一些实施方案中，所述干宠物食品组合物包含胡椒碱的源。在一些实施方案中，胡椒碱的源由黑胡椒提取物组成。所述胡椒提取物在干的狗食品组合物中可以以喂食时的15至35ppm的量存在，优选以喂食时的20至30ppm，还更优选以喂食时的约27ppm。

在干宠物食品组合物的实施方案中，所述胡椒提取物在宠物食品组合物中以干物质为基础可以以15ppm至35ppm的量存在，优选以干物质为基础以20ppm至30ppm，并且更优选以干物质为基础以约30ppm的量。

在根据本公开的干宠物食品的一些实施方案中，胡椒碱的源由胡椒提取物组成。

在最优选的实施方案中，胡椒碱在干食品组合物中以干物质为基础以14ppm至60ppm的量存在。

在又一个优选的实施方案中，根据本公开的干宠物食品组合物的特征在于，姜黄提取物在所述组合物中以喂食时的约300ppm至约700ppm的量存在，和/或迷迭香提取物在所述组合物中以喂食时的约50ppm至约120ppm的量存在，和/或胡椒提取物在所述组合物中以喂食时的约15ppm至约35ppm的量存在。

在其他实施方案中，根据本公开的干宠物食品组合物的特征在于，姜黄提取物在所述组合物中以干物质为基础以约360ppm至约780ppm的量存在，和/或迷迭香在所述组合物中以约55ppm至约130ppm的量存在，和/或胡椒提取物在所述组合物中以干物质为基础以约15ppm至约35ppm的量存在。

该食品组合物可以通过将成分混合在一起并捏合以制成可以被烹饪的一致的面团来制造。制作干宠物食品的工艺通常是通过烘烤和/或挤压完成的。通常将面团送入称为膨胀机和/或挤出机的机器中，该机器使用加压蒸汽或热水来烹饪成分。当处于挤出机内时，面团处于极端压力和高温下。然后将面团推过模具(特定大小和形状的孔)，然后用刀切掉。将膨化的生面团片通过干燥机制成粗磨物，以使水分下降至确定的目标，从而确保食品稳定直至消耗。然后可以将粗磨物喷洒脂肪、油、矿物质、维生素、天然提取物、鸡尾酒，并可选地密封包装。

在一个优选的实施方案中，干宠物食品由粗磨物形式组成。优选地，例如但不限于，粗磨物包括微粒、颗粒、宠物食品块、脱水肉、肉类似物、蔬菜及它们的组合；以及宠物零食，例如肉类或蔬菜干、生皮和饼干。

干宠物食品组合物优选地进行包装。通过这种方式，消费者能够从包装中识别出食品中的成分并确认其适合所考虑的特定宠物。包装件可以是金属、塑料、纸或卡片。

在优选的实施方案中，根据本公开的营养全面的湿食品具有大于50％的水分含量，例如大于50％至90％的水分含量。

因此，本公开包括湿宠物食品组合物，所述湿宠物食品组合物包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约60重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

本公开尤其涉及湿的狗食品组合物，所述湿的狗食品组合物包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约50重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

可以在所述湿宠物食品中包含的其他成分或物质以及它们在组合物中的各自的量已经在根据本公开的宠物食品的一般说明中进行了描述。

在一些实施方案中，所述湿宠物食品组合物包含抗氧化剂的源，所述抗氧化剂的源包括维生素C，并且其中维生素C以干物质为基础以约200ppm至约600ppm的量存在，和/或维生素E，其中维生素E以干物质为基础以约600ppm至约2000ppm的量存在，和/或类胡萝卜素，其中类胡萝卜素存在的以干物质为基础以约30ppm至约100ppm的量存在。

在一些实施方案中，所述湿食品组合物包含姜黄提取物作为姜黄素类化合物的源。

因此，在一些实施方案中，所述湿食品组合物包含姜黄素类化合物源。在这些实施方案的一些中，姜黄素类化合物以干物质为基础以约250ppm至约2000ppm的量存在。

在一些实施方案中，所述湿食品还可以包含鼠尾草酸和鼠尾草酚的源。在这些实施方案的一些中，鼠尾草酸和鼠尾草酚的量以干物质为基础为约20ppm至约90ppm。

在一些实施方案中，所述湿食品组合物包含胡椒碱的源。在这些实施方案的一些中，胡椒碱以干物质为基础以约14ppm至约60ppm的量存在。

在一个优选的实施方案中，湿食品由大块形式组成，更具体地由肉汁形式的大块组成。优选地，湿食品由大块和肉汁、大块的果冻、面包、慕斯、酱糜(terrine)、小食形式组成。

“大块和肉汁”产品包含预制的肉粒，所述肉粒通过制备肉糜并将该肉糜在压力下通过枪口然后进行烹饪而制成。将诸如熟肉之类的产品切成大块，最后与肉汁或调味汁混合。然后将这两种组分填充到通常是罐头或小袋的容器中，将其缝合或密封并消毒。与磨碎的面包相反，大块和肉汁组合物在制备时具有物理上分离的离散大块(即碎肉和谷粒)。这些离散的颗粒存在于最终容器中的肉汁型液体中。当食用时，大块和肉汁产品从罐中流出并且很容易与其他干产品混合。虽然大块和肉汁产品允许单个成分更好的完整性，但是大块和肉汁产品的异质配方有时会受到消费者的反对。

湿食品组合物通常包装在罐状容器中，并且由于其中所含的水分而被认为在外观上是“湿的”。两种类型的湿组合物在本领域中是通常已知的。第一种在本领域中称为“碾磨糕(ground loaf)”。糕产品通常通过在加热下使接触组分的混合物以产生实质上均匀的细胞内蜂窝型块或“碾磨糕”来制备。然后将碾磨糕块包装到圆柱形容器(如罐头)中。在包装时，碾磨糕呈容器的形状，因而在伴侣动物食用时必须将碾磨糕切开。

在另一方面，本公开提供了用于制备半固体湿润动物食品组合物的方法描述实施例。该方法可以包括在存在或不存在水性组分的情况下切割、切碎或研磨组合物的固体组分。这种固体组分可以是冷冻肉块。所述组分可以进一步与补充组分例如营养补充剂混合。通常，将混合物加热至20至70℃的温度。在一种布置中，将混合物加热至约45℃的温度。混合容器可适合于通过蒸汽注入或热交换器或食品制备领域中常规的任何设备进行加热。

根据本公开的方法也可以分批制备。

在该方法结束时，该组合物可用于填充诸如罐的容器。将容器密封并使用常规设备对内容物进行消毒。商业灭菌通常通过根据所用温度和组合物加热到至少118℃的温度适当的时间来完成。优选将干的营养全面的食品组合物进行包装。通过这种方式，消费者能够从包装中识别出食品中的成分并确认其适合所考虑的特定宠物。包装件可以是金属、塑料、纸或卡片。

如本文所用，“半湿”宠物食品组合物具有大于15％至50％的水分含量。

因此，本公开包括半湿宠物食品组合物，所述半湿宠物食品组合物包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约60重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

本公开尤其涉及一种半湿狗食品组合物，所述半湿狗食品组合物包含约10重量％至约20重量％的脂肪，约5重量％至约15重量％的纤维和约30重量％至约50重量％的蛋白质，重量百分比基于组合物干物质的总重量。

可以在所述湿宠物食品中包含的其他成分或物质以及它们在组合物中的各自的量已经在根据本公开的宠物食品的一般说明中进行了描述。

按照惯例，半湿宠物食品是允许获得介于干宠物食品和湿宠物食品之间的水分含量值的方法的最终产品。在一些实施方案中，所述方法可包括添加保湿剂的步骤。在一些实施方案中，所述方法包含挤出步骤和随后的过热蒸汽(SHS)处理步骤。

作为非限制性实施例，使用过热蒸汽(SHS)方法，例如公开的专利申请WO2009/018990、WO2009/018996、WO2010/112097、WO2014/122072、WO2016/071372和/或WO2016/071367中描述的工艺或方法可以获得半湿食品。

在一个优选的实施方案中，半湿食品由软的半湿粗磨物组成。

该食品组合物优选地进行包装。通过这种方式，消费者能够从包装中识别出食品中的成分并确认其适合所考虑的特定宠物。包装件可以是金属、塑料、纸或卡片。

宠物食品形式的组合物可以包括宠物在它的饮食中食用的任何产品。因此，本公开涵盖标准食品以及宠物食品小吃(例如小吃棒、饼干和甜品)。该食品优选是烹饪的产品。它可以加入肉或动物衍生的材料(例如牛肉、鸡肉、火鸡、羊肉、鱼肉、血浆、髓骨等或其中一种或多种)。该产品替代地可以是不含肉的(优选包括肉类替代品，例如大豆、玉米麸质或大豆产品)以提供蛋白质源。该产品可以包含附加的蛋白质源，例如大豆浓缩蛋白、牛奶蛋白、麸质等。该产品还可以含有淀粉源，例如一种或多种谷物(例如小麦、玉米、大米、燕麦、大麦等)，或者可以不含淀粉。产品可以包括纤维例如菊苣、糖用甜菜浆等，和/或组分例如菊粉、低聚果糖、益生菌，最优选地，根据本公开的宠物食品的组合成分提供所有推荐的维生素和矿物质给所考虑的特定动物(全面且平衡的食品)，例如，如国家科学委员会，1985，狗的营养要求，国家学术出版社，华盛顿特区或美国饲料管理协会，官方出版物1996(NationalResearch Council,1985,Nutritional Requirements for dogs,National AcademyPress,Washington DC or Association of America Feed Control Officials,OfficialPublication,1996)所述。

本公开全文中描述的食品组合物特别用于支持患有癌症并正在接受化疗的狗。

通过表述“支持”，通常被理解为与治疗有关的问题的管理，将副作用降到最低，保持良好的营养状态并帮助对抗癌症，确保自愿摄入营养素的充足。保持瘦体质量，保持健康体重，最佳BCS并预防营养不良。

在一个优选的实施方案中，所述癌症由淋巴瘤或肥大细胞瘤(MCT)组成。

本公开的另一个具体方面由一种用于支持患有癌症的狗的方法组成，所述方法包括将根据本公开的食品组合物施用给患有癌症的动物的步骤。

本公开还涉及用于支持患有癌症的狗的方法，所述方法将根据本公开的食品组合物施用给患有癌症并且接受化学治疗的动物的步骤。

在一些实施方案中，本公开涉及组合的抗癌治疗，所述抗癌治疗包含施用如本文所述的化学治疗剂和食品组合物。

更具体地，本公开关系到一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的狗施用治疗有效量的化学治疗剂和根据本公开的宠物食品组合物。在一些实施方案中，宠物食品是狗食品。在一些实施方案中，狗食品是干的狗食品。

本公开还涉及一种用于治疗狗的癌症的方法，优选淋巴瘤或肥大细胞瘤，所述方法包括向动物施用治疗有效量的化学治疗剂与根据本公开的宠物食品组合物的组合的方法。在一些实施方案中，宠物食品是狗食品。在一些实施方案中，狗食品是干的狗食品。

本公开还涉及包含化学治疗剂和根据本公开的宠物食品组合物的药物组合物。在一些实施方案中，宠物食品是狗食品。在一些实施方案中，狗食品是干的狗食品。

根据本公开，“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学剂(例如化合物或药物)，而与作用机理无关。化学治疗剂包括用于靶向治疗和常规化疗的化合物。根据本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何此类化合物或药物。

根据本公开合适的优选化学治疗剂是放线菌素、博来霉素、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿霉素、L-天冬酰胺酶、洛莫司丁、美法仑(Melphalen)、甲氨蝶呤、米托蒽醌、吡罗昔康、泼尼松、长春碱、长春新碱。

通过表述“治疗有效量”，必须理解为足以减少和/或改善癌症和/或与之相关的症状的严重性和/或持续时间的化学治疗剂的量。

术语“组合疗法”或“组合”意指施用治疗剂和干食品组合物以治疗本公开中描述的治疗状况或病症。这种施用包括以基本上同时的方式或以顺序的方式共同施用这些组分。

通过但不以任何方式限于以下实施例来进一步说明本公开。

实施例1：新型饮食对接受化疗的狗的生活质量的影响

癌症是狗的最常见死亡原因之一，宠物主人越来越多地选择用化疗治疗他们的宠物以尽可能长地延长其良好的生活质量(quality of life，QOL)。这项双盲多中心随机临床试验的目的是研究一种新型高蛋白、低碳水化合物、适量脂肪(相对于典型的干食物)、包含增加的纤维含量且补充了欧米加-3脂肪酸(omega-3fat acid)浓度的饮食，对于处于8周的喂食期内正在经受化疗以治疗肥大细胞瘤(mast cell tumor，MCT)和多中心淋巴瘤(LSA)的狗的生活质量(QOL)和胃肠健康的效果。

A.材料与方法

将45例新诊断为多中心LSA或高度、转移性或不可切除的MCT的未接受过化疗的客户所有的(client-owned)狗根据肿瘤类型在标准化学治疗方案基础上(对于LSA采用CHOP方案；对于MCT采用长春新碱和/或酪氨酸激酶抑制剂或CCNU)随机分配以接受8周的对照饮食或试验饮食(test diet)。对照饮食含有25％的蛋白质、13％的脂肪、8.5％的水分、1.5％的粗纤维。试验饮食含有37％的蛋白质、13％的脂肪、8.5％的水分、3.5％的粗纤维、0.6％的EPA-DHA(二十碳五烯酸-二十二碳六烯酸)、抗氧化剂补充剂以及与对照饮食不同的纤维混合物；两种饮食的配方均符合美国饲料管理协会(AAFCO)对于维持成年犬的营养素概况(nutrient profile)，并且具有相同的能量含量。

酿酒米(brewers rice)、鸡肉副产品粉、去壳燕麦粒、鸡脂肪、天然香料、菊苣(chicory)、小麦麸质、豌豆纤维、碳酸钙、氯化钾、盐、氯化胆碱、维生素[DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E的源)、生物素、D-泛酸钙、维生素A醋酸酯、烟酸补充剂、盐酸吡哆辛(维生素B6)、硝酸硫胺(维生素B1)、维生素B12补充剂、核黄素补充剂、叶酸、维生素D3补充剂]、微量元素[蛋白锌(zinc proteinate)、氧化锌、硫酸亚铁、蛋白锰(manganese proteinate)、氧化锰、硫酸铜、碘酸钙、亚硒酸钠、蛋白铜(copper proteinate)]、迷迭香提取物与生育酚和柠檬酸混合保存。

鸡肉副产品粉、去壳燕麦粒(oat groat)、酿酒米、小麦麸质、天然香料、豌豆纤维、鱼油、鸡脂肪、菊苣、L-精氨酸、碳酸钙、氯化钾、硅铝酸钠、车前草籽壳、低聚果糖、盐、水解酵母、牛磺酸、N-丁酸、左旋肉碱、氯化胆碱、维生素[DL-α-生育酚乙酸酯(维生素E的源)、L-抗坏血酸-2-聚磷酸盐(维生素C的源)、生物素、D-泛酸钙、维生素A醋酸酯、烟酸补充剂、盐酸吡哆辛(维生素B6)、硝酸硫胺(thiamine mononitrate)(维生素B1)、维生素B12补充剂、核黄素补充剂、叶酸、维生素D3补充剂]、微量元素[蛋白锌、氧化锌、硫酸亚铁、蛋白锰、氧化锰、硫酸铜、碘酸钙、亚硒酸钠、蛋白铜]、万寿菊提取物(Tagetes erecta L)、迷迭香提取物与生育酚和柠檬酸混合保存。

狗主人评价生活质量(QOL)，包括12个问题，每个问题的答案分为5个等级，在基准线，然后每2周直到8周，使用先前发布的针对患癌症犬设计的问卷(Iliopoulou MA，Kitchell BE，Yuzbasiyan-Gurkan V.接受化疗治疗的小动物癌症患者健康相关生活质量调查工具的开发(Development of a survey instrument to assess health-relatedquality of life in small animal cancer patients treated with chemotherapy)，美国兽医医学协会杂志(J Am Vet Med Assoc)，2013年6月15日；242(12)：1679-87)，以及每周平均粪便分数，直到8周，使用9分表示的粪便评分图表(半分从1：非常稀便到5：非常硬便，最佳分数为4)。

体重，BCS(身体状况分数从1到9的5分制，有2分的间隔，得分5为最佳)和MCS(肌肉状况分数：正常肌肉质量、轻度、中度或重度肌肉损失)由兽医研究人员在基线进行评估，然后每2周直至8周进行评估，CBC(全血细胞计数)和标准生物化学是按照相同的时间表进行的。

B.结果

临床试验的结果列于下表4。

维持/对照组的14只狗(10只LSA，4只MCT)和试验组的22只狗(16只LSA，6只MCT)完成了8周的研究(p＝0.61)。

B.1.饮食接受很好：在45只狗中，只有4只(对照组为3/21，试验组为1/24，p＝0.325)从研究中去除，因为它们不吃所述饮食。

虽然每组退出的狗的数量(对照组中7/21-33％，试验组中2/24-8％)没有差异(p＝0.061)，与试验组相比，对照组中离开研究的狗数量有增加的趋势。

在研究中，狗具有稳定的CBC和生物化学值。

结果显示在下文表19中。

*这些变量的参考范围在研究地点之间有所不同，因为这些变量是在内部测量的。请参见附录中每个实验室针对这些变量的各个范围。

**所有值在此处都归为一组，与测量方法无关

B.2.在整个研究过程中，两组的体重和身体状况分数均稳定且在健康参考范围内。

结果示于表6和表7。

B.3.粪便分数

如图1所示，在整个研究中，两组的粪便分数均稳定且在健康参考范围内。

B.4.生活质量(QOL)参数

从基准线到8周，对于接受试验饮食的狗10/12QOL参数有明显改善，而食用对照饮食的狗只有1/12改善。

QOL参数显示试验组和p值有显著改善

ο狗被癌症困扰了多少(p＝0.003)，

ο狗多久享受一次喜欢的活动(p＝0.021)，

ο狗的睡眠模式的变化(p＝0.009)，

ο狗的嬉戏(p＝0.030)，

ο狗有多频繁地出现疾病病症(p＝0.003)

ο狗有多喜欢与人互动(p＝0.035)

ο狗多久感到一次快乐(p＝0.026)

ο狗多久经历一次焦虑或恐惧(p＝0.018)

ο狗多久经历一次行动不便(p＝0.011)

ο狗的总体QOL(p＝0.010)

与对照饮食的狗相比，接受试验饮食的狗的疾病病症也有显著改善(p<0.009)。

癌症诊断、化疗第2、4、6和8周时每个饮食组的总体QOL得分如图2所示，它公开了得到治疗的狗的生活质量得分。

总体而言，实施例1的结果表明试验饮食得到了良好接纳，并且接受试验饮食的狗在化疗和饮食消耗8周后表现出改善的生活质量。

A.材料与方法

A.1.天然提取物直接从制造商处接收，并且基于制造商纯度分析的每种感兴趣化合物的含量均由二级实验室进行了验证。在每次实验前，将提取物以20mg/mL溶于100％DMSO中以获得储备液(Stock solution)。

a纯度值代表制造商确定的每种提取物中主要感兴趣化合物的百分比(对于一个特定批次)

A.2.使用的化学治疗剂是托西尼布磷酸盐(toceranib phosphate)(帕拉丁(Palladia)

A.3.多种犬肿瘤的原代细胞系用于代表不同的肿瘤类型。使细胞系在含有10％热灭活的胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂的适当培养基的组织培养物处理的平板上生长。在所有实验和细胞传代中，它们均在37℃和5％CO

通过ATP-Lite测试(CMT-12除外)将所有犬细胞系用于初始筛选。仅C2、CMT-12和D17细胞用于MTT研究

此外，犬原代真皮成纤维细胞(CDF)用于研究对正常细胞的作用，并在包含10HI-FBS和1％青霉素/链霉素的Prigrow II培养基中繁殖和维持。

A.4.多种体外测试以分析细胞增殖

A.4.1.ATPlite

将不同的癌细胞系以平底微量滴定96孔板中90μL适当培养基/孔中每孔的最佳细胞数铺板。在无药物培养基中处理之前，将板在37℃下孵育24小时。第一次稀释过程后，在平板接种后24h将10μl的试验物质(单种)添加到含有细胞的平板上。肿瘤细胞系在37℃、5％CO

将5种植物提取物(绿茶叶、石榴POE40、迷迭香叶INOLENS70、姜黄根和黑胡椒提取物(vetperine))以适当的浓度溶于DMSO。将2种选择的癌细胞系(HMPOS和C2)以每孔最佳细胞数铺板在平底微量滴定96孔板的80μL适当培养基/孔中。在无药物培养基中处理之前，将板在37℃下孵育24小时。在第一次稀释过程之后，将10μl的每种试验物质添加到含有细胞的平板上。将肿瘤细胞系在37℃、5％CO

在处理结束时，通过三磷酸腺苷发光测试(ATP-Lite assay)(Ref.6016949，Perkin-Elmer和Batch 69-12172)评估了被测物质的细胞毒活性。该测试测量细胞内ATP的水平，ATP是代谢活性的标志。该ATP水平通过萤火虫荧光素酶通过ATP依赖性反应而发出的光来定量。在细胞处理结束时，将50μl哺乳动物细胞裂解液添加到每孔100μl细胞悬液中。将板在定轨振荡器上以700rpm振荡5分钟。该溶液裂解细胞并稳定ATP。然后，将50μl底物溶液添加至孔中，并将板在定轨振荡器中以700rpm振荡5分钟。之后，将板在黑暗中放置十分钟，并测量发光度为LV(发光值)。

Chou-Tallalay CI对应于使用适当算法计算的组合指数。6种不同剂量的每种提取物的组合(1.6μg/ml、3.1μg/ml、6.3μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml迷迭香，0.8μg/ml、1.6μg/ml、3.1μg/ml、6.2μg/ml或12.5μg/ml胡椒或姜黄提取物)。CI值≤0.9表示协同作用，CI值>0.9和<1.1表示相加作用，CI值≥1.1表示拮抗作用。

A.4.2.MTT增殖测试

细胞以4x10

使用两种提取物的组合以六种浓度(0.8μg mL

来自增殖测试的原始数据(每个孔的光密度)被归一化为单一检测的单独赋形剂处理，被认为代表了100％增殖细胞(单个或联合处理)。然后在每个重复(replicate)中将％增殖细胞平均。然后在整个实验中通过概率元分析(Probitassay)计算每种提取物的IC50。使用CalcuSyn软件(v.2.11；Biosoft，剑桥，大不列颠，英国)通过多重药物效果分析计算化合物的相互作用。

A.4.3.细胞活力的台盼蓝拒染测试

由于这些正常犬细胞的增殖速度缓慢且代谢活性低，无法进行有效的MTT试验，因此对CDF进行了台盼蓝拒染测试。将提取物处理的效果与在C2、CMT-12和D17细胞系上获得的结果进行了比较。对于所有细胞系，将细胞以5x10

A.5.集落形成的软琼脂生长测试

该测试是细胞转化的标志之一，被认为是检测细胞恶性转化最准确且最严格的体外测试。这种克隆形成测试通过人工计数集落来测量约3周后在半固体培养基中的增殖。D17细胞在100mm细胞培养皿中生长。设置6孔培养皿，其中包含0.6％的VII型琼脂，最初以3％的浓度在无菌磷酸盐缓冲盐水中溶解，然后在完全RPMI培养基中重构为0.6％。在6孔培养皿中将0.5ml软琼脂作为基础层铺设后，然后将每个细胞系以10,000个细胞每ml悬浮在38℃的完全RPMI中的0.6％软琼脂中，并且在6孔培养皿中铺板之前，立即对相应的悬浮液进行处理。根据先前实验中使用的MTT测试剂量选择提取物给药量。通常，软琼脂中细胞的反应剂量要比MTT测试中常见的低。因此，选择MTT低端的剂量(0.4-0.8ug/ml)。

在同一天将0.5ml细胞和处理液(treatments)一式三份铺板，并允许在室温下在细胞培养罩(cell culture hood)中固化30-60分钟，然后放置在37℃的培养箱中。用完全RPMI中的适当处理液(treatments)补充细胞，每3天补充0.6％。盲观察者在显微镜下生长16天时计数集落数。所有数据均基于100％DMSO对照以集落百分比表示。

A.6.凋亡相关的半胱天冬酶3/7激活测试

细胞以4x10

A.7.流式细胞术

将细胞铺板在60mm组织培养处理的平板(LPS)上，并在完全培养基中孵育直到60％汇合。然后用培养基、DMSO赋形剂对照、单独提取物或组合提取物处理细胞。将细胞处理12小时(产生ROS)，24小时(姜黄素蓄积)或48小时(凋亡/坏死)。所有流式细胞分析均在碧迪公司(BD)流式细胞仪FACSCalibur上进行。对于所有流式细胞术实验，每个样品收集10,000个事件，然后根据前向散射/侧向散射图进行门控。将来自每种处理的几何平均荧光(geometric mean fluorescence，GMF)与DMSO处理的样品进行比较，并表示为所有使用GMF进行的实验的差异倍数，这是由于细胞系之间荧光强度的差异所致。

A.8.凋亡和坏死测试

使用膜联蛋白-V和7-AAD染色处理48小时后，测量细胞凋亡和坏死。简而言之，将细胞用阿麦斯解离溶液(Accumax dissociation solution)(创新细胞技术(InnovativeCell Technologies))脱附，收集并在4℃下以500rcf离心10分钟。用PBS洗涤细胞团块(cell pellet)一次，然后以1x10

A.9.细胞内活性氧(Intracellular Reactive Oxygen Species，ROS)分析

由于姜黄提取物和迷迭香提取物(分别为姜黄素和鼠尾草酸)的主要成分已被认为是抗氧化剂，因此使用二氢若丹明123(Dihydrorhodamine123，DHR123；英杰(Invitrogen))测试确定每种提取物处理12h后存在的ROS量。简而言之，将细胞用阿麦斯解离溶液(Accumax dissociation solution)脱附，收集并在4℃以500rcf离心10分钟。将团块(pellet)用PBS洗涤一次，然后重悬于1mL染色剂(DMEM中的30μM DHR123)中。然后将细胞悬浮液在37℃下孵育30m，沉淀，重悬于1mL杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco'smodified Eagle medium，DMEM)中并过滤，然后进行细胞荧光分析。

A.10.姜黄素的细胞积累

姜黄素的细胞中的积累是通过利用该化合物的自发荧光特性来测量的。处理24小时后，将细胞用阿麦斯解离溶液(Accumax dissociation solution)脱附，收集并在4℃下以500rcf离心10分钟。将细胞团块(cell pellet)用PBS洗涤一次，然后重悬于DMEM中，并在以488nm波长激发时进行荧光分析之前进行过滤，然后使用530/30滤光片测量发射。

A.11.蛋白质印迹(信号通路)

将细胞接种在100mm组织培养处理的平板(LPS)上，并在完全培养基中孵育过夜，直到达到60％汇合。第二天，细胞用DMSO赋形剂对照、单独的6.3μg/mL提取物或每种结合的3.1μg/mL提取物处理。在处理后12h和24h收获细胞并使用哺乳动物裂解缓冲液(MLB；25mMTris，100mM NaCL，1mM EDTA，1％曲拉通X-100，0.004％NaF，1mM NaVO4，25mM甘油磷酸，100g/ml苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride)，以及抑肽酶和亮肽素各1μg/ml，pH 7.4)裂解和超声处理细胞，然后在4℃下以14,000rcf离心5分钟。收集上清液，并使用Bradford分析法(考马斯染料(Coomassie-dye))测定蛋白质浓度。在MLB和5x laemmili加样缓冲液中将样品平衡至普通体积(μg/μ)。对于每种感兴趣蛋白，将30μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。然后将蛋白质在333mA电流下转移到0.45μm孔径的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane)上1小时，并且然后在TBST溶液的5％牛奶中封闭。将膜在第一抗体溶液中于TBST中以1：1000的稀释度在摇动平台(rocking platform)上于4℃孵育过夜。第一抗体包括兔应激激活蛋白激酶(rabbitstress-activated protein kinase)/jun-氨基末端激酶(jun-amino-terminal kinase)(SAPK/JNK)和Thr183/Tyr185磷酸化SAPK/JNK(细胞信号技术(Cell SignalingTechnology))。将膜用TBST洗涤3次，并在室温下在抗兔IgG辣根过氧化物酶偶联的抗体中以1：2000的稀释度孵育1小时(细胞信号技术(Cell Signaling Technology))。用TBST将膜洗涤3次，并用化学发光试剂(伯乐(Bio-Rad))显影。使用成像系统(Biospectrum 410)捕获数字图像。收集图像后，将膜在TBST中洗涤3次，并在室温下以1：10,000的持家抗体β-肌动蛋白(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))的TBST稀释液孵育1小时。洗涤膜，与小鼠第二抗体以1：2000的稀释度孵育。

B.结果

B.1.单一提取物处理对犬癌细胞系的抗增殖活性

多种植物提取物的抗增殖活性结果如图1A至图1F所示，分别来自40％石榴(图3A)、绿茶(图3B)、黑胡椒(vetperine)(图3C)、迷迭香叶(图3D)、姜黄根(图3E)石榴40％石榴苷(图3F)的提取物。

阿霉素(阳性参考)：所有细胞系均对阿霉素敏感，IC50值范围从HMPOS的11nM到CF41.Mg细胞系的375±361nM。值得注意的是，CLBL-1和BACA细胞系是非常难以培养的细胞系，必须谨慎考虑有关从不同植物提取物中获得的这些细胞系的结果。

还已经根据MTT试验分析了抗增殖活性。结果示于下表10中。

通过对4个独立实验的重复孔进行平均并使用Probit分析来确定数值。C2用托西尼布磷酸盐处理，CMT12和D17用盐酸阿霉素处理。

B.2.双重提取物联合处理对犬癌细胞系的抗增殖活性

在最佳指示浓度范围内，观察到以下化合物具有最佳协同作用：

-迷迭香(0.8至6.3μg/ml)+石榴(1.2至33μg/ml)

-迷迭香(0.8至3.1μg/ml)+姜黄根(0.8至3.1μg/ml)

-石榴(3.7至11μg/ml)+姜黄根(1.6至6.2μg/ml)

对于每种组合试验，将化合物的协同作用评估为协同组合指数的数量(CI<0.9)超过经验证的浓度混合物的数量。当其组合Fa在0.05至0.95范围内时，在Chou-Tallalay计算中验证了浓度混合的条件。当至少50％的经验证的浓度混合条件显示CI<0.9时，2个提取物的组合被认为是协同的。对于所有两种细胞系，用加性模型方法计算的协同效应中有70％与使用Chou-Tallalay模型计算的协同效应相同。这种结果的相似性表明，大多数协同组合已通过两种独立的计算方法进行了验证。

结果示于下表11中。

B.3.通过MTT测试测定的三种类型的癌细胞系(C2、CMT-12和D17)的协同作用

姜黄提取物和迷迭香提取物的组合导致在所有3种细胞系中达到IC50所需的每种提取物的浓度显著降低，表明具有协同作用。结果显示在下面的表12、表13和表14中。

在图4A中还描绘了对C2癌细胞系的抗增殖活性。

在图4B中还描绘了对CMT-12癌细胞系的抗增殖活性。

在图4C中还描绘了对D17癌细胞系的抗增殖活性。

当将迷迭香INOLENS70提取物和姜黄根提取物以0.8-25μg/mL的剂量范围组合使用时，通过MTT测试测定(A)C2、(B)CMT-12和(C)D17细胞系的CI值。低于0.8的值表示协同作用，0.8-1.2表示相加作用，大于1.2的值表示拮抗作用。NP＝无法执行计算。

与DMSO对照相比，可引起％增殖显著降低的最低剂量由+(仅TE)、#(仅RE)和^(双提取物组合)表示。

B.4.不同来源提取物的抗增殖活性

我们还使用2种不同来源的姜黄提取物(Naturex或Arjuna)或迷迭香提取物

B.5.通过软琼脂集落形成测试检测的姜黄提取物的抗增殖活性

姜黄提取物(姜黄素类化合物)对软琼脂的影响最大，具有很少的集落形成为对照的27％。迷迭香和胡椒提取物显示出轻微的作用，分别只有75％和65％的集落形成。姜黄素和迷迭香的双重处理在0.4μg/ml姜黄素和0.8μg/ml迷迭香中仅显示21％的形成。添加6.25μg/ml的胡椒提取物在鸡尾酒混合物(cocktail mixture)中显示适度降低至12％。

结果描绘在图6中。

一式三份，在计数之前每3天处理细胞一次，共16天。报告了根据DMSO赋形剂对照的％平均菌落形成。与DMSO对照相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

B.6.天然提取物与化疗相互作用对癌细胞系生长的抑制作用

我们旨在检查提取物与常用化疗药物之间的相互作用，包括用于肥大细胞瘤疾病(C2细胞系)的帕拉丁(palladia)/托西尼布(酪氨酸激酶抑制剂)和用于乳腺癌和骨肉瘤的阿霉素(蒽环类抗生素)。

姜黄和迷迭香提取物(0.8至1.7μg/ml)均引起对相加作用的轻微拮抗，而在3.1μg/ml的两种提取物中，存在托西尼布磷酸盐(肥大细胞瘤细胞系)时具有确定的加性作用。当以6.3μg/ml的比例添加任一种提取物时，都具有确定的协同作用。

结果列于下表16至表24。

B.7.提取物对癌细胞系的细胞毒活性而不影响正常细胞

6.3μg mL

结果如图7所示。

通过台盼蓝拒染测试测定的％活细胞与DMSO赋形剂处理相比表示为平均值+/-SEM。在每个细胞系内，不共享同一字母的平均值存在显著差异(p<0.05)。NS＝不显著。

B.8.TE和RE单独或联合发挥抗增殖和细胞毒性作用的机制

姜黄和迷迭香提取物处理诱导细胞凋亡

TE+RE联合处理导致了所有细胞系中半胱天冬酶3/7的激活和凋亡，而不仅仅是TE单独的作用。

结果描述在图8A至图8E中。

图8公开了用(图8A)DMSO、(图8B)6.3μg mL

还通过量化每个活细胞中半胱天冬酶3/7水平的变化来评估细胞凋亡作用。

结果描述在图9中。

在图7中，每个活细胞激活的半胱天冬酶3/7表示为相对于DMSO对照值的平均倍差异倍数±与3次独立重复的标准差。在每个细胞系中，具有不同字母的值彼此之间显著不同(C2 p<0.001；CMT-12p<0.005；D17 p<0.05)

B.9.TE和RE在癌细胞系中的抗氧化活性

两种提取物均具有抗氧化作用，其中RE将活性氧(reactive oxygen species，ROS)降低40-50％，而TE将ROS降低80-90％。

结果描述在图10中。

在图8中，值表示为平均值±四次独立重复的标准偏差。报告的值表示为与DMSO赋形剂对照相比的差异倍数。在每个细胞系中，具有不同字母的均值彼此显著不同(C2 p<0.05；CMT-12和D17 p<0.0001)

B.10.TE和RE促进SAPK/JNK细胞途径活化

RE处理增强了C2细胞系中的c-jun N末端激酶(JNK)活性，并且TE+RE暴露使活化的JNK在CMT-12细胞系中提高了4-5倍。

结果显示在图11A(C2细胞系)和图11B(CMT-12细胞系)中。

在图11A和图11B中，每个印迹是三个独立实验的代表。光密度值代表磷酸化蛋白与总蛋白的比例，并归一化为同一时间点的DMSO赋形剂对照(3个独立实验的平均值)。与DMSO对照相比，光密度的变化具有p＜0.05的显著性，用*表示。将β-肌动蛋白用作每次印迹的加样对照，以确保样品的均匀加样。

B.10.RE处理引起姜黄素的细胞积累增加

TE显示，RE处理导致姜黄素在C2和D17细胞系中的细胞积累显著增加约30％，在CMT-12细胞系中显著增加4.8倍。当组合使用TE和RE时，这种增加的姜黄素细胞内水平能发挥协同作用。

结果描述在图12A、图12B和图12C中。

将C2(图12A)、CMT-12(图12B)和D17(图12C)细胞系用指定浓度的提取物处理24小时，然后通过流式细胞术对姜黄素的细胞积累进行定量。Y轴值代表与DMSO对照相比，所有细胞的几何平均荧光(geometric mean fluorescence，GMF)的差异倍数。报告的数据表示为平均值±4次独立重复的标准偏差。在每个细胞系内，具有不同字母的平均值彼此显著不同(p<0.0001)。

这项前瞻性多中心临床试验的目的是确定特别配制的实验饮食是否能提高化疗效果，降低它的副作用并维持正在进行化疗方案的狗的生活质量(QoL)。在癌症诊断后的1年内，将评估这种新饮食的临床疗效。主要目标是通过“支持治疗”来保持良好的营养状况，帮助狗抵抗癌症。该研究被设计为双盲随机安慰剂对照试验。主要结果是总体健康状况(global health status)/QoL分数，肠胃道(GI)不良事件和体重维持。次要疗效参数是其他QoL分数(功能和症状量表)、粪便分数(与GI-AE相关的参数)、中位生存期、1年生存率、治疗反应率、血液学不良事件(H-AE)、由主人评估的饮食。

研究规划：

·比较：将比较2种定制配方的，在化疗方案中和化疗方案后患有癌症的狗的营养完全和均衡的干粮。

·随机：将动物按研究地点分层，然后将其随机分配至对照组或试验组(使用预定的随机计划)。

ο癌症诊断后(治疗期间和之后)喂养1年的2组狗(客户拥有)：

■A组(n＝30)＝试验饮食

成分：脱水的家禽蛋白、去壳燕麦、大米、小麦麸质、植物纤维、水解的家禽蛋白、家禽脂肪、鱼油、菊苣浆、脂肪酸盐、车前草壳籽和种子、万寿菊提取物、天然提取物的排他混合物(exclusive cocktail)、矿物质、维生素、抗氧化剂和防腐剂。保证分析：水分(最大)9.5％；蛋白质(最低)36.5％，粗脂肪(最低)：13％；粗纤维(最大)4.8％，灰分(平均)7.2％。

■B组(n＝30)＝对照饮食

成分：去壳燕麦、大米、脱水的家禽蛋白、家禽脂肪、小麦麸质、植物纤维、水解的家禽蛋白、甜菜浆矿物质、维生素、抗氧化剂和防腐剂。保证分析：水分(最大)9.5％；蛋白质(最低)25％，粗脂肪(最低)：13％；粗纤维(最大)4.8％，灰分(平均)6.8％。

研究群体

纳入标准

■≥1岁龄；体重≥3kg

■新诊断的狗淋巴结弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL，中心母细胞型或免疫母细胞型)在第III、IV或V(如果仅限于骨髓或外周血参与)

■所有动物都应未治疗当前的癌症(naive to treatment for the currentcancer)，但可以在过去治疗其他癌症，如果超过一年之前。

■业主愿意接受标准的多药化疗：25周内包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙的CHOP方案。

治疗方案在下面的表25中公开。

■宠物主人愿意停止使用所有草药和维生素补充剂。如果狗正在接受任何膳食补充剂，则可以在注册时将其停下来，并且仍然有资格进行研究。

■宠物主人愿意喂食规定的饮食，将零食限制在卡路里的5％以内(提供具体治疗建议)，并保持每月QOL并记录粪便分数，详细的饮食日记(每周摄入的饮食量)。

排除标准

■纳入访视时因淋巴瘤引起的神经系统疾病的狗

■狗患有骨髓以外的淋巴瘤，血液浸润(如肺，SNC……)

■当前诊断出的合并症预期可能对QoL产生不利影响，改变生存时间(估计<3个月)或需要特定的治疗饮食，例如内分泌疾病、ISACHC 2-3期的心脏病、IRIS 2-4慢性肾脏病……

■研究注册1周内当前抗生素使用。如果在纳入前进行了1周的冲洗(wash-out)，则可以将动物包括在内。

■胃肠道病症史(癌症之前)–慢性呕吐或腹泻(超过6次/年或一个月的临床症状)和需要特殊饮食控制的动物(与癌症无关)

■研究注册1周内目前的止吐药和止泻药的预防性使用

■在研究注册的1个月内使用欧米加-3脂肪酸补充剂(omega-3fatty acidsupplimentation)(例如鱼油、磷虾油、亚麻、琉璃苣、月见草)。

■在上个月内给予皮质类固醇(口服途径)治疗癌症超过1周或在上个月内给予长效皮质类固醇(无论注射次数如何)

参与者退出/中止的标准

如果满足以下条件之一，则将动物从研究中移除：

■治疗反应评估后(方案第6周)，部分反应(PR)、稳定疾病(SD)或进行性疾病(PD)的动物，需要修改化疗方案。

■从第6周(诱导期)开始，通过细胞学检查(LN FNA)确认复发。

■研究饮食不耐受性–实验饮食引入的前两周内与饮食相关的GI病症没有药物治疗在5天内不会消失。

■饮食合规性较差，例如：超过5天的时间间隔，未喂饲实验性饮食(由于生病、客户用完、管饲等)。过度使用零食。

■使用附加的膳食补充剂(基本氨基葡萄糖/软骨素补充剂除外)。

研究时间表

-V1＝基准线/包含，在开始化疗和饮食之前已经进行了诊断

-V2＝大约1个月的饮食后(＝诱导期结束，在第6周，因此在最后一次阿霉素注射后2周但在长春新碱注射之前)

-V3＝大约3个月的饮食后(＝中点维持期，在长春新碱注射前第15周)

-V4＝饮食6个月后(＝化疗方案完成后，在最后一次注射后的2周内，即在第26或27周)

-V5＝饮食9个月后(在第39至41周之间)

-V6＝一年饮食后(在第51至53周之间)

治疗方案在下表26中进一步描述。

参数

■诊断和临床分期(V1)：

-全面体检

-血涂片CBC+血清生化特征(BUN-CREA-ALT-ALKP-TP-ALB-Ca)+尿液分析(当天在内部进行)

-通过流式细胞术对一或两个受影响的淋巴结的细针抽吸物(FNA)进行细胞学检查和免疫表型分析(或通过免疫组织化学活检；由研究者酌情决定)

-胸片(2个角度：右侧和背腹)(或由研究人员酌情决定是否使用扫描仪)

-强制性脾/肝FNA腹部超声检查和细胞学检查

-骨髓抽吸和细胞学

■体重；身体状况分数(BCS 9分制)；肌肉状况分数(MCS WSAVA)

■记录药物治疗：化疗方案(由于AE而与适应规则相关的微小变化)和其他药物

■仅在以下情况下记录化疗后的不良事件(根据兽医合作肿瘤学研究组-常见不良反应事件评价标准(Veterinary cooperative oncology group-common terminologycriteria for adverse events，VCOG-CTCAE)等级V1.1从1级到5级和事件日期)：“胃肠道”类别和“血液/骨髓”类别

■诱导期(V2)的治疗反应评估：

o根据VCOG共识进行的完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)和进行性疾病(PD)：狗外周淋巴结淋巴瘤v1.0的反应评估标准(VCOG consensus:Response evaluationcriteria for peripheral nodal lymphoma in dogs v1.0)。

o仅执行诊断访视时异常的参数(仅在动物处于CR时)

■标准化生活质量问卷调查

■粪便分数(5分制)

■特定的血液生物标志物：

■饮食评估问卷

■记录

ο通过LN细胞学检查(FNA)确认长达12个月(初始诊断后)的复发状态监测。兽医应在完成化疗方案后检查动物(至少每月一次或如果有明显的进行性疾病)；由研究人员酌情决定(允许计算无进展间隔)

ο死亡(自然或安乐死；是否可能归因于癌症；未知来源)，可以计算中位生存时间。

ο其他主要事件如住院；手术；受伤……

治疗方案在下表27中描述。