一种草莓功能基因连锁SSR标记的开发方法

摘要

本发明公开了一种草莓功能基因连锁SSR标记的开发方法，包括如下步骤：(1)获取草莓基因组公共数据；(2)对数据进行质量控制处理，处理后的序列进行组装拼接并鉴定微卫星序列；(3)在微卫星序列的旁侧序列设计引物；(4)不同草莓品种的转录组测序、拼接和基因注释；(5)电子PCR锚定引物到具体基因。该方法的SSR标记具有多态性高、共显性、重复性好等优点。为草莓提供2468个SSR标记及其引物，且这些标记都和功能基因相关，这将为草莓育种和农业性状相关的基因挖掘提供有利的工具。

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记筛选方法，特别涉及一种草莓功能基因连锁SSR标记的开发方法。

背景技术

分子标记是以个体遗传物质的核苷酸序列变异为基础的遗传标记。分子标记技术现已广泛应用于遗传图谱构建，系统发生分析，群体遗传分析等方面。近年来，分子标记的方法在杂种鉴定上的应用也开始越来越普遍。相对于形态学鉴定，分子标记鉴定快速，准确，重现性好。随着分子技术的发展，分子标记鉴定的方法越来越多，已经发展起来的分子标记多达60多种，包括以传统的Southern杂交为基础的分子标记，如RFLP、SS-CP-RFLP、DGGE-RFLP等；以PCR为基础的标记，如RAPD、AFLP、SSR、ISSR、等；以基因组序列为基础的标记，如SNP、InDel、cSSR等。现如今，分子标记的发展趋势正在由对RAPD、RFLP、AFLP标记的研究应用逐步过渡到对SSR、ISSR、SNP标记的研究与应用。

随着分子生物学和遗传学的发展，DNA分子标记经历了三个阶段。第一代DNA分子标记主要有RFLP标记和RAPD标记。这两种标记方法主要用于基因连锁图谱的构建，但RFLP标记对DNA多态性检出的灵敏度不高，RAPD标记技术由于随机引物和低的退火温度导致其具有不稳定性。第二代DNA分子标记以SSR标记为代表。SSR标记具有以下三个优点：(1)整个基因组都存在具有差异的微卫星序列，可以设计的分子标记数量丰富，多态性高；(2)SSR分子标记是共显性标记，能把多个等位基因都标识出来，提供的信息量高且更加准确；(3)简单，快速，省时省力，不受环境影响，序列相对稳定，重复性好，不同的实验室可以相互交流合作开发引物。第三代DNA分子标记以SNP标记为代表。但是SNP标记对实验条件要求很高，并且成本大，不具普适性。

草莓属(Fragaria)约有20个种，由二倍体、四倍体、六倍体和八倍体种构成，其中仅一个八倍体用于栽培，即起源于美洲种弗州草莓和智利草莓自然杂交的凤梨草莓。草莓属植物在其演化过程中经历了一系列的多倍化和自然杂交过程。草莓(学名：Fragaria×ananassa Duch.)，为草莓属中最常见的栽培之杂交种。也常指其果实。草莓是多年生草本植物，是重要的园艺作物。草莓中国国内优良品种草莓栽培的品种很多，全世界共有20000多个，但大面积栽培的优良品种只有几十个。

随着国内外越来越多草莓属植物的SSR引物被陆续开发，这些SSR技术已经被用于草莓属植物的遗传图谱构建、品种鉴定、遗传多样性分析等。

目前针对草莓功能基因相关的SSR标记的开发还未见报道。而现在二代三代测序技术蓬勃发展，各种基因组、转录组和功能基因数据库日渐完善，这些都为草莓功能基因相关SSR的开发打下了良好的基础。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供具有多态性高、共显性、重复性好等优点的草莓功能基因连锁SSR标记的开发方法。

技术方案：本发明提供一种草莓功能基因连锁SSR标记的开发方法，包括如下步骤：

(1)获取草莓基因组公共数据；

(2)对数据进行质量控制处理，处理后的序列进行组装拼接并鉴定微卫星序列；

(3)在微卫星序列的旁侧序列设计引物；

(4)不同草莓品种的转录组测序、拼接和基因注释；

(5)电子PCR锚定引物到具体基因。

进一步地，所述步骤(2)的方法为：将SRA格式数据转换成Fastq格式文件，并采用并行清理通道将转换的文件清理，控制数据质量包括Q20清理及L40过滤，并去除5、3端的polyT、polyA序列以及载体序列，随后，对质量控制处理后的序列组装拼接，去除冗余的序列获得unigene，对unigene序列进行SSR位点识别。

进一步地，所述控制数据质量包括：Q20清理，Phred-Score≥20即1％的错误率；L40过滤：长度≥40bp。

进一步地，所述识别条件为单核苷酸重复不低于10次，二核苷酸重复不低于8次，三核苷酸重复不低于7次，四核苷酸重复不低于5次，五核苷酸及六核苷酸重复不低于4次；复合SSR的识别条件是2个SSR之间的距离不超过50bp。

进一步地，步骤(3)的方法为：对SSR位点的旁侧序列进行引物设计，设置参数Tm为58℃±3℃，引物长度为20±3bp，产物预期长度为100～450bp，其他参数为默认。

进一步地，步骤(4)的方法为：对不同草莓品种进行测序，并对原始测序数据进行质量和测序长度过滤；随后，对处理后的序列进行转录组从头de novo组装，获得草莓品种组织的转录组功能基因序列，并对基因功能进行注释。

进一步地，所述质量为：Q20，Phred-Score≥20即1％的错误率；测序长度为：L40，长度≥40bp。

进一步地，步骤(5)的方法为：通过电子PCR将上述引物对锚定到功能基因序列上，剔除不能铆定的引物对序列。

有益效果：本发明的SSR标记具有多态性高、共显性、重复性好等优点，并且SSR位点在属内种间，甚至科内属间具有保守性。本发明为草莓提供2468个SSR标记及其引物，且这些标记都和功能基因相关，这将为草莓育种和农业性状相关的基因挖掘提供有利的工具。

附图说明

图1为本发明方法流程图；

图2为Geno-MK10224对的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为Geno-MK10263对的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为Geno-MK104402对的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

如图1-4所示，结合已经公布的草莓基因组(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/？term＝PRJNA5083890)，利用Fastq-Dump程序将SRA格式数据转换成Fastq格式文件，并采用并行清理通道将转换的文件清理，控制数据质量，包括Q20(1％的碱基错误率)清理及L40(长度≥40bp)过滤，并去除5、3端的polyT、polyA序列以及载体序列。随后，利用Trinity软件按照默认参数对质量控制后的序列组装拼接，去除冗余的序列获得unigene。通过MISA软件(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对unigene序列进行SSR位点识别，其识别条件为单核苷酸重复不低于10次，二核苷酸重复不低于8次，三核苷酸重复不低于7次，四核苷酸重复不低于5次，五核苷酸及六核苷酸重复不低于4次，复合SSR的识别条件是2个SSR之间的距离不超过50bp。

利用Primer 3.0软件(http：//primer3.sourceforge.net/)对SSR位点的侧翼序列进行引物设计，设置参数Tm为58℃±3℃，引物长度为20±3 bp，产物预期长度为100～450bp，其他参数为默认。

之后以二代测序技术ILLUMINA对于是个市售常见的十个草莓品种进行测序。采用Illumina HiSeq 2000测序仪进行测序。进一步利用SolexaQA软件包对原始测序数据进行质量(Q20，Phred-Score≥20即1％的错误率)和测序长度(L40，长度≥40bp)过滤。随后，利用Trinity转录组组装软件按默认参数对清理后的序列进行转录组从头de novo组装，获得上述十个草莓品种根、茎、叶、花等组织的转录组功能基因序列，并通过KEGG和GO对基因功能进行注释。通过电子PCR将上述引物对，锚定到功能基因序列上，剔除不能铆定的引物对序列。

具体实验如下：

1、实验材料

1.1草莓品种

共选取42种草莓。

1.2SSR引物

共40对SSR引物。

2、实验过程

2.1草莓基因组DNA的提取

提取上述42个草莓叶片的DNA作为PCR模板。

方法：CTAB提取法

操作步骤：

1.每个样按1000ul的CTAB提取液+5ul的β-巯基乙醇计，混匀所需CTAB和巯基乙醇，65℃水浴预热CTAB溶液；

2.取约1/3体积的植物叶片放到2ml离心管中，加一颗钢珠，于液氮中快速冷冻后用磨样机将叶片磨碎；

3.加入1ml制备好的CTAB溶液，涡旋混匀，65℃水浴30min(期间每隔几分钟晃动一下)；

4.加入1ml氯仿异戊醇(CI)，颠倒混匀，抽提10min，13000rpm离心10min；

5.吸上清，加入等体积的氯仿异戊醇(CI)，颠倒混匀，抽提10min，13000rpm离心10min；

6.重复步骤5；

7.吸上清(约500ul)至1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀2h以上；

8.13000rpm离心30min；

9.弃上清，加入1ml 75％的酒精洗涤；

10.重复步骤8，弃上清；

11.通风橱吹干，加入50ulddH

12.测DNA浓度；

2.2多态性SSR引物的筛选

用上述40对SSR引物对42个草莓DNA模板进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳筛选出多态性较好的SSR引物。

附：实验条件：

1)DNA模板：DNA浓度稀释到约50ng/μl。

2)SSR引物：共40对。

5)琼脂糖凝胶浓度：2％

通过PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，发现40对引物中有32个(80％)在不同草莓品种中是存在多态性的。