吡硫锌在肺癌治疗中的应用

摘要

本发明涉及吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物在制备用于治疗肺癌的药物中的用途。吡硫锌可以通过诱导肿瘤细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞周期，抑制肿瘤迁移等多种机制抑制肺癌细胞的增殖，从而到达抑制肿瘤生长或清除肿瘤的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体而言，涉及吡硫锌在肺癌治疗中的应用。

背景技术

癌症严重危害全球人类的健康，根据美国癌症学会官方期刊《临床医师癌症杂志》发表的“2018年全球癌症统计数据”报告显示预计2018年全球大约有1810万癌症新发病例和960晚癌症死亡病例，其中肺癌是全球第一大癌症，发病率(11.6％)与死亡率(18.4％)均处于首位。肺癌因其诱因与发病机制复杂，肿瘤细胞具有高度的复杂性与异质性。目前临床上肺癌主要分为两大类型，非小细胞肺癌与小细胞肺癌，非小细胞肺癌又可以分为肺鳞癌，肺腺癌，大细胞肺癌。针对肺癌的治疗性药物具有十分重要的前景，同时又将面临巨大的挑战。

目前，针对的肺癌的治疗性药物价格昂贵，病人往往难以承受，甚至有些病人因为不能承受昂贵的价格而放弃了治疗机会。因此开发价格低廉治疗效果好的小分子化药具有十分重要的意义。

吡硫锌(Pyrithione zinc，zinc pyrithione，zinc pyrithion，PYZ，zincpyridinethione，ZPT)CAS号为13463-41-7，分子式为C

吡硫锌对真菌和细菌有较强的杀灭力，能够有效地杀死产生头皮屑的真菌，起到去屑作用。另外吡硫锌也常用于治疗牛皮癣。

到目前为止，吡硫锌在肺癌中的广谱治疗效果还尚未报道。

发明内容

本发明人意外地发现吡硫锌对肺癌具有广谱的治疗活性。其可以通过诱导肿瘤细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞周期，抑制肿瘤迁移等多种机制抑制肺癌细胞的增殖，从而到达抑制肿瘤生长或清除肿瘤的效果。

本发明涉及吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物在制备用于治疗肺癌的药物中的用途。

本发明还涉及药物组合物在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其中所述药物组合物含有吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还涉及吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物与第二抗肿瘤药物联合用于制备用于治疗肺癌的药物的用途。

本发明还涉及吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物，其用于治疗肺癌。

本发明还涉及一种治疗肺癌的方法，其包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物。

本发明还涉及另一种治疗肺癌的方法，其包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的药物组合物。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的肺癌选自：肺鳞癌，肺腺癌，大细胞肺癌，小细胞肺癌或者它们的任意组合。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的药物组合物中还含有第二抗肿瘤药物。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的第二抗肿瘤药物为免疫检验点抑制剂，传统化疗药物，或小分子抑制剂。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的免疫检验点抑制剂包括但不限于：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的传统化疗药物包括但不限于：紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的小分子抑制剂包括但不限于EGFR抑制剂、HER2抑制剂、ALK抑制剂等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的PD-1抑制剂包括但不限于：Nivolumab、Pembrolizumab、IBI-308、Camrelizumab(SHR-1210)、Tislelizumab、Cemiplimab、BCD-100、TSR-042、PDR-001、JNJ-63723283)等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的PD-L1抑制剂包括但不限于：Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab、BMS-936559、M-7824、CX-072)等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的CTLA4抑制剂包括但不限于：伊匹木单抗(Ipilimumab)、Tremelimumab、AGEN-1884、AK-104)等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的EGFR抑制剂包括但不限于：Cetuximab、Erlotinib、Gefitinib、Lapatinib Ditosylate、Neratinib、Theliatinib、Cyasterone、Osimertinib、Avitinib、Afatinib、Gefitinib、Canertinib、Lapatinib、AG-490、Pelitinib、Dacomitinib等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的HER2抑制剂包括但不限于：Poziotinib、Trastuzumab、Pertuzumab、Irbinitinib等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述的ALK抑制剂包括但不限于：Crizotinib、TAE684(NVP-TAE684)、Alectinib、AZD3463、ASP3026、Brigatinib(AP26113)、Ensartinib(X-396)、Alectinib等。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述药物组合物可以是片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂或注射剂。

根据本发明的某些实施方案，本发明所述药物组合物可通过口服、注射、植入、外用、喷雾或吸入的方式向受试者给药。

根据本发明的某些实施方案，本发明吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物在用于治疗肺癌时，作为细胞毒性药物、肿瘤生长抑制剂、抗肿瘤转移药物和/或抗肿瘤侵袭药物。

根据本发明的某些实施方案，吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物与第二抗肿瘤药物联合应用时，吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物与第二抗肿瘤药物在同一种制剂单元中，或者吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物与第二抗肿瘤药物联合分别在不同的制剂单元中。

根据本发明的某些实施方案，吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物与第二抗肿瘤药物联合应用时，吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物与第二抗肿瘤药物可以同时或分开施用到需要治疗的个体中；或者先施用吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物，间隔一定时间后再施用第二抗肿瘤药物；或者先施用第二抗肿瘤药物，间隔一定时间后再施用吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物。

本发明所述的载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

本发明所述赋形剂是指在药物制剂中除主药以外的附加物。其性质稳定，与主药无配伍禁忌，不产生副作用，不影响疗效，在常温下不易变形、干裂、霉变、虫蛀、对人体无害、无生理作用，不与主药产生化学或物理作用，不影响主药的含量测定等。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；口服液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂，等等。

本发明中使用的术语“受试者”包括哺乳动物和人，优选为人。

本发明中所使用的术语“有效量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫系统的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

对受试者给予的吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物或第二抗肿瘤药物的量取决于所述疾病或病况的类型和严重程度以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受度，还取决于制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔等因素。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素来确定适当的剂量。一般而言，吡硫锌、其立体异构体或其在药学上可接受的各种修饰物或第二抗肿瘤药物用于治疗日剂量可为大约0.0001～1000mg/kg体重/天，该日剂量可以视情况一次或分多次给予。

本发明的有益技术效果

本发明提供的抗肿瘤药物吡硫锌对肺癌具有广谱的治疗活性，其可以通过诱导肿瘤细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞周期，抑制肿瘤迁移等多种机制抑制肺癌细胞的增殖，从而到达抑制肿瘤生长或清除肿瘤的效果。吡硫锌的优势在于患者易于接受，并且价格低廉、容易获取。可以预见吡硫锌将会改变已有肿瘤化疗药物的市场格局，成为一种可长期服用，且有效抑制肺癌转移、侵袭和复发的临床药物。

附图说明

图1显示出了吡硫锌对人肺腺癌细胞系的增殖抑制作用；

图2显示出了吡硫锌对人肺鳞癌细胞系的增殖抑制作用；

图3显示出了吡硫锌对人大细胞肺癌细胞系的增殖抑制作用；

图4显示出了吡硫锌对人小细胞肺癌细胞系的增殖抑制作用；

图5显示吡硫锌可以诱导肺腺癌细胞系A549发生凋亡；

图6显示吡硫锌可以诱导肺鳞癌细胞系H2170发生凋亡；

图7显示吡硫锌可以诱导大细胞肺癌细胞系H661发生凋亡；

图8显示吡硫锌可以诱导小细胞肺癌细胞系H1417发生凋亡；

图9显示吡硫锌可以抑制肺癌细胞迁移；

图10显示吡硫锌可以抑制肺癌细胞分裂的细胞周期；

图11显示吡硫锌可抑制肺癌细胞系在SCID小鼠模型中生长。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

吡硫锌，购自MCE；高糖DMEM培养基，RIPM1640培养基，胎牛血清FBS(Gibco)，CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；96孔板(Nunc品牌)购自Thermo公司；SCID小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。

下述实施例1-4中，将吡硫锌用培养基稀释成浓度为10mmol/L的母液，使用时再用培养基稀释成不同梯度的使用浓度。实施例5中用到的吡硫锌注射液使用磷酸盐缓冲液(PBS)配制而成，浓度为200μg/mL。

下述实施例中选用的细胞系为：人肺腺癌细胞A549(培养基为：DMEM高糖培养基加10％FBS，购自

实施例1吡硫锌对肺癌不同肿瘤细胞杀伤作用实验

实验方法为测定CCK-8细胞活力。CCK-8试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

具体实验步骤为：细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应的DMEM或RIPM1640培养基中。将细胞接种于96孔培养板中，5000cells/孔，置于37摄氏度/二氧化碳(5％)培养箱中培养8小时，使细胞贴壁，第二天，弃去培养液，加入吡硫锌的细胞培养液(具体浓度在每种细胞结果中述及)，并设置不加药物的对照孔，置于37摄氏度/二氧化碳(5％)培养箱培养48小时后，吸去上清，每孔加入100μL无血清DMEM培养基与10μL CCK-8检测试剂的混合液，37摄氏度/二氧化碳(5％)孵育2-4h。用酶标仪(Multiscan FC，Thermo公司产品)测定450nm/620nm处的吸光度，按下式计算细胞存活率。

细胞存活率＝(实验组OD/对照组OD)*100％

实验结果1吡硫锌对肺腺癌细胞系的增殖抑制作用

吡硫锌对肺腺癌细胞系A549,H1299,H358的增殖抑制作用如图1所示。所用的吡硫锌的浓度为5μmol/L。从图1中可以看出吡硫锌对三株肺腺癌细胞增殖抑制的效果均能达到90％以上，证实吡硫锌对肺腺癌细胞具有很好的增殖抑制效果。

实验结果2吡硫锌对肺鳞癌细胞系的增殖抑制作用

吡硫锌对肺鳞癌细胞系SK-MES-1,Ebc-1,H520,H2170，H1703的增殖抑制作用如图2所示。所用的吡硫锌的浓度为5μmol/L。从图2中可以看出吡硫锌对五株肺鳞癌细胞增殖抑制的效果均能达到90％以上，证实吡硫锌对肺鳞癌细胞具有很好的增殖抑制效果。

实验结果3吡硫锌对大细胞肺癌细胞系的增殖抑制作用

吡硫锌对大细胞肺癌细胞系H661的增殖抑制作用如图3所示。所用的吡硫锌的浓度为5μmol/L。从图3中可以看出吡硫锌对大细胞肺癌细胞增殖抑制的效果能达到90％以上，证实吡硫锌对大细胞肺癌细胞具有很好的增殖抑制效果。

实验结果4吡硫锌对小细胞肺癌细胞系的增殖抑制作用

吡硫锌对小细胞肺癌细胞系H510A，H1417，DMS 114的增殖抑制作用如图4所示。所用的吡硫锌的浓度为5μmol/L。从图4中可以看出吡硫锌对小细胞肺癌细胞增殖抑制的效果能达到90％以上，证实吡硫锌对小细胞肺癌细胞具有很好的增殖抑制效果。

实施例2吡硫锌诱导肺癌细胞发生凋亡实验

实验方法为采用Annexin V-FITC/PI双染色法，利用流式细胞仪检测细胞凋亡。

Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡的原理如下：正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含负电的磷脂(如磷脂酰丝氨酸，PS)，而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡的早期，细胞膜内的PS会从内侧翻转到细胞膜表面。Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的，对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核染色。因此Annexin V和PI同时使用，可以将凋亡早期的细胞与其它细胞区别开来。

具体实验步骤为：细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应的DMEM或RIPM1640培养基中。将细胞接种于6孔培养板中，待其长满后，加入不同浓度的吡硫锌的细胞培养液(具体浓度在每种细胞结果中述及)处理24小时后，加胰蛋白酶(不加EDTA，因为EDTA可与Annexin-V结合，影响实验)消化，离心收集细胞，若为悬浮细胞则收集细胞悬液后再离心。用冷的PBS洗细胞2遍；加入1×binding buffer 100μl重悬细胞,细胞浓度为1×10

实验结果5吡硫锌可诱导肺腺癌细胞发生凋亡

肺腺癌细胞系A549经不同浓度的吡硫锌处理后，肿瘤细胞可发生明显的凋亡现象，结果如图5所示。吡硫锌药物浓度分别为10μmol/L,5μmol/L,2.5μmol/L,1.25μmol/L,处理时间为24小时。从图5中可以看出，吡硫锌可以诱导肺腺癌细胞发生凋亡。

实验结果6吡硫锌可诱导肺鳞癌细胞发生凋亡

肺鳞癌细胞系H2170经不同浓度的吡硫锌处理后，肿瘤细胞可发生明显的凋亡现象，结果如图6所示。吡硫锌药物浓度分别为10μmol/L,5μmol/L,2.5μmol/L,1.25μmol/L,处理时间为24小时。从图6中可以看出，吡硫锌可以诱导肺鳞癌细胞发生凋亡。

实验结果7吡硫锌可诱导大细胞肺癌细胞发生凋亡

大细胞肺癌细胞系H661经不同浓度的吡硫锌处理后，肿瘤细胞可发生明显的凋亡现象，结果如图7所示。吡硫锌药物浓度分别为10μmol/L,5μmol/L,2.5μmol/L,1.25μmol/L,处理时间为24小时。从图7中可以看出，吡硫锌可以诱导大细胞肺癌细胞发生凋亡。

实验结果8吡硫锌可诱导小细胞肺癌细胞发生凋亡

小细胞肺癌细胞系H1417经不同浓度的吡硫锌处理后，肿瘤细胞可发生明显的凋亡现象，结果如图8所示。吡硫锌药物浓度分别为10μmol/L,5μmol/L,2.5μmol/L,1.25μmol/L,处理时间为24小时。从图8中可以看出，吡硫锌可以诱导小细胞肺癌细胞发生凋亡。

实施例3吡硫锌抑制肿瘤细胞迁移实验

实验方法为细胞划痕实验。细胞划痕实验是最简单经济研究细胞迁移的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，若细胞的迁移能力越强，则愈合划痕的时间就越短。

具体实验步骤为：通过胰蛋白酶消化细胞3分钟，加入培养基终止消化反应。然后轻轻吹打混匀细胞，将细胞均匀种于六孔版。将细胞置于含5％CO

实验结果9吡硫锌可显著抑制肺癌细胞的迁移

肺癌细胞系A549经不同浓度的吡硫锌的细胞培养液处理后，均可显著抑制肿瘤细胞的迁移能力，结果如图9所示。吡硫锌的药物浓度分别为1μmol/L，2.5μmol/L，5μmol/L。从图9中可以看出当吡硫锌浓度低至为2.5μmol/L时，相比于对照组，吡硫锌仍可以显著抑制肿瘤细胞的迁移。

实施例4吡硫锌抑制肿瘤细胞的细胞周期实验

实验方法为采用碘化丙啶(PI)DNA染色法分析细胞周期。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性嵌入核酸DNA双螺旋的碱基之间与之结合，结合量与DNA的含量成正比关系，其荧光强度直接能反映细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期，S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过软件计算各时相的细胞百分率。

具体实验步骤为：通过胰酶消化细胞3分钟，加入培养基终止消化反应。然后轻轻吹打混匀细胞，将细胞均匀种于六孔版。将细胞置于含5％CO

实验结果10吡硫锌可抑制肿瘤细胞的细胞周期，抑制肿瘤细胞的分裂

肺癌细胞系H1417经吡硫锌处理后，肿瘤细胞的细胞周期明显收到抑制，如图10所示，其中PYZ代表吡硫锌。吡硫锌药物浓度为0.5μmol/L，1μmol/L，2μmol/L，4μmol/L，处理时间为48小时。从图10中可以看出吡硫锌可以显著抑制肺癌细胞的细胞分裂周期，肿瘤细胞处于S期与G2/M期的比例明显降低。

实施例5吡硫锌抑制肺癌细胞在SCID小鼠模型中增殖的实验

实验动物：6-8周龄的雌性C.B17SCID小鼠，其来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司；根据厦门大学实验动物中心与伦理委员会所批准的方案，将该小鼠在SPF条件下饲养。

具体实验步骤：将用于SCID小鼠皮下成瘤的肿瘤细胞(肺腺癌细胞系A549)用0.01％胰蛋白酶消化后，再使用含10％的胎牛血清的细胞培养基重悬成单细胞悬液；计数悬液的细胞密度，1000g，3min离心沉淀细胞，再用适量体积的PBS重悬细胞，使达到约10

肿瘤大小(mm

实验结果11吡硫锌治疗能有效抑制肿瘤细胞在SCID小鼠模型中的增殖

吡硫锌治疗组与阴性对照组的每只小鼠中肿瘤体积的生长变化情况分别如图11所示。结果显示，吡硫锌治疗组的SCID小鼠的肿瘤的生长的速度比对照组的SCID小鼠更慢，治疗组肿瘤大小远小于对照组。上述结果表明吡硫锌具有很好的肺癌治疗活性。

通过以上的实验可以看出吡硫锌作为抗肺癌的治疗性药物中的广谱性与有效性。同时本发明的吡硫锌具有其它药物不可比拟的优势，其具有很好的安全性、价格低廉、容易获取。此外，吡硫锌因其很好的安全性与有效性将成为一种可长期服用，且有效抑制肿瘤转移、侵袭和复发的临床药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。