嵌合抗原受体修饰的NK-92细胞

摘要

提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的NK‑92细胞。该CAR可以包含FcεRIγ的细胞内结构域。还描述了用于治疗患有或疑似患有可以用NK‑92细胞治疗的疾病的患者的方法，该疾病如癌症或病毒感染，该方法包括向该患者施用NK‑92‑CAR细胞。

说明书

本申请要求我们的序列号为62/756,395和62/756,402的共同待决的美国临时申请的优先权，二者均于2018年11月6日提交。

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技术领域

本发明的领域是表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰的免疫感受态细胞，尤其是表达具有Fcε受体γ(FcεRIγ)信号传导结构域的 CAR的修饰的NK-92细胞。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是细胞毒性淋巴细胞，构成先天免疫系统的重要组成部分。在大多数情况下，NK细胞约占循环淋巴细胞的 10％-15％，并结合并杀伤靶细胞，该靶细胞包括病毒感染细胞和许多恶性细胞。NK细胞杀伤对特定抗原没有特异性，可以在没有既往免疫敏化的情况下发生。靶向细胞的杀伤通常由细胞溶解蛋白(包括穿孔素、颗粒酶和颗粒溶素)介导。

自体NK细胞已经用作治疗实体。为此，从全血的外周血淋巴细胞级分中分离出NK细胞，在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新输注至受试者中。自体NK细胞至少在某些情况下显示出在离体治疗和体内治疗中具有中等有效性。然而，自体NK细胞的分离和生长需要大量的时间和成本。此外，并非所有NK细胞均具有细胞溶解作用，这进一步限制了自体NK细胞疗法。

这些困难中的至少一些可以通过使用NK-92细胞来克服，NK-92 细胞是一种细胞溶解性癌细胞系，其是在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现的，然后在体外无限增殖(Gong等人，Leukemia[白血病]8:652-658(1994))。虽然NK-92细胞是NK细胞的衍生物，但 NK-92细胞缺乏正常NK细胞所具有的主要抑制受体，而保留了大部分活化受体。但是，NK-92细胞不会攻击正常细胞，也不会引发人体无法接受的免疫排斥反应。由于这些预期特性，NK-92细胞被详细表征，并被探索用作治疗某些癌症的治疗剂，例如，如WO 1998/049268或US 2002/068044所述。

区分肿瘤细胞和源自同一组织的正常细胞的表型变化通常与特定基因产物表达的一种或多种变化有关，包括正常细胞表面组分的丢失或其他组分的获得(即，在相应的正常非癌组织中无法检测到的抗原)。在肿瘤或肿瘤细胞中表达但在正常细胞中不表达的抗原，或在肿瘤细胞中表达的水平大大高于正常细胞中发现的水平的抗原，被称为“肿瘤特异性抗原”或“肿瘤相关抗原”。此类肿瘤特异性抗原可以用作肿瘤表型的标志物。肿瘤特异性抗原包括癌症/睾丸特异性抗原 (例如，MAGE、BAGE、GAGE、PRAME和NY-ESO-1)、黑素细胞分化抗原(例如，酪氨酸酶、Melan-A/MART、gpl00、TRP-1和 TRP-2)、突变或异常表达的抗原(例如，MUM-1、CDK4、β-连环蛋白、gp100-in4、p15和N-乙酰葡萄糖胺基转移酶V)以及在肿瘤中表达水平较高的抗原(例如，CD19和CD20)。

肿瘤特异性抗原已被用作癌症免疫疗法的靶标。一种此类疗法是利用在免疫细胞(包括T细胞和NK细胞)表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)来改善对癌细胞的细胞毒性。CAR包含与至少一个细胞内信号传导结构域连接的单链可变片段(scFv)。该scFv识别并结合靶细胞(例如，癌细胞)上的抗原，并引发效应细胞活化。信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸活化结构域(ITAM)，其对受体的细胞内信号传导非常重要。

用于T细胞的第一代CAR包含一个胞质信号传导结构域。例如， T细胞中第一代CAR的一个版本包括来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的信号传导结构域，其包含一个ITAM，而另一个版本包含来自CD3ζ的信号传导结构域，其中CD3ζ包含三个ITAM。体内和体外研究表明， CD3ζCAR T细胞在根除肿瘤方面比FcεRIγCAR T细胞更有效(例如， Haynes等人，2001,J.Immunology[免疫学杂志]166:182-187；Cartellieri 等人，2010,J.Biomed andBiotech[生物医学与生物技术],2010卷,文章ID 956304)。然后进一步的研究表明，此类重组T细胞的完全活化和增殖需要一定的共刺激信号，并且第二代和第三代CAR将多个信号传导结构域结合到单一CAR中，以增强重组CAR T细胞的疗效。由于它们在检测的T细胞中文献报道的效应不太理想，因此第一代 CAR和FcεRIγ信号传导结构域被大量放弃，转而使用CD3ζ组合一个或多个另外的信号传导结构域(例如，Hermanson和Kaufman 2015,Frontiers in Immunol.[免疫前沿],第6卷,文章195)。

最近，选择的CAR也已经在NK细胞中表达。例如，CAR修饰的NK-92细胞已使用仅具有CD3ζ细胞内信号传导结构域的第一代 CAR。这些第一代CAR-NK细胞已靶向多种抗原，包括用于B细胞淋巴瘤的CD19和CD20，用于乳腺癌、卵巢癌和鳞状细胞癌的ErbB2，用于神经母细胞瘤的GD2，以及用于多发性骨髓瘤的CD138。还已经针对几种抗原构建了来自NK-92系的第二代CAR-NK细胞，包括用于多种癌的EpCAM，用于EB(Epstein-Barr)病毒的HLA-A2 EBNA3复合体，用于多发性骨髓瘤的CS1，以及用于HER2阳性上皮癌的 ErbB2。在第二代NK-92 CAR中，与CD3ζ一起使用的最常见的细胞内共刺激结构域是CD28。然而，由于NK细胞不自然表达CD28，因此尚不清楚CD28结构域的潜在作用。另外的第二代CAR已将4-1BB 细胞内信号传导结构域与CD3ζ结合在一起，以改善NK细胞的持久性。其他人则使用与单独CD3ζ融合的ErbB2scFv、CD28和CD3ζ、或4-1BB和CD3ζ比较了不同细胞内结构域对乳腺癌细胞的功能性。他们发现，与第一代CAR相比，两种第二代构建体均具有更好的杀伤力，CD28和CD3ζ具有65％的靶标裂解，4-1BB和CD3ζ裂解了 62％，单独CD3ζ杀伤了51％的靶标。在最近的研究中，还使用在NK-92 细胞上表达的抗CD19 CAR对4-1BB和CD28细胞内结构域用于B细胞恶性肿瘤进行了比较。还有其他人发现，CD3ζ/4-1BB构建体在细胞杀伤和细胞因子产生方面不如CD3ζ/CD28有效，突出了CD28和 4-1BB共刺激结构域的不同作用。

第三代NK-92CAR由具有CD3ζ、CD28和4-1BB细胞内信号传导结构域的抗CD5 scFv构建，并已证明对多种T细胞白血病和淋巴瘤细胞系以及原发性肿瘤细胞具有特异性和强效的抗肿瘤活性。此类细胞还能够在T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞系和原发性肿瘤细胞的异种移植小鼠模型中抑制疾病进展(Transl Res.[转化医学研究]2017年9月；187:32-43)。在进一步的实例中，WO 2016/201304 和WO 2018/076391教导了在NK细胞和NK-92细胞中表达的第三代 CD3ζCAR的用途。

然而，如对NK-92细胞进行工程改造以表达Fc受体的多次失败所证明，NK细胞(尤其是NK-92细胞)通常很难进行基因修饰。当 NK-92细胞转染多种重组基因或相对较大的重组核酸有效载荷用于异源表达时，这些困难进一步加剧。此外，NK-92细胞在外源蛋白(例如， CD16)重组表达方面也表现出明显缺少可预测性。在功能水平上，尽管在大多数情况下表现出靶向细胞毒性，但大多数(如并非所有)CAR NK-92细胞需要高效靶细胞比。

因此，尽管在本领域已知有大量的重组NK-92细胞，但所有或几乎所有的重组细胞均遇到各种困难。因此，仍需要表达CAR的NK-92 细胞，其大量表达高活性CAR，并且易于以简单有效的方式进行培养。

发明内容

诸位发明人发现，与其他构建体相比，表达含FcεRIγ的CAR 的NK-92细胞意外地表现出优异的细胞溶解活性(通常在相对于效靶细胞比相对较低的情况下)，以及高水平表达含FcεRIγ的CAR。此外，此类重组细胞还以预期的水平表达CD16，并且在进一步修饰以表达刺激性细胞因子的同时，重组NK-92细胞也很容易培养，无需外源IL-2。

因此，在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种基因修饰的NK细胞，其携带膜结合重组嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体包含呈单条多肽链的(i)细胞外结合结构域、(ii)铰链结构域、(iii)跨膜结构域和(iv)FcεRIγ信号传导结构域。最典型地但非必须地，该NK细胞是NK-92细胞。

在一些实施例中，该细胞外结合结构域包含scFv，其可以与肿瘤特异性抗原(例如，CD19、CD20、GD2、HER-2、CD30、EGFR、 FAP、CD33、CD123、PD-L1、IGF1R、CSPG4或B7-H4)、肿瘤相关抗原(例如，MUC-2、brachyury、CEA)、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原(例如，与患者的MHC I和/或MHC II具有高亲和力的新表位)特异性结合。替代性地，该细胞外结合结构域还可以与病毒特异性抗原特异性结合，并且本文设想的典型病毒包括HIV病毒、 HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV病毒。例如，合适的病毒抗原包括HIV病毒的gp120。

在进一步的实施例中，该铰链结构域和/或该跨膜结构域包含CD8 铰链结构域和/或CD28跨膜结构域，和/或该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

另外，设想该基因修饰的NK细胞可以进一步携带膜结合重组 CD16(特别是CD16的高亲和力变体)，和/或该基因修饰的NK细胞可以表达具有内质滞留序列的重组细胞因子。

因此，从不同的角度来看，诸位发明人还设想了一种基因修饰的 NK细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸，其中，该 CAR包含呈单条多肽链的(i)细胞外结合结构域、(ii)铰链结构域、 (iii)跨膜结构域和(iv)FcεRIγ信号传导结构域。如前所述，优选地，通常该NK细胞是NK-92细胞。在一些实施例中，该重组核酸是 RNA，其可以是多顺反子RNA，其进一步编码CD16和/或具有内质滞留序列的细胞因子。关于各种结构域，适用与上述相同的考虑。

在本发明主题的还一方面，诸位发明人还设想了一种治疗有需要的患者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：向患者施用治疗有效量的本文所述的基因修饰的NK细胞，从而治疗癌症。如将容易理解的，设想的方法将进一步包括施用至少一种另外的治疗实体的步骤，该另外的治疗实体包括病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、 N-803、抗体、干细胞移植物和/或肿瘤靶向细胞因子。

例如，通过设想的方法治疗的癌症包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

同样地，诸位发明人设想了一种治疗有需要的患者的病毒感染的方法，该方法包括以下步骤：向患者施用治疗有效量的本文所述的基因修饰的NK细胞(具有细胞外结合结构域还可以与病毒特异性抗原特异性结合)，从而治疗病毒感染。当然，设想的方法可以进一步包括施用抗病毒药物的步骤。

无论治疗类型如何，均可以设想向患者施用约1x10

因此，诸位发明人还设想了如本文所述的基因修饰的NK细胞在治疗癌症或病毒感染中的用途。

通过以下优选的实施例的详细描述以及附图(其中相同的附图标记表示相同的组件)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加显而易见。

附图说明

图1是示例性检测的CD19-CAR的示意图。所有CD19-CAR变体均包含细胞外结构域，其包含抗CD19 scFv区(αCD19-scFv)、来自CD8的铰链区(CD8铰链)和来自CD28的跨膜结构域(CD28 TM)。 CD19CAR的细胞内结构域如所示变化。

图2A是使用标记有eF660的抗scFv抗体通过流式细胞术确定的，转染CD19-CARmRNA后表达图1的CD19-CAR的NK-92细胞的示例性百分比结果。

图2B是使用标记有eF660的抗scFv抗体标记的表达CD19-CAR 的NK-92细胞的荧光强度(MFI)中位值减去背景的示例性结果。

图3A示出了以5:1至0.3:1的效靶比，被表达CD19CAR的 NK-92细胞(效应子)杀伤的NK-92细胞敏感性靶癌细胞(K562) 的百分比示例性结果。

图3B示出了以5:1至0.3:1的效靶比，被表达CD19CAR的 NK-92细胞(效应子)杀伤的NK-92细胞耐受的CD19阳性靶癌细胞 (SUP-B15)的百分比示例性结果。

图4示出了以2:1至0.25:1的效靶比，在使用SUP-B15靶细胞的脱粒测定中标记有抗CD107a抗体的表达CD19-CAR的NK-92(效应子)的MFI示例性结果。

图5示出了如实例中所述的荷有IV Raji肿瘤的动物的示例性存活曲线。统计分析采用对数-秩和(Mantel-Cox)检验。****，P<0.0001。

图6示出了IV Raji肿瘤模型中动物体重变化的示例性结果。数据是平均值±SEM。SEM计算为标准差除以N的平方根。

图7示出了SC Raji模型的示例性肿瘤生长曲线。数据是平均值± SEM。统计分析采用双因素ANOVA，然后通过Tukey检验进行多重比较；***，P<0.001；****，P<0.0001。

图8示出了表明CD19 t-haNK降低SC Raji荷瘤小鼠肝脏转移性疾病负担的示例性数据。小图a：第13天，指定处理组动物的全肝图像。箭头指示转移性病变。在拍摄之前，将肝脏在10％福尔马林中固定至少24小时。小图b：在指定日期，定量肝脏中肿瘤细胞受累百分比(通过H&E染色评价)。在第13天：*，P＝0.0257，通过非配对双尾t检验。由于样本量有限，无法进行第11天和第15天的统计分析。有关原始数据，请见表4。

图9示出了SC Raji肿瘤模型中动物体重变化的示例性结果。数据是平均值±SEM。

图10示出了如实例中所述，在用mCD19-CAR NK-92细胞对比溶媒对照品进行肿瘤内处理后，注射L1210-Luc肿瘤细胞的小鼠的示例性卡普兰-梅耶(Kaplan-Meier)存活曲线。

图11示出了如实例中所述，用L1210-Luc肿瘤细胞再激发的完全缓解动物对比原始对照动物的肿瘤大小的示例性结果。

图12示出了如实施例中所述，在接受mCD19-CAR NK-92细胞进行肿瘤内处理后，注射A20肿瘤细胞的小鼠的示例性卡普兰-梅耶存活曲线。

图13示出了如实施例中所述，用A20肿瘤细胞再激发的完全缓解动物对比原始对照动物的肿瘤大小的示例性结果。

图14示出了HER2.CAR-t-haNK细胞对BT-474细胞的细胞毒性的示例性结果。

图15示出了CD33.CAR-t-haNK细胞对THP-1细胞的细胞毒性的示例性结果。

图16示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对SUP-B15.PD-L1+细胞的细胞毒性的示例性结果。

图17示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对U251细胞的细胞毒性的示例性结果。

图18示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞对A-549细胞的细胞毒性的示例性结果。

图19示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的细胞毒性的示例性结果。

图20示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对SUP-B15细胞的细胞毒性的示例性结果。

图21示出了CD19.CAR-t-haNK细胞对SKBr3细胞的ADCC的示例性结果。

图22示出了IGF1R.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的细胞毒性的示例性结果。

图23示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对多种癌细胞的细胞毒性的示例性结果。

图24示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的细胞毒性的示例性比较结果。

图25示出了CD16和CD19.CAR表达的示例性结果。

图26示出了CD19.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图27示出了CAR介导的CD19.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图28示出了CD19.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图29示出了CD16和CD20.CAR表达的示例性比较结果。

图30示出了CD20.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图31示出了CD16和CD33.CAR表达的示例性结果。

图32示出了CD33.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图33示出了CAR介导的CD33.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图34示出了CD33.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图35示出了CD16和EGFR.CAR表达的示例性结果。

图36示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图37示出了CAR介导的EGFR.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图38示出了CAR介导的EGFR.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图39示出了EGFR.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图40示出了CD16和HER2.CAR表达的示例性结果。

图41示出了HER2.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图42示出了CAR介导的HER2.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图43示出了HER2.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图44示出了CD16和PD-L1.CAR表达的示例性结果。

图45示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图46示出了CAR介导的PD-L1.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图47示出了PD-L1.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图48示出了CAR介导的CD123.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图49示出了CD123.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图50示出了CD16和CD30.CAR表达的示例性结果。

图51示出了CD30.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图52示出了CAR介导的CD30.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图53示出了CD30.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图54示出了CD16和BCMA.CAR表达的示例性结果。

图55示出了CAR介导的BCMA.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图56示出了BCMA.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图57示出了CD16和gp120.CAR表达的示例性结果。

图58示出了gp120.CAR-t-haNK细胞的GP120结合的示例性结果。

图59示出了gp120.CAR-t-haNK细胞的自然细胞毒性的示例性结果。

图60示出了gp120.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性结果。

图61示出了CD16和FAP.CAR表达的示例性结果。

图62示出了CAR介导的FAP.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图63示出了CSPG4.CAR-t-haNK细胞中CSPG4表达的示例性结果。

图64示出了CAR介导的CSPG4.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果。

图65描述了编码IGF1R-CAR、CD16和IL-2

具体实施方式

迄今为止，含FcεRIγ的CAR尚未在NK-92细胞、其他NK细胞系或内源性NK细胞中使用，因为认为信号传导结构域(例如，CD3ζ) 更有效，特别是与其他信号传导结构域(第二代和第三代CAR中) 组合时。诸位发明人现已得到出乎意料的意外发现，即与表达具有CD3ζ信号传导结构域的CAR的NK-92细胞(其具有3个ITAM域，即使这些ITAM结构域与其他信号传导结构域(即第二代或第三代 CAR)组合)相比，表达包含来自FcεRIγ的细胞内结构域(仅具有一个ITAM结构域)的第一代CAR的NK-92细胞，对表达CAR识别的抗原的癌细胞具有相同或更高的细胞毒活性。值得注意的是，在其自然环境中，IgE受体(FcεRI)包括两条通过二硫键相互连接的γ链，通常仅在嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和表皮朗格汉斯(Langerhans) 细胞中表达。诸位发明人还得到了出乎意料的发现，即包含来自 FcεRIγ的细胞内结构域的CAR在NK-92细胞表面以高于其他CAR 的水平表达，特别是包含CD3ζ信号传导结构域的CAR。

因此，本发明的主题涉及一种基因修饰的NK-92细胞或NK细胞系，其经工程改造以在细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)。最典型地，该CAR包含来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的细胞内结构域，然而，在其他实施例中，该CAR还可以包含T细胞受体(TCR)CD3ζ(CD3 zeta)细胞内结构域。如将容易理解的是，该CAR可以由NK-92细胞从重组DNA或RNA分子瞬时或稳定表达。

因此，在本发明主题的一方面，NK细胞、NK-92细胞或NK/NK-92 细胞系在包含FcεRIγ胞浆结构域(例如，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)的NK-92细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)。替代性地，或另外地，该CAR还可以包含CD3ζ的胞浆结构域(例如，具有 SEQID NO:10所示的氨基酸序列，其可以由SEQ ID NO:11(密码子优化的)或SEQ ID NO:12(非密码子优化的)所示的核酸编码；全长序列如SEQ ID NO:47所示)。在另一方面，设想了一种NK或NK-92 细胞系，其经编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸转化。例如，优选的核酸编码FcεRIγ的胞浆结构域(例如，包含SEQ ID NO:2或由其组成)。替代性地，或另外地，该核酸编码CD3ζ的胞浆结构域(例如，包含SEQ ID NO:11(人，密码子优化的)或SEQ ID NO:12(人)或由其组成)。如将容易理解的是，该CAR可以通过其细胞外结合结构域靶向癌症相关或病毒相关抗原，如下文更详细描述。

在进一步设想的实施例中，NK或NK-92细胞可以经修饰以表达至少一种细胞因子或其变体。例如，细胞因子可以由重组细胞瞬时或稳定表达，并且该细胞因子可以包括内质滞留信号。如预期，NK或 NK-92细胞还可以经修饰以表达自杀基因(例如，自杀基因是胸苷激酶)。不受任何理论的约束，认为自杀基因的表达可以通过提供在引入合适刺激后选择性杀伤细胞的机制来防止NK-92细胞的不受控增殖。

在本发明主题的另一方面，诸位发明人还设想了一种治疗有需要的患者癌症的方法，该方法包括以下步骤：向患者施用治疗有效量的修饰的NK/NK-92细胞或NK/NK-92细胞系，其经工程改造以表达本文所述的嵌合抗原受体(CAR)。从不同的角度来看，诸位发明人还设想了一种表达嵌合抗原受体(CAR)的修饰的NK/NK-92细胞或 NK/NK-92细胞系，其优选地包含FcεRIγ的胞浆结构域，用于治疗受试者的癌症。在一些实施例中，用途包括向受试者施用有效量的本文所述的修饰的细胞或细胞系以治疗肿瘤。在又其他实施例中，设想了一种杀伤肿瘤细胞的体外方法，并且该方法可以包括将肿瘤细胞与本文所述的修饰的NK-92细胞或NK-92细胞系接触的步骤。在一些实施例中，修饰的NK-92细胞或NK-92细胞系表达与肿瘤细胞上的抗原结合的CAR。在一些实施例中，该CAR优选地包含来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的细胞内结构域。替代性地，或另外地，该CAR包括T 细胞受体(TCR)CD3ζ(CD3 zeta)细胞内结构域。

在还其他实施例中，描述了一种治疗有需要的患者的病毒感染的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的表达CAR的 NK-92细胞。

在阅读该描述之后，对于本领域技术人员而言，如何在各种替代实施例和替代应用中实施本发明将变得显而易见。然而，本文未描述本发明的所有实施例。将理解的是，这里呈现的实施例仅以示例而非限制的方式呈现。同样，各种替代实施例的这种详细描述不应解释为限制本发明的范围或广度，如下所述。

在披露和描述本发明之前，应当理解，以下描述的方面不限于特定组合物、制备此类组合物的方法、或其用途，这些当然可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不旨在对其进行限制。

为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，但这并不旨在影响本发明的范围。另外，本说明书中使用的一些术语在下面更具体地定义。

关于合适的NK细胞，应当注意，所有NK细胞均被认为适用于本发明，因此包括原代NK细胞(保存、扩增和/或新鲜的细胞)、已永生化的继代NK细胞、自体或异种NK细胞(原液、保存的、新鲜的等)和修饰的NK细胞，如以下更详细所述。在一些实施例中，优选地，该NK细胞是NK-92细胞。NK-92细胞系是独特的细胞系，发现其在白介素2(IL-2)的存在下增殖(参见，例如Gong等人，Leukemia [白血病]8:652-658(1994))。NK-92细胞是癌性NK细胞，在合适的培养基中扩增后具有广泛的抗肿瘤细胞毒性和可预测的产量。有利地，NK-92细胞对多种癌症具有高细胞溶解活性。

原始NK-92细胞系表达CD56

因此，合适的NK细胞可以具有一个或多个修饰的KIR，该修饰的KIR被突变以减少或消除与MHC I类分子的相互作用。当然，应当注意，还可以使一个或多个KIR缺失或抑制其表达(例如，通过 miRNA、siRNA等)。最典型地，多于一个KIR将被突变、缺失或沉默，并且特别预期的KIR包括具有两个或三个结构域、具有短或长的胞质尾区的那些。从不同的角度来看，经修饰的、沉默的或缺失的 KIR将包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、 KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、和KIR3DS1。可以使用本领域熟知的方案制备此类经修饰的细胞。可替代地，此类细胞还可以作为aNK 细胞(‘活化的自然杀伤细胞)从南特圭斯特公司(NantKwest)(参见URLwww.nantkwest.com)商购获得。然后可以这些细胞经另外的基因修饰为CAR，如下文更详细描述。

在本发明主题的另一方面，基因工程改造的NK细胞也可以是经修饰以表达高亲和力Fcγ受体(CD16)的NK-92衍生物。Fcγ受体的高亲和力变体的序列是本领域熟知的(参见，例如，Blood[血液]2009 113:3716-3725；SEQ ID NO:43和44)，以及所有产生和表达的方式均被认为适用于本文。据信这种受体的表达允许使用对患者的肿瘤细胞(例如，新表位)、具体的肿瘤类型(例如，her2neu、PSA、PSMA 等)特异性的抗体，或与癌症相关联的抗体(例如，CEA-CAM)特异性靶向肿瘤细胞。有利地，此类抗体是可商购的并且可以与细胞连同使用(例如，与Fcγ受体结合)。替代性地，此类细胞还可以以haNK 细胞从南特圭斯特公司商购获得。然后可以这些细胞经另外的基因修饰为CAR，如下文更详细描述。

因此，适用于本文的NK细胞包括NK-92细胞(其可以转染编码 CAR、CD16或其变体、细胞因子或其变体的三顺反子构建体)、表达CD16或其变体或者细胞因子或其变异体的基因修饰的NK细胞或 NK-92细胞(其可以转染编码CAR和CD16或其变异体或细胞因子或其变异体的核酸)、和表达CD16或其变体和细胞因子或其变体的基因修饰的NK细胞或NK-92细胞(其可以转染编码CAR的核酸)

本文设想的NK细胞的基因修饰可以以多种方式进行，并且所有已知方式均被认为适用于此。而且，应该认识到NK细胞可以转染 DNA或RNA，并且转染的具体选择将至少部分取决于预期的重组细胞的类型和转染效率。例如，在预期稳定转染NK细胞的情况下，可以将线性化的DNA引入细胞中以整合到基因组中。另一方面，在预期瞬时转染的情况下，可以使用环状DNA或线性RNA(例如,带有 polyA

相似地，应当理解，转染的方式将至少部分取决于所用核酸的类型。因此，病毒转染、化学转染、机械转染方法均被认为适用于本文。例如，在一个实施例中，本文所述的载体是瞬时表达载体。使用此类载体引入的外源转基因没有整合到细胞的核基因组中；因此，在没有载体复制的情况下，外源转基因将随时间降解或稀释。

在另一实施例中，本文所述的载体允许细胞的稳定转染。在一个实施例中，载体允许将转基因掺入细胞的基因组中。优选地，此类载体具有阳性选择标志物，并且合适的阳性选择标志物包括允许细胞在会杀伤不表达该基因的细胞的条件下生长的任何基因。非限制性实例包括抗生素抗性，例如，遗传霉素(来自Tn5的Neo基因)。

替代性地，或另外地，该载体是质粒载体。在一个实施例中，该载体是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，可以使用任何合适的载体，并且合适的载体是本领域熟知的。

在还其他实施例中，细胞转染编码目的蛋白(例如，CAR)的 mRNA。mRNA转染导致蛋白的瞬时表达。在一个实施例中，在施用细胞之前立即将mRNA转染至NK-92细胞中。在一个实施例中，在施用细胞“之前立即”是指施用之前约15分钟至约48小时。优选地，在施用前约5小时至约24小时进行mRNA转染。在下文更详细描述的至少一些实施例中，转染mRNA的NK细胞导致在高比例的转染细胞上CAR出乎意料地一致和强表达。而且，此类转染细胞在效靶细胞比相当低的情况下也表现出高特异性细胞毒性。

关于设想的CAR，注意到NK/NK-92细胞将经基因修饰以将CAR 表达为膜结合蛋白，从而在细胞表面上暴露一部分CAR，同时在细胞内空间中保持信号传导结构域。最典型的是，CAR将至少包括以下元件(按顺序)：细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。

在优选的实施例中，CAR的胞浆结构域包含FcεRIγ的信号传导结构域或由其组成。例如，FcεRIγ信号传导结构域包含SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中， FcεRIγ胞质结构域是唯一的信号传导结构域。然而，应当理解，还可以包括另外的元件，诸如其他信号传导结构域(例如，CD28信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、4-1BB信号传导结构域等)。这些另外的信号传导结构域可以位于FcεRIγ胞浆结构域的下游和/或 FcεRIγ胞浆结构域的上游。

在一些实施例中，FcεRIγ信号传导结构域包含与SEQ ID NO:1 所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或 99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。

如上所述，在一些实施例中，CAR的胞浆结构域包含CD3ζ(CD3 zeta)的信号传导结构域。在一个实施例中，CAR的胞浆结构域由CD3ζ的信号传导结构域组成。在一个实施例中，CD3ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中，CD3ζ信号传导结构域包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。

该CAR可以包含任何合适的跨膜结构域。在一方面，该CAR包含CD28的跨膜结构域。在一个实施例中，该CD28跨膜结构域包含 SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一些实施例中，该CD28跨膜结构域包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一个实施例中，该跨膜结构域选自CD28跨膜结构域、4-1BB跨膜结构域或FcεRIγ跨膜结构域。

该CAR可以包括任何合适的铰链区。在一方面，该CAR包含 CD8的铰链区。在一个实施例中，该CD8铰链区包含SEQ ID NO:6 所示的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。在一个实施例中，该CD8铰链区包含与SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列具有至少约 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或由其组成或基本上由其组成。

最典型但非必要地，CAR的细胞外结合结构域将是特异性结合目的抗原的scFv或其他自然或合成结合部分。特别合适的结合部分包括具有单个、双重或多个靶标特异性的小抗体片段，β桶状结构域结合子，噬菌体展示融合蛋白等。在其他合适的细胞外结合结构域中，优选的结构域将与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。例如，设想的抗原包括CD19、CD20、 GD2、HER-2、CD30、EGFR、FAP、CD33、CD123、PD-L1、IGF1R、 CSPG4或B7-H4。作为非限制性实例，在US 2013/0189268；WO1999024566 A1；US 7098008；和WO 2000020460中描述了进一步的肿瘤特异性抗原，其各自通过援引以其全文并入本文。同样，其他优选的结构域将与(致病性)病毒特异性抗原(诸如HIV病毒(例如， gp120)、HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV的抗原)特异性结合。

关于预期CAR的构建，应该认识到，CAR可以以下所述的多种方式进行工程改造，例如，WO 2014/039523；US 2014/0242701；US 2014/0274909；US 2013/0280285和WO 2014/099671，其各自通过援引以其全文并入本文。

因此，并且从不同的角度来看，设想的CAR靶向与特定癌症类型相关的抗原。在一个实施例中，癌症是白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括髓细胞性、早幼髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。

因此，设想的CAR通常将具有与铰链结构域(直接)偶联的细胞外结合结构域的结构，该铰链结构域与跨膜结构域(直接)偶联，该跨膜结构域又与FcεRIγ信号传导结构域(直接)偶联。在还进一步的设想方面，除了或替换FcεRIγ信号传导结构域之外，设想的CAR还可以包括一个或多个信号传导结构域，并且特别地，设想的信号传导结构域包括CD3ζ信号传导结构域、4-1BB信号传导结构域和CD28 信号传导结构域。例如，设想的CAR因此可以包括具有SEQ ID NO: 4、23-42和48-59的结合结构域中的任一种，该结合结构域与铰链结构域(例如，SEQ ID NO:6所示的CD8铰链)偶联，该铰链结构域继而与跨膜结构域(例如，SEQID NO:7所示的CD28 TM)偶联，该跨膜结构域与信号传导结构域(例如，SEQ ID NO:1所示的FcεRIγ信号传导结构域、SEQ ID NO:8所示的CD28信号传导结构域、SEQ ID NO:9所示的4-1BB信号传导结构域、SEQ ID NO:10所示的CD3ζ信号传导结构域)偶联。

在还进一步设想的方面，NK细胞可以进一步经基因修饰以表达一种或多种细胞因子，从而提供选择标志物，其中细胞因子和CAR 以相同的重组核酸编码和/或使重组细胞不依赖于外源IL-2。因此，在一些实施例中，NK-92细胞经修饰以表达至少一种细胞因子。特别地，至少一种细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。在优选的实施例中，该细胞因子是IL-2或其变体，并且特别优选的变体包括内质滞留信号(例如，SEQ ID NO:18所示的人IL-2，或具有SEQ ID NO:19所示的ER滞留信号)。例如，克隆IL-2基因并用将IL-2 引导至内质网的信号序列表达。这使IL-2的表达足以进行自分泌活化，但不会在细胞外释放IL-2(例如，ExpHematol.[实验血液学]2005 年2月；33(2):159-64)。替代性地，细胞因子(且特别是IL-15)的表达还可以使得细胞因子的表达量足以提供自分泌生长信号至重组细胞，但也允许至少一些表达的IL-15从细胞中释放，从而提供免疫刺激信号。例如，可以使用同时包含信号肽和内质滞留序列的人IL-15 序列来实现此类表达。内质滞留的IL-15的示例性DNA和蛋白序列分别如SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73所示。

如预期，设想的细胞还可以表达自杀基因。术语“自杀基因”是指允许阴性选择表达自杀基因的细胞的转基因。自杀基因被用作安全系统，允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而被杀伤。如果重组基因引起导致不受控的细胞生长的突变，或者细胞本身能够进行此类生长，则这是符合预期的。已识别多种自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(Escherichia coli)gpt基因和大肠杆菌(E.coli)Deo基因。通常，自杀基因编码的蛋白对细胞没有不良作用，但在特定化合物存在下将杀伤细胞。因此，自杀基因通常是系统的一部分。

在一个实施例中，该自杀基因在NK-92细胞中有活性。在一个实施例中，该自杀基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如，tk30、tk75、sr39tk)。表达TK蛋白的细胞可以使用更昔洛韦杀伤。在另一实施例中，该自杀基因是胞嘧啶脱氨酶，其在5-氟胞嘧啶存在下对细胞有毒。Garcia-Sanchez等人“Cytosine deaminase adenoviralvector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1million-fold when they contaminate hematopoietic cells:a potential purging method forautologous transplantation.[胞嘧啶脱氨酶腺病毒载体和5-氟胞嘧啶在污染造血细胞时选择性地减少乳腺癌细胞100万倍：自体移植的潜在清除方法]”Blood.[血液]1998年7月15日；92(2):672-82。在进一步的实施例中，该自杀基因是细胞色素 P450，其在异环磷酰胺或环磷酰胺存在下有毒。参见，例如，Touati 等人“A suicide gene therapy combiningthe improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development ofan anti-tumor immune response.[自杀基因疗法联合环磷酰胺肿瘤细胞毒性的改善和抗肿瘤免疫应答的进展]”Curr Gene Ther.[当前基因疗法] 2014；14(3):236-46。在又另一实施例中，该自杀基因是iCasp9。Di Stasi, (2011)“Inducible apoptosis as a safetyswitch for adoptive cell therapy. [诱导性凋亡作为过继细胞治疗的安全开关]”NEnglJMed[新英格兰医学杂志]365:1673-1683。另参见Morgan,“Live and LetDie:ANewSuicide Gene Therapy Moves to the Clinic[生或死：一种新自杀基因疗法进入临床]”Molecular Therapy[分子疗法](2012)；20:11-13。iCasp9 在小分子AP1903的存在下诱导凋亡。AP1903是生物学惰性小分子，在临床研究中已显示出良好的耐受性，并已用于过继细胞疗法。

当然，应当注意，所有重组蛋白均可以从单个重组序列表达。然而，通常优选在表达多个重组序列(例如，CAR、CD16、细胞因子) 的情况下，编码区可以排列在具有至少两个或至少三个编码重组蛋白的编码区的多顺反子单元中。因此，可以通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因工程转化为表达载体。当欲将多个转基因插入细胞中时，转基因可以经工程改造进入相同的表达载体或不同的表达载体中。在一些实施例中，细胞转染编码待表达的转基因蛋白的mRNA。在一些实施例中，细胞转染编码待表达的转基因蛋白的DNA。可以使用本领域已知的任何转染方法将转基因、mRNA和DNA引入NK-92 细胞，包括但不限于感染、病毒载体、电穿孔、脂转染、核转染或“基因枪”。

因此，在优选的实施例中，应注意，基因修饰的NK细胞(特别是表达CAR和CD16或其变异体的细胞)将表现出三种不同的细胞杀伤模式：由活化受体(例如，NKG2D受体)介导的一般细胞毒性、由与靶细胞结合的抗体介导的ADCC和CAR介导的细胞毒性。显而易见的是，设想的基因修饰的细胞可用于治疗各种疾病，并且是其中患病细胞呈现疾病特异性或疾病相关抗原的多种癌症和病毒感染。因此，诸位发明人设想了使用本文所述的修饰的NK或NK-92细胞治疗患者的方法。在一实施例中，该患者患有癌症(例如，肿瘤)，并且修饰的NK-92细胞或细胞系表达对来自癌症或肿瘤的细胞表面表达的抗原具有特异性的CAR。在一个实施例中，该患者患有病毒感染，并且修饰的NK-92细胞或细胞系表达对已被所述病毒感染的细胞表面上表达的抗原具有特异性的CAR。在一个实施例中，患者患有细菌感染，并且修饰的NK-92细胞或细胞系表达对引起感染的细菌细胞表面上表达的抗原具有特异性的CAR。

在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括髓细胞性、早幼髓细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

可以按绝对数量的细胞将设想的修饰的NK或NK-92细胞施用于个体。例如，可以施用于个体约1000个细胞/注射至高达约100亿个细胞/注射，诸如每次注射约、至少约、或至多约1×10

修饰的NK-92细胞，和任选的其他抗癌或抗病毒剂可以施用于患有癌症或感染病毒的患者一次，或者可以施用多次，例如，每1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，或任何两个数值之间的任何范围(含端点)。

在一个实施例中，在修饰的NK-92细胞表达自杀基因的情况下，向患者施用引发修饰的NK-92细胞死亡的药剂。在一个实施例中，在施用足以使NK-92细胞杀伤靶细胞的修饰的NK-92细胞之后的时间点施用药剂。

在一个实施例中，在向患者施用前，对修饰的NK-92细胞进行辐照。NK-92细胞的辐照，例如，如美国专利号8,034,332所述，其通过援引以其全文并入本文。在一个实施例中，辐照尚未经工程改造以表达自杀基因的修饰的NK-92细胞。

此外，应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。

以下实例仅用于说明目的，不应解释为对本发明要求权益的限制。本领域技术人员可以使用多种替代技术和程序，它们将类似地允许人们成功地执行预期的发明。

用计算机方法设计编码图1中示意性描绘的CD19CAR每种变体的DNA序列，从头合成，然后亚克隆至mRNA表达载体pXT7 (GeneArt，生命技术公司)中。通过经SalI限制酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))消化将10微克(μg)质粒线性化，并根据生产商的说明使用QIAgen凝胶纯化试剂盒(QIAgen公司)进行纯化。

根据生产商的说明，使用T7 mMessage mMachine Ultra转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)，将线性化的DNA 用作体外合成mRNA的模板。该试剂盒包括聚腺苷酸化延伸步骤，该步骤可增加mRNA的polyA尾的长度，从而增强其体内稳定性。

制备六个CD19-CAR变体的mRNA，并制备绿色荧光蛋白(GFP) mRNA作为阴性对照。所有CD19-CAR多肽变体均包含细胞外结构域，其包含抗CD19 scFv区(αCD19-scFv)(SEQ IDNO:4)、来自 CD8的铰链区(SEQ ID NO:6)和来自CD28的跨膜结构域(SEQ ID NO:7)。CD19CAR的细胞内结构域如下所示，其示意图如图1所示： CAR 3z包含CD3ζ信号传导结构域；CARFcRe含有FcεRIγ信号传导结构域(SEQ ID NO:1)；CAR 28_3z包含与CD3ζ信号传导结构域融合的CD28信号传导结构域；CAR BB_3z包含与CD3ζ信号传导结构域融合的4-1BB信号传导结构域；CAR28_BB_3z包含与4-1BB信号传导结构域融合的CD28信号传导结构域，该4-1BB信号传导结构域与CD3ζ信号传导结构域融合；CARBB_3z_28包含与CD3ζ信号传导结构域融合的4-1BB信号传导结构域，该CD3ζ信号传导结构域与 CD28信号传导结构域融合。

更特别地，图1的具有CD3ζ信号传导结构域的第一代CAR具有SEQ ID NO:13(人)和SEQ ID NO:21(鼠)所示的核酸序列，其翻译成SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。具有FcεRIγ信号传导结构域核酸的第一代CAR具有SEQ ID NO:5所示的核酸序列和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。具有CD28/CD3ζ信号传导结构域的第二代 CAR具有SEQ ID NO:14所示的核酸序列，并且具有4-1BB/CD3ζ信号传导结构域的第二代CAR具有SEQ ID NO:15所示的核酸序列。具有CD28/4-1BB/CD3ζ信号传导结构域的第三代CAR的核酸序列具有SEQ ID NO:16所示的核酸序列，并且具有4-1BB/CD3ζ/CD28信号传导结构域的第三代CAR具有SEQ ID NO:17所示的核酸序列。

如下文更详细地描述，进一步制备具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，其中铰链区是CD8铰链(SEQ ID NO:6或SEQ ID NO: 45(人)，由SEQ ID NO:46编码)，其中跨膜结构域是CD28跨膜结构域(SEQ ID NO:7)，并且其中信号传导结构域是FcεRIγ信号传导结构域(SEQ ID NO:1，由SEQ ID NO:2所示的核酸编码)。

然后，使用选择的scFv部分，如下所述(所有以如图1所示的顺序排列，CAR FcRe)对多种肿瘤相关靶标赋予靶标特异性：CD19 (使用SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24所示的抗CD19 scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:23编码)、CD20(使用SEQ ID NO:26所示的抗CD20scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:25编码)、CD33(使用 SEQ ID NO:28所示的抗CD33 scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:27 编码)、CSPG4(使用SEQ ID NO:30所示的抗CSPG4 scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:29编码)、EGFR(使用SEQ ID NO:32所示的抗EGFR scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:31编码)、IGF1R(使用SEQ ID NO:34所示的抗IGF1R scFv，由密码子优化的SEQ ID NO: 33编码)、CD30(使用SEQ ID NO:36所示的抗CD30scFv，由密码子优化的SEQID NO:35编码)、HER2/neu(使用SEQ ID NO:38所示的抗HER2/neu scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:37编码)、GD2 (使用SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42所示的抗GD2 scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:41编码)、CD123(使用SEQ ID NO:49所示的抗CD123scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:48编码)、PD-L1(使用SEQ ID NO:51所示的抗PD-L1scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:50编码)、B7-H4(使用SEQ ID NO:53所示的抗B7-H4scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:52编码)和FAP(使用 SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59所示的抗FAP scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57编码)。

同样，使用选择的scFv部分按如下方式(对所有与病毒相关的靶标赋予靶标特异性)(均以如图1所示的顺序排列，CARFcRe)： HIV gp120(使用SEQ ID NO:55所示的抗gp120scFv，由密码子优化的SEQ ID NO:54编码)。

如上制备的所有构建体在NK-92细胞中表达良好，并且显示如此修饰的NK-92细胞的生理活性的示例性结果。

NK-92细胞在补充5％人AB血清(Valley生物医药公司，弗吉尼亚州温彻斯特)和500IU/mL IL-2(Prospec公司，以色列雷霍沃特) 的X-Vivo10培养基(龙沙公司，瑞士巴塞尔)中生长。使用Neon

使用标记eF660(eBioscience公司，加利福尼亚州圣地亚哥)的抗scFv抗体，通过流式细胞术确定NK-92细胞表面的CD19CAR表达。图2A示出了所示的CD19CAR在NK-92细胞群中的表达％。图 2B示出了用所示的CD19CAR电穿孔的细胞的荧光强度中位值(MFI，减去背景)。从图2A和2B可以看出，CARFcRe出乎意料地具有最高百分比的在细胞表面表达CD19CAR的细胞(75.2％)，以及最高 MFI(重组细胞上表达的CAR量)，其次是28_3z(61.7％)。

使用基于流式的体外细胞毒性测定，在电穿孔后20小时检测表达CAR的NK-92细胞在体外靶向癌细胞的功效。将效应细胞(表达 CD19CAR或GFP的NK-92)与PKHGL67标记的(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)靶细胞(K562；或SUPB15、 B-ALL、CD19

图3A和3B中提供了示例性结果。如图3A所示，无论CD19CAR 表达如何，NK-92细胞均有效杀伤K562细胞。因此，应注意重组细胞未失去细胞毒性。相反，表达GFP的NK-92细胞在杀伤癌细胞系 SUP-B15方面效率低下。SUP-B15是CD19阳性并对NK-92介导的细胞毒性具有抗性的急性淋巴细胞白血病细胞系。与对照(表达GFP的 NK-92细胞)相比，检测的任何CD19CAR的表达提供了对SUP-B15 细胞系的细胞毒性活性增加，这可以很容易地从图3B中获得。意外地，CARFcRe表现出与第二代和第三代CAR相似或更好的细胞毒性。由于FcεRIγ信号传导结构域仅作为单一单元而不与其他信号传导结构域结合，因此这种发现特别出乎意料。当用于CART细胞中时，此类排列不能提供预期的靶向细胞毒性。有利地，三顺反子mRNA构建体能够产生大量具有优异功能活性的预期CAR。此类构建体在CAR 表达应该是瞬时的情况下特别有益。

脱粒是从NK-92细胞中的分泌性颗粒中释放裂解蛋白(例如，穿孔素和颗粒酶)所需的关键步骤。通过NK-92识别靶细胞以启动脱粒。为了检测构建体中的脱颗粒作用，将效应细胞(NK-92)与未标记的靶细胞(SUP-B15)在96孔板中以不同的效靶比(5:1至0.3:1)混合，并进行将抗CD107a(FITC-缀合，BD Pharmingen公司，加利福尼亚州圣何塞)添加到每个孔中。将培养板于37℃下在CO

包含Fcε细胞内信号传导结构域的CD19 t-haNK细胞(克隆 19.6)。将CD19 t-haNK细胞在补充5％热灭活人AB血清的X-VIVOTM 10培养基中培养。

试验动物：动物品系/物种：NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠；鼠龄：研究开始时9-10周(隔离后)；性别：雌性；体重：研究开始时20-27克。动物数量：IV肿瘤模型为20只；SC肿瘤模型为12只。供应商：Jackson实验室(610Main Street Bar Harbor，ME04609)。

Raji肿瘤模型：Raji癌细胞系：Raji细胞最初购自ATCC(目录号CCL-86TM；批号61723871)，然后进行扩增并准备用于施用。

细胞培养基：由ATCC配制的RPMI-1640培养基，其中补充10％的胎牛血清、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)。

细胞收获：通过离心收集指数期的Raji细胞(第12代)。清洗细胞并以5×10

Raji细胞接种：Raji IV模型。用27号针头(1×10

其他试剂：RPMI-1640培养基，X-VIVO

实验步骤

IVRaji模型-随机分组：在定义为第1天的癌细胞接种后的24小时内，根据体重将20只动物假随机分为2组，每组10只，以实现各组之间相似的平均体重。

供试品：在第2、5、8、10、12和17天，通过离心收获在指数期生长的CD19 t-haNK细胞，并在X-VIVO

体重：在注射肿瘤细胞之前和每周两次对动物进行称重。

临床观察：每天观察动物的死亡率/发病率(G0至G4)和毒性的临床体征。对瘫痪或濒死的动物实施安乐死。

安乐死：通过吸入CO

SC Raji模型-肿瘤体积测量：植入SC肿瘤植入后，每周至少两次检查动物的肿瘤形成情况。当肿瘤变得明显时，每周用数字手持卡尺测量肿瘤体积(TV)一次至两次，并使用以下公式计算：TV＝长度×宽度2/2[长度是肿瘤的最大直径，宽度是肿瘤的最小直径]。

随机分组：当平均肿瘤体积达到可注射大小(在这种情况下为195 mm3；植入后24天)时，将12只荷瘤动物假随机分为2组，每组6 只，以在各组之间获得相似的肿瘤体积。这被定义为第0天。

供试品：在第1、4、7、9、11和13天，通过离心收集在指数期生长的CD19 t-haNK细胞，进行1000cGyγ射线辐照，并在X-VIVO

体重。在注射肿瘤细胞之前和然后每周两次对动物进行称重。

临床观察。每天观察动物的死亡率/发病率(G0至G4)和毒性的临床体征(T1至T12)。对瘫痪或濒死的动物实施安乐死。

终点和安乐死。一旦濒死动物表现出病态即对其实施安乐死，但对存活的动物进行定期安乐死以收集组织。具体地，在末次施用供试品后的6小时，在第13天对半数存活动物(最多3只小鼠/组)实施安乐死。末次给药后48小时，在第15天对其他动物实施安乐死。

尸检以及肿瘤和组织收集。终止后，进行尸检，收集肉眼可见病变的器官，在10％福尔马林中固定，并送至合同病理实验室(Seventh Wave实验室)进行肿瘤/转移性疾病负担的组织学评价。

表1

IR，辐照(1000cGy)；非IR，非辐照；IV，静脉内；SC，皮下；Tx，处理。

数据分析

肿瘤体积计算：肿瘤体积＝长度×宽度2/2(长度和宽度分别是肿瘤的最长和最短直径)；肿瘤生长抑制(TGI)计算：TGI＝(TC-Tt) /ΔTC×100％，其中，TC和Tt分别是研究结束时对照组和处理组的平均肿瘤体积，而ΔTC是对照组的平均肿瘤体积。

统计分析-肿瘤生长曲线：通过双因素ANOVA分析肿瘤生长曲线，然后通过Tukey检验进行多重比较。存活曲线：通过对数-秩和 (Mantel-Cox)检验分析存活曲线。

肝转移估计：通过非配对双尾t检验分析各天肝转移性疾病负担的差异。统计学显著性：P<0.05被认为具有统计学显著性。所有统计分析均使用GraphPad Prism第7版进行。

结果

IV Raji模型：IV肿瘤模型中的主要读数是动物存活率。当发现动物因疾病相关的发病率和/或瘫痪而死亡或被实施安乐死时，计算死亡事件。如图5所示，与溶媒对照组相比，CD19 t-haNK细胞处理能够显著提高动物的存活率，产生中位存活期为27天，而溶媒对照组为21.5天(P<0.0001)。

在整个研究中还监测动物体重变化。如图6所示，首次开始治疗时，经CD19 t-haNK处理的动物表现出中等(少于10％)和短期体重减轻，这在接受IV NK输注的动物中很常见，并且没有对CD19 t-haNK细胞不具有特异性(参考研究：LABC-TX01701)。在处理的第一周后，动物体重恢复，然后由于疾病进展而再次下降。

SC Raji模型：SC肿瘤模型中的主要读数是肿瘤生长。如图7所示，与溶媒对照组相比，在第7天及之后，CD19 t haNK细胞表现出明显且统计学上显著的肿瘤生长抑制，在研究结束时(第13天)TGI 为49％。

此外，由于Raji是侵袭性淋巴瘤模型，即使SC接种，癌细胞也能够扩散并形成多个转移位点，最终导致动物发病和/或死亡。溶媒组在第11天和第13天之间共有3只动物(50％)濒死，因此被实施安乐死。相反，在CD19 t-haNK细胞组中没有非计划死亡事件(表3)。

此外，尸检期间在CD19 t-haNK处理的动物中观察到肝转移的定性降低(图8A)。合同病理实验室(Seventh Wave实验室)对代表性取样的H&E染色肝脏切片进行了疾病负担的半定量估计。如图8B 和表4所示，随着研究的进行，存在明显的疾病负担增加趋势。与溶媒对照相比，CD19 t-haNK处理动物的肝脏显示出明显较低的癌症浸润区百分比。由于对照组的样本量少且非计划死亡率过高，只能对第 13天的数据进行统计分析。该分析显示疾病负担具有显著差异，CD19 t-haNK处理的动物平均浸润率为10％，而对照组为30％。

整个研究过程中均监测体重变化，与IV Raji模型相似，CD19 t-haNK处理的动物在处理方案开始时表现出中等(小于10％)和短暂的体重减轻，可从图9获得。

表2

计划：计划安乐死用于组织收集。

表3

为了评估CD19 t-haNK细胞在重复IV给药方案中的抗肿瘤功效，在这项研究中分别使用IV和SC肿瘤接种的Raji异种移植模型的2 种变体。

在IV肿瘤模型中，与溶媒对照组相比，CD19 t-haNK细胞能够显著改善动物存活期，中位存活期延长5.5天(增加26％)。在SC 肿瘤模型中，CD19 t-haNK细胞能够显著抑制肿瘤生长，在研究结束时产生49％TGI。此外，CD19 t-haNK处理能够减少动物发病/死亡事件的数量(CD19 t-haNK处理的动物为0/6，而对照组为3/6)，并显著降低了SC Raji荷瘤动物肝脏的转移性疾病负担。

从上述数据可以看出，在Raji异种移植模型的两个变体中，与溶媒对照相比，CD19t-haNK细胞显示出显著的治疗性功效。

实验设计：在第0天随机分组后，入选6-8周龄的三十(30)只雄性DBA/2J小鼠(Jackson实验室)。将所有动物饲养在标准环境条件下，并以LabDiet 5053辐照的啮齿动物食物饲养，并随意提供无菌水。到达后，通过耳标识别动物，将其饲养在十(10)个鼠笼中，并在研究开始前适应环境至少三天。适应后，将每只小鼠的注射区剃毛并用无菌EtOH棉签清洁。在第PR0天(随机分组前第0天)，用异氟烷麻醉动物以注射肿瘤细胞。在第PR0天，所有动物皮下(s.c.) 注射2×10

每天对动物进行称重并监测其总体健康状况。随机分组后，每周用数字卡尺测量肿瘤3次(3x/周)。荷瘤>2500mm

结果

从动物存活至福利阈值-初始肿瘤激发：每天监测动物的存活。根据动物健康和福利阈值需要实施安乐死的动物，包括体重下降超过其初始体重的30％，肿瘤超过2500mm

动物福利阈值随时间的累积存活期如图10所示。L1210是生长迅速、具有侵入性的肿瘤细胞系，0％的经溶媒处理的对照动物在肿瘤激发后的二十三(23)天还可以存活。相反，与溶媒处理相比， CD19-CAR-aNK细胞处理可增加存活期。实际上，接受 CD19-CAR-aNK细胞处理的动物中有25％(2/8)在第61天通过肿瘤移植物激发存活直至研究完成。

通过对数-秩和(Mantel-Cox)和Gehan-Breslow Wilcoxon检验评估通过试验处理提供的观察到的存活期增加具有统计显著性。用 mCD19-CAR-aNK细胞处理可以在统计学上显著提高存活期(p＝0.05 (Mantel-Cox)；p＝0.04(Gehan-Breslow-Wilcoxon)。这些结果表明，在该小鼠淋巴细胞白血病的临床前皮下模型中，与溶媒相比，用 CD19-CAR-aNK处理在统计学上显著提高存活期至福利阈值。

完全缓解动物的肿瘤再激发：在第33天，将来自第2组的两(2) 只完全缓解的动物以及五(5)只年龄相匹配的原始动物用第二2×10

在第52天之前，所有符合存活分析要求的原始动物(5只中的5 只)由于肿瘤体积而需要实施安乐死；相反，先前用2M CD19-CAR-aNK(N＝2)细胞处理过的所有完全缓解动物均存活直至研究完成(第62天)。通过对数-秩和(Mantel-Cox)和Gehan-Breslow Wilcoxon检验评估通过试验处理提供的观察到的存活期增加具有统计显著性，但是存活期增加没有统计学差异，这很可能是由于样本量小所致。

在再激发阶段，每周继续测量肿瘤3次(3x/周)。从激发/再激发L1210-Luc细胞施用至0％对照组存活(第52天)，每组的平均肿瘤体积+SEM显如图11所示。

施用后约七天(研究第40天)首次检测到原始动物的肿瘤，并稳定且迅速增加。相反，在再激发阶段的整个过程中(第33-61天)，在再激发至已预先用2M CD19-CAR-aNK细胞处理的完全缓解的动物之前，在任何时候均未检测到肿瘤。

该实例中提供的数据表明，先前用2M CD19-CAR-aNK细胞处理过的完全缓解动物可能已对L1210肿瘤细胞产生了有效的免疫应答。

实验设计

A部分：从Taconic生物科学公司获得四十(40)只5-7周龄的 BALB/c小鼠(雄性20只，雌性20只)供A部分使用。在随机分组 (PR)第0天时，将在100μL无血清培养基中的2.5×10

在第0天、第3天和第5天，根据预先确定的i.t.步骤(参见实验步骤)，将在50μl无血清培养基中的试验细胞或溶媒瘤内(i.t.)注射至小鼠。简单地说，仅向动物施用溶媒或施用5×10

B部分：B部分于第26天开始。来自A部分且无肿瘤的动物以及十二(12)只原始动物(6只雄性和6只雌性)入选B部分。将2.5×10

结果：A部分-动存活期：每天监测动物的总体健康和存活期。根据动物健康和福利阈值需要实施安乐死的动物，包括体重下降超过其初始体重的30％，肿瘤超过1500mm

在第1、3和5天通过瘤内(i.t.)溶媒施用的对照动物中，在15 只动物有0只(0％)存活至第26天完成A部分。对于所有接受处理的动物，动物在第26天的存活期均增加：18只动物中有9只(50％) 被施用5M mCD19-CAR-NK92细胞。通过对数-秩和(Mantel-Cox) 检验比较所有组。与施用溶媒的动物相比，观察到施用5M mCD19-CAR-NK92细胞的动物的存活期具有统计学上显著增加(p＝ <0.0001)。这些结果表明，与溶媒处理相比，所有处理均改善至第 26天的存活期。

B部分-完全缓解动物的肿瘤再激发：将对处理完全缓解的动物 (在第0-26天时程内(A部分)对处理有缓解的荷瘤>40mm

总之，本实例提供的数据表明，与原始小鼠相比，对处理完全缓解的先前处理的小鼠能够排斥作为与处理无关的再激发的A20肿瘤同种异体移植物，并且表明这些动物对肿瘤抗原产生记忆缓解。

以下针对靶向CAR构建体和相关功能数据的实例来自线性化 DNA载体构建体，它们允许转染细胞以将线性化DNA整合到基因组中，从而为特定CAR的非瞬时表达提供了途径。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 HER2 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的HER2-CAR具有SEQID NO:60所示的核酸序列。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的HER2.CAR-t-haNK细胞对BT-474细胞的功能，示例性结果如图14所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的HER2.CAR-t-haNK细胞表现出对BT-474靶细胞具有显著细胞毒性。

在进一步的实验中，本发明人证明了HER2.CAR在 HER2.CAR-t-haNK细胞中的表达，如图40所示。HER2.CAR-t-haNK 细胞的自然细胞毒性如图41所示，而CAR介导的细胞毒性结果如图 42所示。图43的图示出了HER2.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性数据。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 CD30 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD30-CAR具有SEQID NO:61所示的核酸序列。

图50的结果证明了CD30-CAR的表达，而图51示出了重组细胞的自然细胞毒性结果。图52的结果证明了CAR介导的细胞毒性，而图53的数据中示出了ADCC的示例性结果。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 EGFR scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的EGFR-CAR具有SEQID NO:62所示的核酸序列。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的EGFR.CAR-t-haNK细胞对A-549细胞的功能，示例性结果如图17所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的EGFR.CAR-t-haNK细胞表现出对A-549靶细胞具有显著细胞毒性。图35示出了EGFR-CAR 在EGFR.CAR-t-haNK细胞中的表达，而自然细胞毒性结果如图36所示。CAR介导的EGFR.CAR-t-haNK细胞的细胞毒性的示例性结果如图37和图38所示，而EGFR.CAR-t-haNK细胞的ADCC的结果如图 39所示。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 IGF1R scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的IGF1R-CAR具有SEQ ID NO:63所示的核酸序列，并且编码IGF1R-CAR、CD16和 IL-2

与第二代CAR(CD28/CD3z)相比，使用标准细胞毒性测定法尖刺如此构建的IGF1R.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的功能，示例性结果如图22所示。从数据中可以很容易地看出，表达具有 FcεRIγ信号传导结构域的CAR的IGF1R.CAR-t-haNK细胞对 MDA-MB-231靶细胞表现出显著的靶特异性细胞毒性，这与第二代 CAR的细胞毒性相当。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 CD123 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD123-CAR具有SEQ ID NO:64所示的核酸序列。图48示出了表达CD123-CAR的重组NK细胞的CAR介导的细胞毒性数据，图49示出了表达 CD123-CAR的重组NK细胞的ADCC的示例性数据。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 PD-L1 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的PD-L1-CAR具有SEQ ID NO:65所示的核酸序列。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的PD-L1.CAR-t-haNK细胞对SUP-B15.PD-L1

还使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的PD-L1.CAR-t-haNK 细胞对U251细胞的功能，示例性结果与未转染的haNK细胞一起如图17所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR 的PD-L1.CAR-t-haNK细胞表现出对U251靶细胞具有靶标特异性和显著性的细胞毒性，而haNK对照细胞对相同的U251细胞基本上没有细胞毒性。

在对PD-L1的靶细胞特异性的进一步实验中，诸位发明人使用 PD-L1.CAR-t-haNK细胞以及haNK细胞作为一般细胞毒性的对照，检测了几种PD-L1阳性肿瘤细胞系。从图24可以很容易地看出， PD-L1.CAR-t-haNK细胞对多种肿瘤细胞(肺癌、乳腺癌、生殖器肿瘤细胞以及头颈部小细胞癌、脊索瘤)。值得注意的是， PD-L1.CAR-t-haNK细胞杀伤大多数(>85％)细胞所需的时间少于4 小时，而对照haNK细胞则需要12小时以上。

图24进一步说明了与各种其他对照细胞(如所示的haNK细胞) 相比，PD-L1.CAR-t-haNK细胞对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。从数据中可以看出，在5:1的E:T比下，西妥昔单抗改善PD-L1.thaNK 对MDA-MB-231的溶解，并且通过加入西妥昔单抗和a-PD-L1可改善haNK活性。与haNK和haNK+西妥昔单抗相比，普通PD-L1.thank 具有更好的细胞毒性活性，并且普通PD-L1.thank的杀伤与 haNK+PD-L1抗体相当，但PD-L1.thank+西妥昔单抗的表现优于 haNK+西妥昔单抗和haNK+PD-L1。在1:1的E:T比下，使用或未使用西妥昔单抗的PD-L1.thaNK活性相同，并且PD-L1.thaNK明显优于通过hank的内在和ADCC介导的杀伤。通过加入西妥昔单抗和 a-PD-L1改善haNK活性。

在进一步的实验中，诸位发明人证明PD-L1.CAR在 PD-L1.CAR-t-haNK细胞中的表达，如图44所示。PD-L1.CAR-t-haNK 细胞的自然细胞毒性如图45的结果所示，而CAR介导的细胞毒性的结果如图46所示。PD-L1.CAR-t-haNK细胞的ADCC的示例性数据如图47所示。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 HER2 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD33.CAR具有SEQID NO:66所示的核酸序列。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的CD33.CAR-t-haNK细胞对THP-1细胞的功能，示例性结果如图15所示。从数据容易看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的CD33.CAR-t-haNK细胞表现出对THP-1靶细胞具有显著细胞毒性。描述CD33CAR在NK-92 细胞中强表达的进一步数据如图31所示。图32示出了 CD33.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的自然细胞毒性，图33描述了 CAR介导的对THP-1细胞的细胞毒性结果。图34进一步示出了CD33.CAR-t-haNK细胞联合利妥昔单抗对SUP-B15 CD19

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 gp120 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的gp120-CAR具有SEQ ID NO:67所示的核酸序列。

诸位发明人进一步证明，如此产生的细胞表达大量的CD16和 gp120CAR，如图57所示。GP120与gp120CAR的结合如图58所示，相对于非重组aNK细胞作为阴性对照。如此产生的细胞的自然细胞毒性如图59所示，而相应的ADCC数据如图60所示。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 B7-H4 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的B7-H4-CAR具有SEQ ID NO:68所示的核酸序列。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 BCMA scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的BCMA-CAR具有SEQID NO:69所示的核酸序列。

如图54的示例性结果所示，证实了BCMA表达，并且如图55 所示，证明了CAR介导的对靶细胞的细胞毒性。相似地，从图56的结果可以看出，使用利妥昔单抗作为针对靶细胞的抗体，重组细胞具有显著的ADCC。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 GD2 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的GD2-CAR具有 SEQID NO:70所示的核酸序列。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗FAP scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的FAP-CAR具有SEQ IDNO:71所示的核酸序列。FAP-CAR的表达如图61的数据所示，并且 FAP.CAR对靶细胞的细胞毒性在图62的结果中证明。

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 CD20 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CD20-CAR具有SEQID NO:74所示的核酸序列。

CD20 CAR在NK-92细胞中的表达如图29的结果所示。可以很容易地看出，CD20.CAR在绝大多数重组细胞中强表达(如上所述，连同线性化DNA中的CD16)。图30描述了CD20.CARNK细胞对 CD20

在该实例中，诸位发明人构建了具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗 CSPG-4 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜结构域偶联，该CD28 跨膜结构域与FcεRIγ信号传导结构域偶联。如此构建的CSPG-4-CAR 具有SEQ ID NO:75所示的核酸序列。通过FACS分析确认了 CSPG-4-CAR的表达，并且示例性结果如图63所示。因此，构建的细胞也表现出显著的细胞毒性，如图64的示例性数据所示。

在该实例中，诸位发明人使用了如上所述的具有FcεRIγ信号传导结构域的第一代CAR，该FcεRIγ信号传导结构域包括与CD8铰链偶联的抗CD19 scFv，该CD8铰链继而与CD28跨膜域偶联，该CD28 跨膜域与FcεRIγ信号传导偶联，以及将NK-92细胞转染线性化DNA 进行功能检测。

使用标准细胞毒性测定法检测如此构建的CD19.CAR-t-haNK细胞对K562细胞的功能，以确定一般细胞毒性，示例性结果如图19所示。可以容易地看出，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的 CD19.CAR-t-haNK细胞表现出对K562靶细胞具有显著细胞毒性。在另一组实验中，与aNK细胞作为对照相比，使用SUP-B15细胞确定了靶标特异性细胞毒性，示例性结果如图20所示。再次，表达具有 FcεRIγ信号传导结构域的CAR的CD19.CAR-t-haNK细胞表现出显著的靶特异性细胞毒性。在另一组实验中，使用赫赛汀和利妥昔单抗作为抗体，使用SKBr3细胞测定靶标特异性ADCC，结果如图21所示。同样，表达具有FcεRIγ信号传导结构域的CAR的CD19.CAR-t-haNK 细胞表现出显著的抗体和靶标特异性ADCC。值得注意的是，重组 NK细胞的倍增时间与aNK细胞基本相同。

图25示例性地示出了在NK-92细胞中相对于对照，来自线性化 DNA(其包括编码CD16和IL-2

将MDA-MB-231和HCC827用作PD-L1阳性的经验证的异种移植模型，并评价PD-L1t-haNK细胞在不同制剂、给药水平和给药途径(IV和IT)中的功效。

动物：动物类型：NSG小鼠(JAX)，雌性，9-10周龄；MDA-MB-231 模型的动物数量：24只(新鲜细胞)，和HCC827模型的动物数量：24只(新鲜细胞)+6只(冷冻保存的细胞)。肿瘤模型使用以下细胞系：MDA-MB-231(人乳腺腺癌)和HCC827(人肺腺癌)，接种途径为皮下接种至双侧腋下，MDA-MB-231的平均肿瘤负载约为100 mm

处理品：新鲜配制的抗PD-L1 t-haNK，经辐照，其浓度为：5E7 个细胞/mL或2E7个细胞/mL；溶媒对照品是X-VIVO

MDA-MB-231的研究设计在下表4中(该研究在第27天结束，当时A、C和D组中的一些动物的肿瘤总体积>2000mm

表4

HCC827的研究设计在下表5中(该研究在第29天结束，当时将存活的动物重新计划并转移到另一研究中)。

表5

结果：新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞(1E7个细胞/剂量)在 MDA-MB-231和HCC827模型中均导致明显且持久的肿瘤生长抑制

MDA-MB-231：肿瘤停滞：第16天的TGI：84％(峰值)；第 26天的TGI：79％(末次测量)。

HCC827：肿瘤消退：第16天的TGI：120％(峰值)；第29天的TGI：84％(研究结束)。

与X-VIVOTM 10培养基相比，冷冻保存的PD-L1 t-haNK细胞 (4E6个细胞/剂量)在抑制肿瘤生长方面也显示出统计学显著的功效：第26天的TGI：60％(峰值)，第29天的TGI：40％(研究结束)。

新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞(1E7个细胞/剂量)还导致MDA-MB-231模型中转移性疾病负担显著降低，如下表6所示。

表6

溶媒组中肝中可见结节数为：29±9，PD-L1 t-haNK组：0(通过非配对双尾t检验，P＝0.0116)。

根据进行的实验，以1E7个细胞/剂量的水平进行新鲜制备的 PD-L1 t-haNK细胞进IV给药，每周两次，连续4周，在两种检测的皮下异种移植模型中均显示出显著的抗肿瘤功效：该处理导致 MDA-MB-231荷瘤小鼠的肿瘤停滞，第16天的TGI峰值为84％，研究结束的TGI为79％(通过双因素ANOVA，然后通过Tukey检验的多重比较，两个时间点P<0.0001)，以及HCC827模型中的肿瘤消退，第16天的TGI峰值为120％，研究结束时的TGI为84％(P<0.0001)。以4E6个细胞/剂量的给药水平进行冷冻保存的PD-L1 t-haNK细胞IV给药，每周两次，连续4周，在HCC827肿瘤模型中也显示出显著的治疗性功效，达到60％的TGI峰值(P<0.0001)，研究结束时的TGI为40％(P<0.01)。以2.5E6个细胞/剂量/肿瘤的给药水平进行新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞IT给药，每周两次，连续4周，有效抑制了HCC827肿瘤的生长，导致TGI的峰值在第20 天达到70％，研究结束时的TGI为49％(P<0.001)。

观察到接受IV施用新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞(1E7细胞/ 剂量)的动物发生显著的不良反应。与新鲜制备的PD-L1 t-haNK细胞相反，冷冻保存的细胞(以较低的4E6个细胞/剂量水平给药)IV 施用后对动物具有安全性。PD-L1 t-haNK细胞在两种皮下肿瘤模型中显示出显著的功效。冷冻保存的细胞以较低的4E6个细胞/剂量水平给药，在抑制肿瘤生长方面也显示出显著的功效，并被证明对动物具有安全性。

当然，应该认识到，对于本文提供的所有核酸序列，相应编码的蛋白也在本文明确的设想范围内。同样，对于所有氨基酸序列，相应的核酸序列也在本文设想的范围内(使用任何密码子)。

本说明书中引用的所有专利申请、出版物、参考文献和序列登录号均通过援引以其全文并入本文。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应定义为具有以下含义：

所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，并不旨在限制本发明。如本文所用，单数形式“一种(a)”、“一个(a)”和“该(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。

应当理解，本文所述的所有数值(例如，pH、温度、时间、浓度、数量和分子量，包括范围)包括本领域普通技术人员遇到的测量值的正常变化。因此，描述的数值包括+/-0.1％至10％的变化，例如，+/- 0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。应当理解，尽管并不总是明确指出，但是所有数字标记之前都可以有术语“约”。因此，术语约包括+/-0.1％至10％的变化，例如，+/-0.1％、 0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。还应理解，尽管并不总是明确指出，但所述试剂仅是示例性的，其等同物是本领域已知的。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，披露的所有范围包括该范围的端点，并且包括该范围的端点之间的所有值。本文披露的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围均可以容易被认为充分描述，并且可以将同一范围分解为至少相等的一半、三分之二、四分之一、五分之一、十分之几等。作为非限制性实例，可以容易地将本文讨论的每个范围分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，例如“最多”、“至少”等，包括所列举的数值，并且指的是可以随后细分为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等。

还应理解，尽管并不总是明确指出，但所述试剂仅是示例性的，其等同物是本领域已知的。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且该描述包括事件或情况发生的示例以及事件或情况未发生的示例。

术语“包含”旨在表示该组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应表示排除对该组合具有任何实质意义的其他要素。例如，基本上由本文定义的要素组成的组合物将不排除未实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖性特征的其他要素。“由……组成”是指排除多于痕量的其他成分和所列举的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例在本披露内容的范围内。

如本文所用，“免疫疗法”是指单独或组合使用经修饰或未修饰的、自然存在的或经修饰的NK细胞或T细胞的NK-92细胞，无论其是单独使用还是组合使用，并能够在与靶细胞接触时诱导细胞毒性。

如本文所用，“自然杀伤(NK)细胞”是免疫系统的细胞，其在没有特定抗原刺激的情况下杀伤靶细胞，并且根据主要组织相容性复合物(MHC)类别没有限制。靶细胞可以是肿瘤细胞或携带病毒的细胞。NK细胞的特征在于存在CD56和不存在CD3表面标志物。

术语“内源性NK细胞”用于指源自供体(或患者)的NK细胞，与NK-92细胞系不同。内源性NK细胞通常是其中NK细胞已被富集的异质细胞群。内源性NK细胞可用于患者的自体或异体治疗。

术语“NK-92”是指源自Gong等人(1994)所述的高度有效的独特细胞系的自然杀伤细胞，其权利归南特圭斯特公司所有(下文为“NK-92

术语“aNK”是指源自Gong等人(1994)所述的高度有效的独特细胞系的未经修饰的自然杀伤细胞，其权利归南特圭斯特公司所有 (下文为“aNK

“修饰的NK-92细胞”是指表达外源基因或蛋白，诸如Fc受体、 CAR、细胞因子(诸如IL-2或IL-12)和/或自杀基因的NK-92细胞。在一些实施例中，修饰的NK-92细胞包含编码转基因的载体，诸如 Fc受体、CAR、细胞因子(诸如IL-2或IL-12)和/或自杀基因。在一实施例中，修饰的NK-92细胞表达至少一种转基因蛋白。

如本文所用，“未辐照的NK-92细胞”是尚未进行辐照的NK-92 细胞。辐照使细胞不能生长和增殖。可以预想，NK-92细胞将在治疗设备或患者治疗之前的其他时间点进行辐照，因为辐照和输注之间的时间应不超过四个小时，以保持最佳活性。替代性地，可以通过另一机制防止NK-92细胞增殖。

如本文所用，NK-92细胞的“失活”使它们不能生长。失活还可能与NK-92细胞的死亡有关。可以预想，NK-92细胞在治疗性应用中已有效清除与病理学有关的细胞的离体样本后，或在哺乳动物体内停留了足够长的时间以有效杀伤体内的许多或所有靶细胞，可能失活。作为非限制性实例，可以通过施用NK-92细胞对其敏感的失活剂来诱导灭活。

如本文所用，术语“细胞毒性的”和“细胞溶解的”当用于描述效应细胞(诸如NK-92细胞)的活性时，旨在同义。通常，细胞毒性活性涉及通过多种生物学、生化或生物物理机制中的任一种杀伤靶细胞。细胞溶解更具体地是指效应子溶解靶细胞的质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致杀伤靶细胞。不希望受理论的约束，认为NK-92 细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。

关于细胞/细胞群的术语“杀伤”旨在包括将导致该细胞/细胞群死亡的任何类型的操作。

术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如，自然杀伤细胞)的表面发现的蛋白，其通过与称为Fc区的抗体的一部分结合而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。FcR根据其识别的抗体类型进行分类。例如，Fc-γ受体(FCγR)与IgG类抗体结合。FCγRIII-A(也称为CD16；SEQ ID NO:20)是与IgG抗体结合并活化ADCC的低亲和力Fc受体。FCγRIII-A通常在NK细胞上发现。NK-92细胞不表达 FCγRIII-A。Fc-ε受体(FcεR)与IgE抗体的Fc区结合。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对目的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。基于scFv结构域的特异性，将表达CAR的NK-92细胞靶向在细胞表面上表达某些抗原的细胞。可以对scFv结构域进行工程改造以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原和病毒特异性抗原。例如，CD19CAR识别CD19，CD19是某些癌症表达的细胞表面标志物。

如本文所用，术语“肿瘤特异性抗原”是指存在于癌细胞或赘生性细胞上但不能在与癌细胞相同的组织或谱系衍生的正常细胞上检测到的抗原。如本文所用，肿瘤特异性抗原还指与肿瘤相关的抗原，即与源自与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。

如本文所用，术语“病毒特异性抗原”是指存在于病毒感染的细胞上但不能在与该病毒感染的细胞相同的组织或谱系衍生的正常细胞上检测到的抗原。在一个实施例中，病毒特异性抗原是在被感染细胞表面上表达的病毒蛋白。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后进行核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施例既包括双链形式，也包括已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。

多核苷酸由四个核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；当多核苷酸为RNA时，胸腺嘧啶为尿嘧啶(U)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可以通过比较每个序列中的位置来确定，该位置可以为了比较的目的而被比对。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的同源性程度是序列共享的匹配或同源位置数目的函数。

如本文所用，“同一性百分比”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列同一性。可以通过比较每个序列中的位置来确定同一性百分比，该位置可以出于比较的目的进行比对。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置具有同一性。同源核苷酸序列包括编码本文所述核苷酸序列的自然等位基因变体和突变的序列。同源核苷酸序列包括编码除人以外的哺乳动物物种的蛋白的核苷酸序列。同源氨基酸序列包括含有保守氨基酸置换以及多肽具有相同结合和/或活性的氨基酸序列。在一些实施例中，同源氨基酸序列具有不超过15个、不超过10个、不超过5个或不超过3个保守氨基酸置换。在一些实施例中，核苷酸或氨基酸序列与本文描述的序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少80％或至少85％或更大的同一性。在一些实施例中，核苷酸或氨基酸序列与本文描述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。可以通过使用默认设置的Gap程序(威斯康星序列分析包 (Wisconsin Sequence AnalysisPackage)，用于UNIX的第8版，基因计算机集团，大学研究园，麦迪逊分校)来确定百分比同一性，该默认设置使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.[高等应用数学],1981,2,482-489)。适用于确定序列同一性百分比的算法包括 BLAST和BLAST 2.0算法，这两种算法分别如Altschul等人(Nuc. Acids Res.[核酸研究]25:3389-402,1977)，和Altschul等人(J.Mol. Biol.[分子生物学杂志]215:403-10,1990)所述。可通过国家生物技术信息中心公开获得进行BLAST分析的软件(参见ncbi.nlm.nih.gov网址)。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN 程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列， BLASTP程序默认使用字长为3，和期望值(E)为10，以及BLOSUM62 评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学学院学报]89:10915,1989)比对(B)为50，期望值(E)为10， M＝5，N＝-4。

在一些实施例中，为在特定物种中表达而对核酸序列进行密码子优化，例如，可以为在人中表达而对小鼠序列进行密码子优化(由密码子优化的核酸序列编码的蛋白的表达)。因此，在一些实施例中，密码子优化的核酸序列与本文所述的核酸序列具有至少60％、至少 65％、至少70％、至少80％或至少85％或更大的同一性。在一些实施例中，密码子优化的核酸序列酸序列与本文所述序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

术语“表达”是指基因产物(例如，蛋白)的产生。当涉及表达时，术语“瞬时”是指多核苷酸未掺入细胞的基因组中。术语“稳定”在表示表达时是指将多核苷酸掺入细胞的基因组中，或使用阳性选择标志物(即由细胞表达的在某些生长条件下具有益处的外源基因)来维持表达转基因。

术语“细胞因子(cytokine或cytokines)”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在优选的实施例中，细胞因子是IL-2。

如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当置于允许的细胞内时，例如通过转化过程，可以复制载体。载体可以在一种细胞类型(诸如细菌)中复制，但是在另一种细胞(诸如哺乳动物细胞)中复制的能力有限或没有。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；与阳离子脂质复合的DNA，单独或与阳离子聚合物组合；阴离子和阳离子脂质体； DNA-蛋白质复合物和颗粒，包含与阳离子聚合物缩合的DNA，诸如异质聚赖氨酸、定义长度的寡肽和聚乙烯亚胺，在某些情况下包含在脂质体中；以及包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物的用途。在一个实施例中，该载体是病毒载体，例如，腺病毒。病毒载体是本领域熟知的。

如本文所用，术语“靶向的”在涉及蛋白表达时旨在包括但不限于将蛋白或多肽引导至细胞内或其外部的适当目的地。通常通过信号肽或靶向肽来实现靶向，该信号肽或靶向肽是多肽链中的氨基酸残基的一段。这些信号肽可以位于多肽序列内的任何位置，但通常位于N 端。多肽也可以经工程改造为在C端具有信号肽。信号肽可以指导多肽进行细胞外切割，定位到质膜、高尔基体、内体、内质网和其他细胞区室。例如，在其C端具有特定氨基酸序列的多肽(例如，KDEL) 被滞留在ER管腔中或转运回ER管腔。

如本文所用，术语“靶向”在指肿瘤的靶时是指NK-92细胞识别和杀伤肿瘤细胞(即靶细胞)的能力。在本文中，术语“靶向的”是指例如由NK-92细胞表达的CAR识别并结合由肿瘤表达的细胞表面抗原的能力。

如本文所用，术语“转染”是指核酸插入细胞中。可以使用允许核酸进入细胞的任何方式进行转染。DNA和/或mRNA可以被转染进入细胞中。优选地，转染的细胞表达由核酸编码的基因产物(即蛋白)。

术语“自杀基因”是指允许阴性选择表达该转基因的细胞的转基因。自杀基因被用作安全系统，允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而被杀伤。已识别多种自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶 (TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(Escherichia coli)gpt基因和大肠杆菌(E. coli)Deo基因(另见，例如，Yazawa K,Fisher W E,Brunicardi F C: Current progress in suicidegene therapy for cancer.[自杀基因治疗癌症的最新进展]World J.Surg.[世界手术杂志]2002年7月；26(7):783-9)。在一个实施例中，该自杀基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如，tk30、tk75、sr39tk)。表达TK蛋白的细胞可以使用更昔洛韦杀伤。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞携带膜结合重组嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体在转染的重组质粒上编码并且包含呈单条多肽链的：

细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域；并且

其中，该NK细胞是NK-92细胞。

2.删除

3.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含scFv。

4.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。

5.如权利要求4所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD19、CD20、GD2、HER-2、CD30、EGFR、FAP、CD33、CD123、PD-L1、IGF1R、CSPG4或B7-H4。

6.如权利要求1或3中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与病毒特异性抗原特异性结合。

7.如权利要求6所述的基因修饰的NK细胞，其中，该病毒特异性抗原是HIV病毒、HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV病毒的抗原。

8.如权利要求6所述的基因修饰的NK细胞，其中，该病毒特异性抗原是HIV病毒的gp120。

9.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域和/或该跨膜结构域包含CD8铰链结构域和/或CD28跨膜结构域。

10.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

11.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞进一步携带膜结合重组CD16。

12.如前述权利要求中任一项所述的基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞进一步包含具有内质滞留序列的重组细胞因子。

13.一种基因修饰的NK细胞，该基因修饰的NK细胞包含：

编码嵌合抗原受体(CAR)的重组核酸，其中，该重组核酸是转染的质粒；

其中，该NK细胞是NK-92细胞；

其中，该CAR包含呈单条多肽链的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。

14.删除

15.如权利要求13所述的基因修饰的NK细胞，其中，该重组核酸是RNA。

16.如权利要求15所述的基因修饰的NK细胞，其中，该RNA是多顺反子RNA，其进一步编码CD16和/或具有内质滞留序列的细胞因子。

17.如权利要求13-16中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域包含scFv。

18.如权利要求13-17中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、或患者特异性抗原及肿瘤特异性抗原特异性结合。

19.如权利要求18所述的基因修饰的NK细胞，其中，该肿瘤特异性抗原是CD19、CD20、GD2、HER-2、CD30、EGFR、FAP、CD33、CD123、PD-L1、IGF1R、CSPG4或B7-H4。

20.如权利要求13-17中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该细胞外结合结构域与病毒特异性抗原特异性结合。

21.如权利要求20所述的基因修饰的NK细胞，其中，该病毒特异性抗原是HIV病毒、HPV病毒、RSV病毒、流感病毒、埃博拉病毒或HCV病毒的抗原。

22.如权利要求20所述的基因修饰的NK细胞，其中，该病毒特异性抗原是HIV病毒的gp120。

23.如权利要求13-22中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该铰链结构域和/或该跨膜结构域包含CD8铰链结构域和/或CD28跨膜结构域。

24.如权利要求13-23中任一项所述的基因修饰的NK细胞，其中，该FcεRIγ信号传导结构域具有SEQ ID NO:2所示的核酸序列。

25.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如权利要求1-24所述的基因修饰的NK细胞中的任一种，从而治疗该癌症。

26.如权利要求25所述的方法，该方法进一步包括施用至少一种另外的治疗实体的步骤，该另外的治疗实体选自由以下组成的组：病毒癌症疫苗、细菌癌症疫苗、酵母癌症疫苗、N-803、抗体、干细胞移植物和肿瘤靶向细胞因子。

27.如权利要求25或26所述的方法，其中，该癌症选自白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、实体瘤，所述实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管腔内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮癌、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

28.一种治疗有需要的患者的病毒感染的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如权利要求1、6、7、8、13、20、21或22所述的基因修饰的NK细胞中的任一种，从而治疗该病毒感染。

29.如权利要求28所述的方法，该方法进一步包括施用抗病毒药物的步骤。

30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中，向该患者施用约1x 10

31.如权利要求13-24中任一项所述的基因修饰的NK细胞在治疗癌症或病毒感染中的用途。