一种生产高聚合度多聚磷酸盐的方法

摘要

本发明公开了一种生产高聚合度多聚磷酸盐的方法，利用15L发酵罐高密度发酵制备活性菌剂，并结合生物反应器利用活性菌剂实现胞内合成高聚合度多聚磷酸盐，制备得到的多聚磷酸盐聚合度为15‑130。本发明提供的方法中对微生物胞内不同聚合度的多聚磷酸盐进行分离纯化，可得到不同链长的多聚磷酸盐，应用于医疗、日化、食品等领域。与现有制备方法相比，本发明利用生物法制备的多聚磷酸盐聚合度高，可满足不同链长多聚磷酸盐的科研与市场需求，生产方法绿色环保。本发明是国内首次开创工业化中试规模生物制备与分离纯化不同聚合度多聚磷酸盐的先进技术，对于基础科研与市场开发意义重大。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产高聚合度多聚磷酸盐的方法，属于高聚合度多聚磷酸盐生产技术领域。

背景技术

多聚磷酸盐(polyphosphates，polyP

polyP

目前polyP

polyP

尽管多聚磷酸盐生物学功能的多样性已引起了广泛关注，但是经济、环保、高效制备polyP

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种生产高聚合度多聚磷酸盐的方法，得到不同链长的多聚磷酸盐，开发不同链长标准品，应用于医疗、日化、食品等领域，实现相关功能性产品开发并填补国内市场空白。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种生产多聚磷酸盐的方法，包括以下步骤：

(1)活化转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)；

(2)将活化后的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌转入发酵罐进行高密度发酵，将得到的发酵液离心，取菌泥沉淀，得到活性菌剂；

(3)将含磷培养基注入序批式生物反应器中，并投入活性菌剂使起始OD600为0.2-0.3；

(4)15-30℃室温条件下启动序批式生物反应器，培养16-19h后获得含多聚磷酸盐的菌液；

步骤(2)所述高密度发酵的条件为：罐体装液量为70-80％，30-37℃好氧培养10-16h，所用培养基的配方为：酵母浸膏0.5-3％，蛋白胨0.5-3％，氯化钠0.5-2％，无机盐离子，pH调节至中性。

进一步地，步骤(4)所述序批式生物反应器分三步操作：a.进水、预培养4-6h；b.连续进水、连续抽滤12-13h；c.菌体浓缩、菌体排放1-2h，曝气量为0.5-1L/min。

进一步地，步骤(1)中所述转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌是以弗氏柠檬酸杆菌ATCC8090为宿主，并导入了宿主自身的多聚磷酸盐激酶编码基因Ppk1；所述弗氏柠檬酸杆菌的基因组DNA中只有Ppk1一种多聚磷酸盐激酶编码基因，且所述多聚磷酸盐激酶编码基因Ppk1在基因组上与外切聚磷酸酶编码基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录。

进一步地，步骤(1)具体是：LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h；按1％接种量接种至500mL LB液体培养基，30-37℃，180-220rpm培养10-12h。

进一步地，步骤(3)中所述含磷培养基每升含：葡萄糖0.1-0.5g，蛋白胨0.05-0.3g，酵母粉0.01-0.1g，无水乙酸钠0.05-0.3g，氯化钠0.01-0.3g，七水合硫酸镁0.1-0.5g，三水合磷酸氢二钾0.45-0.75g，氯化铵0.05-0.5g，含磷量为6-10mg/L。

进一步地，所述方法还包括分离不同链长的多聚磷酸盐，包括以下步骤：

(5)含多聚磷酸盐的菌液离心并将菌泥-20℃冷冻，解冻后在70-100℃水浴加热10-30min，冷却至室温，10000g离心5min，取上清并测量体积，得V1；

(6)加入0.05V1体积的盐酸溶液，混合均匀并10000g离心20min，收集上清并用氢氧化钠溶液调节至中性，加入氯化钠使得混合液中氯化钠终浓度为100mM；

(7)分离中链多聚磷酸盐：上述溶液中加入96％乙醇并混合均匀，静置孵育1h后，10000g离心5min，沉淀为中链多聚磷酸盐；

(8)分离短链多聚磷酸盐：将步骤(7)离心后得到的上清收集，加入无水乙醇，充分悬浮；将溶液静置1h后10000g离心10min，沉淀为短链多聚磷酸盐；

(9)分离长链多聚磷酸盐：将步骤(8)中离心后得到的上清收集，加入超纯水使得乙醇体积分数为70％，将溶液静置1h后10000g离心10min，沉淀为长链多聚磷酸盐；50％乙醇轻柔洗涤，去除沉淀中的盐残余；产品放置在干燥器上，干燥一周；

所述短链表示聚合度小于15，中链表示聚合度为15-60，长链表示聚合度为60-130。

本发明还提供了上述方法在医疗、日化、食品领域中的用途，所述用途不以疾病的诊断或治疗为目的。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明提供了一种中试生产高聚合度polyP

(2)本发明提供了一种不同链长polyP

附图说明

图1：制备不同链长polyP

图2：序批式膜生物反应器示意图。

图3：弗氏柠檬酸杆菌胞内polyP

图4：15L发酵罐中菌体OD

图5：弗氏柠檬酸杆菌胞内polyP

图6：15％TBE-Urea尿素胶检测分离纯化的polyP

具体实施方式

本发明中提及的“室温”指代的是15-30℃。

本发明中提及的弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090是商业化菌株，可通过购买获得。

以下实施例仅用于对本发明进行具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例。

实施例1

有机碳氮源培养基的选择过程，包括以下步骤：

(1)将含50mg/L Kan的LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌(公开于专利CN 104531599 A中)，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养12h。按1％接种量分别接种至四种有机碳氮源培养基(如表1所示)，在30℃，200rpm相同条件下培养12h，离心收菌；

表1有机碳氮源培养基配方

(2)将上述活性菌剂分别转入装有100mL含磷培养基中，初始磷含量为20mg/L，无需加抗生素，此时起始OD600约为0.2；

(3)30℃培养14h，消耗培养基中磷含量为表1所示，酵母浸膏培养基的菌泥消耗磷最多，胞内生成polyP

实施例2

制备不同链长polyP

(1)含50mg/L Kan的LB平板活化-80℃保存的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌，挑取单克隆接种至50mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养12h。按1％接种量接种至500mL LB液体培养基，30℃，200rpm培养12h；

(2)将上述菌种转入15L种子罐中，罐体装液量为70-80％，选取酵母浸膏0.5-3％(v/v)，蛋白胨0.5-3％(v/v)，氯化钠0.5-2％(v/v)，无机盐离子的有机碳氮源培养基对转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌进行发酵罐高密度发酵，30℃发酵12h，如图4所示，罐中菌体OD600可达120，下罐收集发酵液，6000g离心15min即可获得4Kg活性菌剂；

(3)将含磷培养基注入85L序批式生物反应器中(如图2所示)，并投入适量上述发酵活性菌剂使得起始OD600＝0.2-0.3；

(4)室温条件下启动序批式生物反应器，a.进水和预培养(时长4-6h)；b.连续进水和连续抽滤(时长12-13h)；c.菌体浓缩和富含polyP

(5)经上述获得的含polyP

(6)加入0.05V1体积的盐酸溶液(2.5M)，混合均匀并10000g离心20min，收集上清并用氢氧化钠溶液(2.5M)调节至中性，加入氯化钠使得混合液中氯化钠终浓度为100mM；

(7)分离中链多聚磷酸盐：步骤(6)溶液中加入适量96％乙醇(v/v)并混合均匀，静置孵育1h后，10000g离心5min，沉淀为中链多聚磷酸盐；

(8)分离短链多聚磷酸盐：将步骤(7)中得到的上清收集，加入适量无水乙醇，充分悬浮；将溶液静置1h后10000g离心10min，沉淀为短链多聚磷酸盐；

(9)分离长链多聚磷酸盐：将步骤(8)中得到的上清收集，加入适量超纯水使得乙醇体积分数为70％(v/v)，将溶液静置1h后10000g离心10min，沉淀为长链多聚磷酸盐；50％乙醇(v/v)轻柔的洗涤，去除沉淀中的盐残余。产品放置在干燥器上(装满干的二氧化硅的装置)，干燥一周。

用15％TBE-Urea尿素胶检测实施例2中分离纯化的polyP

应用例1

经由上述实施例1和实施例2获得的短链(n<15)及中链polyP

应用例2

经由上述实施例1和实施例2获得的中链(n＝15-60)及长链polyP

应用例3

经由上述实施例1和实施例2获得的中链(n＝15-60)及长链polyP

应用例4

经由上述实施例1和实施例2获得的短链polyP

应用例5

经由上述实施例1和实施例2获得的中链(n＝15-60)及长链polyP

本发明首次对生物体中主要的无机多聚阴离子—多聚磷酸盐(polyP

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。