一种基于心肌细胞兴奋收缩偶联信号检测苦味物质的方法

摘要

本发明公开了一种基于心肌细胞兴奋收缩偶联的苦味物质检测方法。该方法在心肌细胞机电信号检测分析系统上实现，所述心肌细胞机电信号检测系统包括：计算机，细胞电位和阻抗双功能细胞传感器，细胞培养腔和信号检测与调理模块。本发明通过同时检测心肌细胞胞外电信号和机械搏动信号，提取并分析相关信号特征参数，实现了不同苦味物质的快速检测和识别。本发明相较于现有的苦味物质检测方法，具有灵敏度高、通量高、操作步骤简单、成本低等特点，尤其具有检测时间快的优点。除了配置标准品溶液和接种细胞等简单步骤外，无需进行细胞味觉受体转染等步骤。根据以上优点，本发明的系统和方法可以用于苦味物质快速检测和识别。

说明书

技术领域

本发明涉及一种苦味化合物检测方法，尤其涉及一种基于心肌细胞兴奋收缩偶联信号的苦味物质检测方法。

背景技术

味觉感知，是哺乳动物的基本感官之一。目前的研究表明，酸、甜、苦、咸和鲜味被认为是最基本的味觉感受。在五种味觉感知中，苦味感知可以用于识别外界环境中的有毒物质，这对于哺乳动物的生存至关重要。近年来，人们提出了“电子舌”系统用于模拟哺乳动物的生物味觉感知系统。然而，这些人工味觉系统通常基于物理或化学传感器，其在灵敏度和特异性上远低于生物味觉系统。为了进一步弥补人工电子舌系统与生物味觉系统之间的差异，人们提出了基于生物敏感材料和生物传感器的“生物电子舌”系统，如利用舌上皮层、味蕾细胞或转染有味觉受体的细胞系等作为味觉敏感元件，通过细胞电阻抗等二级换能器，将味觉刺激转化为可测量的电信号等。然而，现有的基于细胞电阻抗等检测苦味物质的方法存在响应时间长等问题，因此需要一种能够快速检测并识别苦味物质的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于心肌细胞兴奋收缩偶联信号检测苦味物质的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明公开了一种基于心肌细胞兴奋收缩偶联的苦味物质检测方法，该方法在心肌细胞机电信号检测分析系统上实现，所述心肌细胞机电信号分析检测系统包括：计算机，细胞电位和阻抗双功能细胞传感器，细胞培养腔和信号检测与调理模块；其中，细胞培养腔固定在细胞电位和阻抗双功能细胞传感器上，细胞电位和阻抗双功能细胞传感器通过信号检测与调理模块和计算机连接；该方法包括以下步骤：

(1)心肌细胞培养：获取心肌细胞，提纯后制成心肌细胞悬液；经过计数后，配置成200,000-250,000个/ml的细胞悬液；然后在细胞培养腔中加入150-200ul细胞悬液，使每个细胞培养腔的培养孔中细胞数量为30,000-50,000个/孔，培养使得心肌细胞贴附于细胞电位和阻抗双功能细胞传感器表面，构建心肌细胞传感器；

(2)配置苦味化合物标准样品溶液：用二甲基亚砜溶解不同种类的苦味化合物，配制成设定浓度的标准样品溶液储存液；用高糖培养基稀释储存液，配制成不同浓度、不同种类的样品溶液；

(3)心肌细胞机电信号检测和苦味刺激：心肌细胞培养4-6天成熟后，将细胞电位和阻抗双功能细胞传感器与信号检测与调理模块连接，并连接到计算机进行信号记录；

(4)心肌细胞机电信号处理和特征参数提取：从计算机导出记录到的心肌细胞机电信号，计算信号特征参数；

(5)不同苦味化合物刺激后的心肌细胞机电信号分析：重复步骤(3)，记录心肌细胞在不同苦味化合物和不同浓度作用下的胞外场电位EFP信号和机械搏动MB信号；通过步骤(4)得到不同苦味化合物和不同浓度作用前后的信号特征参数；

将苦味刺激前的信号特征参数作为对照组，将同一组实验中苦味刺激后所得到的相同信号特征参数，采用归一化处理，即以对照组的信号特征参数作为基准，进行归一化计算，得到归一化处理后的不同种类和不同浓度苦味化合物作用下的信号特征参数；

(6)对步骤(5)得到的信号特征参数进行标记并构建数据集，使用机器学习算法进行训练学习，构建苦味化合物检测模型；对于待检测的苦味化合物，根据步骤(3)至(5)得到归一化处理后的信号特征参数，输入苦味化合物检测模型，即可对待检测的苦味化合物进行分类和浓度检测。

作为本发明的优选方案，所述步骤(3)中的信号记录包括以下子步骤：

(3.1)记录心肌细胞机电信号，持续N分钟，作为对照，所述的机电信号包括胞外场电位EFP信号和机械搏动MB信号；

(3.2)将步骤(2)稀释后的苦味化合物样品溶液在水浴加热至37摄氏度；

(3.3)取步骤(3.2)预热后的苦味化合物样品溶液加入细胞培养腔中，吹打混匀；

(3.4)静置，记录心肌细胞的机电信号，持续N分钟。

作为本发明的优选方案，所述步骤(4)具体为：

(4.1)使用巴特沃兹低通滤波器对心肌细胞机电信号进行滤波，去除高频噪声；

(4.2)检测心肌细胞胞外场电位EFP信号的波谷点E2，并根据波谷点E2位置往前和往后寻找波峰点E1和二次波峰点E3；提取并记录心肌细胞外场电位EFP信号的波谷点E2、波峰点E1、二次波峰点E3的位置和大小；

(4.3)检测心肌细胞机械搏动MB信号的波谷点M1，并根据波谷点M1位置往后寻找波峰点M2；提取并记录心肌细胞机械搏动MB信号的波谷点M1、波峰点M2的位置和大小；

(4.4)计算信号特征参数，所述的信号特征参数包括发放频率FR、EFP幅值、EFP信号间隔、MB幅值、MB信号间隔、E1-E2间隔、E1-E3间隔、E1-M1间隔、E1-M2间隔、E2-E3间隔、E2-M1间隔、E2-M2间隔、E3-M1间隔、E3-M2间隔、M1-M2间隔。

作为本发明的优选方案，所述的苦味物质为苯甲地那铵、地芬尼多、奎宁、熊果苷。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种基于心肌细胞兴奋收缩偶联的苦味物质检测方法，通过同时检测心肌细胞胞外电信号和机械搏动信号，提取和分析相关信号特征参数，能够实现苦味物质的快速检测和识别。本发明相较于现有的苦味物质检测方法，具有灵敏度高、通量高、操作步骤简单、成本低等特点，尤其具有检测时间快的优点。除了配置标准品溶液和接种细胞等简单步骤外，无需进行细胞味觉受体转染等步骤。根据以上优点，本发明的系统和方法可以用于苦味物质快速检测和识别。

附图说明

图1是本发明方法所使用的检测流程示意图；

图2是心肌细胞机电信号特征参数示意图；

图3是四种不同苦味化合物苯甲地那铵(Dena)、地芬尼多(Diph)、奎宁(Quinine)和熊果苷(Arbutin)刺激前后心肌细胞的典型机电信号图；

图4是归一化处理后的不同苦味化合物的心肌细胞的特征参数可视化分析图；

图5是心肌细胞机电信号的模式识别算法处理结果。

具体实施方式

以下结合附图及具体实例对本发明作详细描述，但并不限制本发明。

实施例1

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

本发明提出一种基于心肌细胞兴奋收缩偶联检测苦味物质的方法，该方法在心肌细胞机电信号检测分析系统上实现，所述心肌细胞机电信号分析检测系统包括：计算机，细胞电位和阻抗双功能细胞传感器，细胞培养腔和信号检测与调理模块；其中，细胞培养腔固定在细胞电位和阻抗双功能细胞传感器上，细胞电位和阻抗双功能细胞传感器通过信号检测与调理模块和计算机连接；该方法包括以下步骤：

(1)心肌细胞培养：从刚出生1-2天的SD大鼠心脏中取其心尖部位，然后将心肌组织置于预冷的高糖培养基DMEM中进行漂洗；之后将心尖组织转移至装有平衡盐溶液HBSS的5ml玻璃瓶中，并剪碎成1mm

(2)配置待测苦味化合物标准样品溶液：用二甲基亚砜(DMSO)溶解四种不同种类的待检测苦味化合物：苯甲地那铵(Denatonium Benzoate，Dena)，地芬尼多(Difenidol，Diph)，奎宁(Quinine)，熊果苷(Arbutin)，并配制成10mM标准样品溶液储存液；用高糖培养基稀释储存液，配制成不同浓度的待测样品溶液；

(3)心肌细胞机电信号检测和苦味刺激：心肌细胞培养4-6天成熟后，将细胞电位和阻抗双功能细胞传感器与信号检测与调理模块连接，并连接到计算机进行信号记录；信号记录包括以下子步骤：

(3.1)记录心肌细胞机电信号，持续15分钟，作为对照，所述的机电信号包括胞外场电位EFP信号和机械搏动MB信号；

(3.2)将步骤(2)稀释后的待测苦味化合物样品溶液在水浴锅中加热至37摄氏度；

(3.3)取10ul步骤(3.2)预热后的待测苦味化合物样品溶液加入细胞培养腔中，并轻轻吹打混匀；

(3.4)静置2分钟后记录心肌细胞的机电信号，持续15分钟；

(4)心肌细胞机电信号处理和特征参数提取：从计算机导出记录到的心肌细胞机电信号，使用以下步骤处理心肌细胞机电信号：

(4.1)使用巴特沃兹低通滤波器对心肌细胞机电信号进行滤波，去除1K Hz以上的高频噪声；

(4.2)使用自动阈值法检测心肌细胞胞外场电位EFP信号的波谷点(E2)，自动阈值取值如下公式所示：

threshold＝mean-3*std；

其中，x

根据计算出的阈值，找到小于此阈值的值记为疑似波谷点；再根据疑似波谷点的位置，进行波谷检验，将前后相邻0.3s记录时间内的所有疑似波谷点大小进行比较，取最小的点位记为实际波谷点，以排除掉其他疑似波谷点的干扰；并将此短信号的所有波谷点位置找出并记录其大小和位置；之后再根据每个波谷点位置往前0.1-0.2s和往后0.2-0.3s寻找当下波形的波峰点E1和二次波峰点E3，并记录下所有波峰点E1、二次波峰点E3的位置和大小；

本发明的波谷点E2定义为一个场电位EFP信号周期内的最小值；波峰点E1的定义为一个场电位EFP信号周期内波谷点E2之前的最大值，二次波峰点E3的定义为一个场电位EFP信号周期内波谷点E2之后的最大值；E1，E2和E3的定义如图2所示；

(4.3)使用同步骤(4.2)中相同的自动阈值法检测心肌细胞机械搏动MB信号的波谷点M1，并根据波谷点位置往后0.2-0.4s寻找搏动信号波形的波峰点M2，提取并记录心肌细胞搏动MB信号的波谷M1、波峰点M2的大小和位置；本发明的波谷点M1定义为一个机械搏动MB信号周期内的最小值，波峰点M2定义为一个机械搏动MB信号周期内波谷点M1之后的最大值；M1和M2的定义如图2所示；

(4.4)根据提取到的心肌细胞胞外场电信号波峰点E1、波谷点E2、二次波峰点E3和机械搏动MB信号的波谷点M1、波峰点M2信息，计算得到发放频率FR、EFP幅值、EFP信号间隔、MB幅值、MB信号间隔、E1-E2间隔、E1-E3间隔、E1-M1间隔、E1-M2间隔、E2-E3间隔、E2-M1间隔、E2-M2间隔、E3-M1间隔、E3-M2间隔、M1-M2间隔等信号特征参数；并取相同条件下多段信号参数的平均值进行统一分析；其中发放频率FR为一段时间内心肌细胞机电信号发生的次数；EFP幅值和MB幅值分别为一个胞外场电位EFP信号周期和机械搏动MB信号周期内最大值与最小值之差的绝对值；EFP信号间隔为前后两个胞外场电位EFP信号波谷点E2的时间差；MB信号间隔差为前后两个机械搏动MB信号波谷点M1的时间差；其余参数为相应特征点之间的时间差。

(5)不同苦味化合物刺激后的心肌细胞机电信号分析：在心肌细胞传感器的不同孔重复步骤(3)，记录心肌细胞在四种不同苦味化合物(苯甲地那铵，地芬尼多，奎宁，熊果苷)作用下的胞外电信号和机械搏动信号；通过步骤(4)得到不同苦味化合物作用前后的信号特征参数；并将苦味刺激前的信号作为对照组，将同一组实验中苦味刺激后所得到的相同信号特征参数，采用归一化处理，即以加药前对照组的状态参数作为基准，进行归一化计算；

如图3所示，为4种不同苦味物质：苯甲地那铵(Dena)、地芬尼多(Diph)、奎宁(Quinine)和熊果苷(Arbutin)刺激后的典型心肌细胞胞外场电位EFP信号和机械搏动MB信号图；使用雷达图和热图对归一化处理后的不同苦味化合物特征参数进行可视化处理，可直观反映不同苦味化合物对于特定参数的影响，如图4A-B所示。

(6)使用PCA和LDA等机器学习算法对步骤(5)得到的不同苦味化合物归一化信号特征参数进行训练学习，用于构建苦味化合物检测模型，用于苦味化合物的检测和分类。

在本发明的一个具体实施例中，所述步骤(6)具体包含以下步骤：

(6.1)对步骤(5)提取到的不同种类苦味化合物作用下的信号特征参数进行标记，包括苦味化合物种类和浓度，构建带有标签的信号特征参数数据集；

(6.2)将步骤(6.1)得到的数据集随机划分为70％和30％两部分，其中70％部分的数据集为训练集，30％部分的数据集为测试集；

(6.3)使用机器学习算法对步骤(6.2)中的训练集进行训练学习，构建苦味化合物检测模型；

(6.4)使用步骤(6.3)所得的检测模型对步骤(6.2)中的测试集进行测试，并计算准确率；

(6.5)根据步骤(6.4)所得准确率调整模型参数，重复步骤(6.2)至(6.4)，直至准确率超过90％，得到最后的苦味化合物检测模型；

(6.6)对于待检测的苦味化合物，根据步骤(3)至(5)得到归一化处理后的特征参数，输入步骤(6.5)得到的苦味化合物检测模型，即可对待测苦味化合物进行分类和浓度检测。

根据上述的基于心肌细胞兴奋收缩偶联的苦味物质检测方法(检测流程示意图如图1所示)进行实验，图4和图5为实验结果，图4为根据归一化处理后不同苦味化合物特征参数得出的不同苦味化合物作用下心肌细胞机电信号可视化结果图(雷达图和热图)，其中图4A中的雷达图表示不同苦味物质作用下心肌细胞机电信号不同特征参数的归一化值，其中可见对照组各个特征参数的归一化值为1，而四种不同苦味物质作用后的不同特征参数模式不同，四种苦味物质刺激后的发放频率FR均小于对照组，而在MB幅值，EFP间隔，MB间隔均不同程度大于对照组，在其他特征参数上也呈现出不同的特征；图4B的热图则能够更加直观的反应不同苦味作用下不同特征参数的变化。

图5为应用机器学习算法对不同苦味化合物归一化特征参数的分析结果。其中图5A为利用PCA主成分分析法对提取出的不同特征参数进行降维后的二维主成分分布图，从图中可以看出，相同来源的数据点分布各自分布在不同区域，其中对照组，苯甲地那铵，地芬尼多和奎宁组分布相对集中。图5B为利用LDA线性判别式分析算法构建的苦味物质检测模型对测试集的检测识别结果。首先将带有标签的数据集分别划分为70％的训练集和30％的测试集，基于LDA算法利用训练集进行苦味检测模型构建，并利用测试集对训练模型进行测试。由图5可见，平面区域被划分为5个区域，分别表示对照组和四种苦味物质，绝大部分测试集数据分布在相对应的正确区域，构建的苦味检测模型对于测试集的识别准确率达95％以上。以上实施例的结果证明本发明方法能够准确检测并分析不同苦味物质对于心肌细胞兴奋收缩信号的影响。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。