一种马秋波病毒的特异性识别抗体及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种马秋波病毒的特异性识别抗体及检测试剂盒，通过以下方法制备获得：以假病毒作为免疫原对小鼠进行免疫，再用真核表达的重组MACV GP1蛋白作为抗原对免疫小鼠血清进行第一轮特异性结合筛选，取血清特异性抗体滴度高的小鼠脾脏，与鼠骨髓瘤细胞融合，融合细胞继续以真核表达的重组MACV GP1蛋白作为抗原进行第二轮特异性结合筛选，得到杂交瘤细胞株，能分泌特异性识别马秋波病毒(MACV)的抗体；所述假病毒为带MACV包膜蛋白的VSV骨架假病毒。该抗体能够特异性结合MACV，将其区别于不同种类的NW沙粒病毒，假阳性和假阴性均降低，提高了检测准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒诊断技术领域，具体涉及一种能够特异性鉴别NW沙粒病毒中马秋波病毒的抗体及检测试剂盒。

背景技术

致病性新世界(NewWorld,NW)沙粒病毒如马秋波病毒(Machupo virus,MACV)、胡宁病毒(Juninvirus,JUNV)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus,GTOV)、萨比亚病毒(Sabiavirus,SBAV)和查帕尔病毒(Chapare virus,CHAPV)曾在巴西、玻利维亚、阿根廷、委内瑞拉等地区引发严重的出血热疫情，一度在南美社会引起极大恐慌。这些病毒致死率(～35％)仅次于埃博拉、马尔堡等烈性病毒，且大部分无有效防治手段，被认定为生物安全四级病原。近年来，随着国际经济发展和文化交流带来的人员和物资快速流动，此类病毒也迅速从美洲传播至欧洲和亚洲，对全球的生物安全形势造成了极大威胁。目前我国在此类病毒的诊断和防治研究上仍处于初级阶段，我国社会极易因此类病毒的入侵引发恐慌。因此，在我国布局致病性NW沙粒病毒的研究，建立此类病毒的鉴定和诊断方法，对提升我国应对新发突发烈性病毒的能力来说尤为迫切和重要。

马秋波病毒(Machupo virus,MACV)是致病性NW沙粒病毒重要的一员，导致玻利维亚出血热，致死率为10％～35％。因无有效防治手段，MACV在我国被列为第一类危害程度的人间传染病毒。针对其感染性材料的检测、研究和相关活动均需在生物安全四级实验室进行。沙粒病毒是双节段、负链、双义RNA病毒，其基因组包含一个长约7.2k的大片段L(Large)和一个长约3.5k的小片段S(Small)。L片段编码基质蛋白Z和RNA聚合酶L，而S片段则编码核蛋白NP(nucleoprotein)和包膜糖蛋白GPC(glycoproteinprecursor)。致病性NW沙粒病毒天然宿主为野鼠，但在其体内症状较轻或无症状。人类在工作和生活中通过接触携带病毒的野鼠、或其分泌物及排泄物、被其污染的食物和带有病毒的气溶胶等就会被感染。一部分人(约35％)在感染后的1-2周内，症状逐渐加重，表现出持续发热、脱水、肾功能不全、低血压、多处粘膜部位严重出血、神经紊乱、休克等症状，最终死于大出血和昏迷。

目前，针对致病性NW沙粒病毒的鉴定和检测方法主要是病毒分离、基于病毒基因组S片段保守区的RT-PCR、基于血清NP特异性IgM和IgG的酶联免疫吸附试验(EnzymeLinked ImmunosorbentAssay，ELISA)或基于病毒NP抗原的ELISA。然而这些方法大部分以在致病性NW沙粒病毒中高度保守的NP为靶点，在实际应用中容易出现因特异性不佳造成的假阳性率高，且难以用单一方法对五个致病性NW沙粒病毒进行区分。与NP不同的是，GPC亚基GP1在致病性NW沙粒病毒中是高度可变的而在同种病毒的不同株型之间又相对保守，适合作为免疫诊断的靶点。

发明内容

本研究拟以MACV GP1为靶点，建立MACV的免疫学诊断方法，为MACV的鉴定和诊断方法提供借鉴和补充。具体地，提供了一种能够特异性识别NW(新世界)沙粒病毒中马秋波病毒(MACV)的抗体，以及一种能够分泌针对MACV特异性结合抗体的杂交瘤细胞株M88，以及一种马秋波病毒检测试剂盒。

下面详述本发明的技术方案：

第一方面，本发明提供了一种马秋波病毒(MACV)的特异性识别抗体，其通过以下方法制备获得：以假病毒作为免疫原对小鼠进行免疫，再用真核表达的重组MACV GP1蛋白作为抗原对免疫小鼠血清进行第一轮特异性结合筛选，取血清特异性抗体滴度高的小鼠脾脏，与鼠骨髓瘤细胞融合，融合细胞继续以真核表达的重组MACV GP1蛋白作为抗原进行第二轮特异性结合筛选，得到杂交瘤细胞株，能分泌特异性识别马秋波病毒(MACV)的抗体；所述假病毒为带MACV包膜蛋白的VSV骨架假病毒。

上述抗体是通过带MACV薄膜蛋白的VSV骨架假病毒作为免疫原，而筛选用抗原使用重组MACV GP1蛋白，能够获得性质特殊的抗体。

优选的，上述抗体，所述假病毒采用以下方法制备：将MACV包膜蛋白基因GPC通过酶切链接的方式将其构建至真核表达载体pCAGGS，获得重组载体pCAGGS-MACV GPC；采用PEI转染法将pCAGGS-MACV GPC转染至HEK293T细胞，培养一段时间完成转染，再用病毒VSVΔG-GFP/VSV G对转染后的细胞进行感染，感染结束后收取细胞培养液上清，即为假病毒。

MACV包膜蛋白基因GPC核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，经过密码子优化将更有利于真核表达载体表达。pCAGGS(addgene)真核表达载体为商业化表达载体，通过293F真核表达系统来对MACV GP1进行重组表达。真核表达有别于原核表达，所得蛋白糖基修饰完全，蛋白结构更接近真实状态下的膜蛋白，利于后续获取性质特别的抗体。

病毒VSVΔG-GFP/VSV G为常用工具病毒，可根据本领域常规技术知识和原料进行自行包装，或者直接购买商业化产品。HEK293T(ATCC)细胞为病毒包装常用工具细胞。

优选的，上述抗体，所述真核表达的重组MACV GP1蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)扩增GP1基因，并通过基因同源重组的方式将GP1基因插入至分泌型真核表达载体，获得重组质粒；GP1基因核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示；

(2)通过大肠杆菌DH5α对重组质粒进行扩增，并采用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒抽提，随后将重组质粒采用PEI转染至HEK293F细胞；

(3)转染后7天，收取细胞培养上清，采用Ni柱对上清进行亲和层析纯化，收集洗脱组分并透析至PBS，即得到真核重组表达的重组MACV GP1蛋白。

第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株M88，用于分泌能够鉴别不同NW沙粒病毒的单抗，用于分泌能够鉴别马秋波病毒的单抗，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.C2020189。

第三方面，本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株M88分泌的单抗(即单克隆抗体，monoclonal antibody，mAb)。

第四方面，本发明还提供了用于检测马秋波病毒(MACV)的试剂盒，其含有上述单抗。

优选的，上述试剂盒配合TMB显色试剂盒使用，包括以下成分：包被有马秋波病毒单抗的孔板、FBS封闭液、洗涤液、HRP goat anti-mouse二抗；FBS封闭液为FBS体积百分含量为5％的水溶液；洗涤液为含有体积百分含量0.05％Tween20的PBS溶液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明使用的真核表达重组GP1抗原在致病性NW沙粒病毒中高度可变，但在同种病毒的不同株型之间又相对保守，因此非常适合作为免疫诊断的靶点抗原，能够将MACV明显区别与其他不同种类的NW沙粒病毒。真核表达确保了GP1蛋白表达后的正确折叠，构象天然。

杂交瘤细胞株M88分泌的单克隆抗体能够有效将MACV区别于其他种类的致病性NW沙粒病毒，且同一MACV种类的不同株型间高度保守，大幅度降低了假阳性结果和假阴性结果的出现，提高了检测准确性。

保藏信息：

鼠杂交瘤细胞株M88，于2020年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉武汉大学保藏中心430072，保藏编号CCTCC No.C2020189。

附图说明

图1为实施例3M88单抗对不同抗原的结合结果；

图2为单抗M88对五种NW沙粒病毒GP1的特异性结合检测结果；

图3为单抗M88对五种NW沙粒病毒GPC的特异性结合检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1重组GP1抗原的制备

a)首先通过全基因合成获得了MACV包膜蛋白基因GPC，基因序列参见SEQ IDNO.1，并通过酶切链接将其构建至真核表达载体pCAGGS，得到了重组表达载体pCAGG S-MACV GPC。

b)通过设计特异性引物对GP1基因进行PCR，GP1基因的核苷酸序列参见SEQ IDNO.2，并运用基因同源重组的方法将GP1插入分泌型真核表达载体pCDNA3.1(Invitrogen)，得到带有分泌肽CD5和纯化标签His的pCDNA3.1-CD5-GP1-his重组质粒。

c)通过大肠杆菌DH5α对步骤b)的重组质粒进行扩增，并采用无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN公司产品，货号DP117)根据说明书记载的步骤进行质粒抽提，随后将重组质粒采用PEI转染法转染至HEK293F细胞。

PEI：聚乙烯亚胺。PEI转染法所用试剂配方：PEI储存液(100μM)：称取125mg PEI粉末溶解于50ml 1×HBS(pH7.4)中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。1×HBS(pH7.4)：将8.76g NaCl溶解于900ml超纯水，加入20ml 1M的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，过滤(0.2μm滤膜)后储存于4℃备用。

d)转染后7天，收取细胞培养上清。采用Ni柱对上清进行亲和层析纯化，收集洗脱组分并透析至PBS，即得到真核重组表达的GP1抗原，命名为MACV GP1抗原。

实施例2靶向重组GP1的单克隆抗体的制备

a)假病毒包装：采用PEI转染法将实施例1步骤a)制备的重组表达载体pCAGG S-MACV GPC转染至HEK293T细胞；24小时后，用工具病毒VSVΔG-GFP/VSV G对转染后的细胞进行感染；36小时后收取细胞培养上清，即为带MACV薄膜蛋白的VSV骨架假病毒，命名为VSVΔG-GFP/MACV GPC，作为免疫原。

b)将10

c)血清特异性抗体滴度ELISA检测：免疫三次后取小鼠眼眶血，室温静置30分钟，离心收上清即为血清；将MACV GP1抗原包被至ELISA板，梯度稀释后的血清作为一抗，随后进行常规ELISA检测，进行第一轮特异性结合筛选。

d)融合：取血清GP1特异性抗体滴度高的小鼠脾脏，与鼠骨髓瘤细胞进行融合，并对融合后的细胞进行HAT选择性培养。

e)筛选：以MACV GP1作为抗原，采用ELISA对融合后的细胞进行筛选；随后，对强阳性孔细胞进行克隆化培养，并对单克隆细胞上清进行第二轮GP1特异性筛选，得到候选杂交瘤细胞株M88。

f)抗体制备：将分泌GP1特异性抗体的单克隆细胞M88体外扩增后，注入石蜡油预刺激的小鼠腹腔，10天后收取腹水。采用proteinA柱对腹水进行亲和层析纯化，洗脱组分即为GP1的单克隆抗体M88，简称M88单抗。

实施例3单克隆抗体M88对不同病毒的检测

分别以重组GP1抗原、假病毒VSVΔG-GFP/MACV GPC和过表达MACV GPC的HeLa细胞作为抗原，采用ELISA分别测定M88单抗的结合能力。ELISA的具体操作如下：

A.抗原包被：将重组GP1抗原以10μg/ml，100μl/well包被于96孔板；10

B.封闭：弃去孔中液体，在滤纸上拍干，每孔加入200μl 5％FBS的封闭液，室温1-2hrs。

C.洗涤：弃去孔中液体，在滤纸上拍干。加入200μl洗涤液(PBS+0.05％Tween20)，室温静置5mins，弃去液体，再滤纸上拍干。重复此步骤3次。

D.一抗孵育：将血清按照10倍梯度进行稀释，每孔中加入100μl。室温孵育2hrs。

E.洗涤：弃去孔中液体，在滤纸上拍干。加入200μl洗涤液，室温静置5mins，弃去液体，再滤纸上拍干。重复此步骤5次。

F.二抗孵育：将HRP goat anti-mouse二抗稀释在PBS中，每孔中加入100μl。室温孵育1h。

G.洗涤：弃去孔中液体，在滤纸上拍干。加入200μl洗涤液，室温静置5mins，弃去液体，再滤纸上拍干。重复此步骤5次。

H.显色：采用TMB显色试剂盒，以A液：B液＝1:100的比例进行配制，每孔加入100μl。室温放置5-15mins，可观察到孔中慢慢出现蓝色。

I.中止反应：每孔加入100μl终止液(1M H

J.读数：于酶标仪上测定OD450。

M88单抗对不同抗原的结合结果如图1所示，结果提示，通过本专利描述的方法制作得到的单抗M88不仅对MACV GP1亚基具有较强结合力，并且对过表达于细胞表面的MACV完整囊膜蛋白，以及带有MACV完整囊膜蛋白的VSV骨架假病毒均有较好结合作用。

实施例4单抗M88对不同种类NW沙粒病毒的特异性识别检测

单抗M88对五种NW沙粒病毒(MACV、JUNV、GTOV、SBAV和CHAPV)GP1的结合能力检测：(方法同实施例3)。

检测结果参见图2，结果显示：M88对MACV GP1具有明显结合作用，对JUNV、GTOV、SBAV和CHAPV GP1几乎无结合作用。提示M88单抗对五种个NW沙粒病毒(MACV、JUNV、GTOV、SBAV和CHAPV)GP1亚基的结合具有选择性，能够特异性识别出MACV。

实施例5

5.单抗M88对五种NW沙粒病毒VSV骨架假病毒的结合能力检测

五种NW沙粒病毒(MACV、JUNV、GTOV、SBAV和CHAPV)VSV骨架假病毒的结合能力检测的方法同实施例3。

因MACV、JUNV、GTOV、SBAV和CHAPV为四级病原，且我国尚无活病毒，因此采用VSV骨架的假病毒来作为替代抗原进行抗体的特异性验证。

结果如图3所示，结果提示：单抗M88对MACV假病毒具有明显结合作用，对JUNV、GTOV、SBAV和CHAPV假病毒几乎无结合，可在五个NW沙粒病毒中区分MACV病毒。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 武汉珈创生物技术有限公司

<120> 一种马秋波病毒的特异性识别抗体及检测试剂盒

<130> WH2006140-1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggccagc tgatctcctt ctttcaggag atccccgtgt ttctgcagga ggccctgaac 60

attgctctgg tggccgtgag cctgattgcc gtgatcaaag gcatcattaa cctgtacaag 120

tccggcctct tccagttcat cttcttcctg ctgctcgccg gcagatcctg cagcgatggc 180

acattcaaga tcggcctgca caccgagttt cagagcgtga ccctgaccat gcagaggctg 240

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atgaggggcg gcgtgaatac cttcctgatt agggtctccg atatctccgt cctgatgaag 360

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<210> 2

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataggtctac atacagagtt tcaatcagtc acctttacca tgcagaggct tttggccaac 60

cactcaaatg aacttccatc tctttgcatg cttaataata gtttttatta tatgaaggga 120

ggtgcaaaca ttttcctaat tcgtgtttct gatgtctcag tccttatgaa agagtatgat 180

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tgtagaaaca agacaaagaa ggaaggatcc aacattcaat ttaatattag taaagctgat 360

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tacgacccat gtgaggaagg gaaagtatgt tatgtgact 459