一种海洋来源的抗肿瘤活性化合物及其制备方法、应用

摘要

本发明涉及海洋生物及医药技术领域，具体地说，涉及一种从海洋海绵Aaptos suberitoides中分离得到的抗肿瘤活性化合物及其制备方法和抗肿瘤应用。本发明所述的抗肿瘤活性化合物是首次从海绵Aaptos suberitoides中分离出来的aaptamine类化合物，采用核磁共振、质谱等波谱数据确认了其分子式和结构，该化合物提取方法简单易行，结构简单，人工合成也易于实现。同时，通过CCK8法试验测试，该化合物对肺癌细胞H1299、肺癌细胞H520、胃癌细胞SCG7901、鼻咽癌细胞CNE‑2、结肠癌细胞SW480均具有显著的抑制活性，可作为抗肿瘤药物研发的先导化合物。本发明为开发利用我国海洋生物资源及抗肿瘤新药的研发提供了科学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物及医药技术领域，具体地说，涉及一种从海洋海绵Aaptossuberitoides中分离得到的抗肿瘤活性化合物及其制备方法、应用。

背景技术

肿瘤是危害人类生命健康的全球性问题，近年来，在全球范围内呈现逐渐上升趋势。预计未来20年，每年新发癌症病例将达到2200万，同期癌症死亡数将上升到1300万例。因此，研发有效的抗癌药物仍然是肿瘤治疗的首要任务。海洋抗肿瘤天然产物在海洋药物研究中一直占有主导地位。来自美国NCI的数据表明，海洋中超过1％的化合物具有抗肿瘤活性，而陆地植物中仅有0.01％。其中，海绵来源的次级代谢产物在抗肿瘤研发中具有重要的地位。

海绵Aaptos suberitoides属于寻常海绵纲(Demospongiae)，韧海绵目(Hadromerida)，皮海绵科(Suberitidae)，Aaptos属，其主要特征性的成分为aaptamine类生物碱。该类生物碱具有具有显著的抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化等生物活性。因此，深入研究海绵Aaptos suberitoides中的活性成分，挖掘具有抗肿瘤活性的aaptamine类生物碱，有利于该种海绵的开发利用及抗肿瘤新药的研发。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种海洋来源的抗肿瘤活性化合物，第二目的在于提供所述抗肿瘤活性化合物的制备方法，第三目的在于提供所述抗肿瘤活性化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第一目的采用以下技术方案实现：

1、一种海洋来源的抗肿瘤活性化合物，其特征在于：所述化合物是从海绵Aaptossuberitoides中分离得到的，其分子式为C

该化合物命名为：

3-(N-5-methyl pentanoate)aminodemethyl(oxy)aaptamine。

本发明的第二目的采用以下技术方案实现：

所述抗肿瘤活性化合物的制备方法，包括以下步骤：

1、原料处理：将冷冻保存的海绵样品用粉碎机粉碎后，在室温下用甲醇动态冷浸提取3次，每次浸泡5天；合并3次提取液，40℃温度条件下减压浓缩；然后，用无水甲醇溶解脱盐3次，制得浸膏；

2、硅胶减压柱层析：将浸膏溶解于1.5-3倍重量的纯甲醇中，再用浸膏重量1-3倍的100-200目硅胶拌样后上硅胶减压柱；再分别用石油醚与乙酸乙酯体积配比为100:0、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚乙酸乙酯溶液和二氯甲烷与甲醇体积配比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的二氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；

3、ODS柱层析：取步骤2中体积配比为20:1的二氯甲烷甲醇溶液洗脱得到的组分，过ODS柱，再分别用甲醇与水体积配比为1:4、3:7、4:6、5:5、6:4的甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；

4、高效液相色谱分离：取步骤3中体积配比为4:6的甲醇溶液洗脱得到的组分通过高效液相分析，用ODS C18柱制备可得所述化合物，保留时间为23.7分钟。

优选的：步骤2中，所述硅胶减压柱的填料硅胶为200-300目。

优选的：步骤4中，所述ODS C18柱采用YMC ODS C18柱，型号为10×250mm，填料粒径为5μm，流动相为乙腈/水40:60v/v，流速为1.5mL/min。

本发明的第三目的采用以下技术方案实现：

所述抗肿瘤活性化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，具体地说：所述化合物能用作抑制肺癌细胞H1299、肺癌细胞H520、胃癌细胞SCG7901、鼻咽癌细胞CNE-2、结肠癌细胞SW480增殖的抗肿瘤药物研发的先导化合物。

有益效果：本发明所述的抗肿瘤活性化合物是首次从海绵Aaptos suberitoides中分离出来的aaptamine类化合物，采用核磁共振、质谱等波谱数据确认了其分子式和结构，该化合物提取方法简单易行，结构简单，人工合成也易于实现。同时，通过CCK8法试验测试，该化合物对肺癌细胞H1299、肺癌细胞H520、胃癌细胞SCG7901、鼻咽癌细胞CNE-2、结肠癌细胞SW480均具有显著的抑制活性作用，可作为抗肿瘤药物研发的先导化合物。本发明为开发利用我国海洋生物资源及抗肿瘤新药的研发提供了科学依据。

附图说明

图1为本发明所述化合物的制备方法工艺流程图；

图2为本发明所述化合物的核磁共振氢(

图3为本发明所述化合物的核磁共振碳(

图4为本发明所述化合物的核磁共振氢(

图5为本发明所述化合物的核磁共振氢(HMQC)谱图；

图6为本发明所述化合物的核磁共振氢(HMBC)谱图；

图7为本发明所述化合物的高分辨质(HRESIMS)谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例：

本实施例所述海洋来源的抗肿瘤活性化合物，是从海绵Aaptos suberitoides中分离得到的，其分子式为C

该化合物命名为：

3-(N-5-methyl pentanoate)aminodemethyl(oxy)aaptamine。

所述海绵Aaptos suberitoides于2012年采自于西沙永兴岛海域，并将其于-20℃冷冻保存。

所述抗肿瘤活性化合物的制备方法，包括以下步骤：

1、原料处理：将冷冻保存的湿重2.5kg的海绵样品用粉碎机粉碎后，在室温下用甲醇动态冷浸提取3次，每次浸泡5天；合并3次提取液，40℃温度条件下减压浓缩；然后，用无水甲醇溶解脱盐3次，制得浸膏(海绵Aaptos suberitoides粗提物)；

2、硅胶减压柱层析：将浸膏溶解于1.5-3倍重量的纯甲醇中，再用浸膏重量1-3倍的100-200目硅胶拌样后上硅胶减压柱(硅胶减压柱的填料硅胶为200-300目)；再分别用石油醚与乙酸乙酯体积配比为100:0、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚乙酸乙酯溶液和二氯甲烷与甲醇体积配比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的二氯甲烷甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；

3、ODS柱层析：取步骤2中体积配比为20:1的二氯甲烷甲醇溶液洗脱得到的组分，过ODS柱，再分别用甲醇与水体积配比为1:4、3:7、4:6、5:5、6:4的甲醇溶液进行梯度洗脱，分别收集各部分的洗脱液并浓缩，用TLC薄层色谱监测并合并相同的部分；

4、高效液相色谱分离：取步骤3中体积配比为4:6的甲醇溶液洗脱得到的组分通过高效液相分析，用ODS C18柱制备可得所述化合物，保留时间为23.7分钟。优选的，所述ODSC18柱采用YMC ODS C18柱，型号为10×250mm，填料粒径为5μm，流动相为乙腈/水40:60v/v，流速为1.5mL/min。

化合物结构解析

取制备的抗肿瘤活性化合物进行质谱、红外光谱、紫外光谱和核磁共振等光谱数据的检测及分析，结果为：该化合物为橘红色粉末，易溶于甲醇；在波长254nm的紫外灯下有暗斑；UV光谱(MeOH)在210、250、280、390nm处有特征性吸收峰；10％的硫酸乙醇显色为红色。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z 342.1439[M+H]

分析化合物的

通过HMQC把该化合物的碳和氢归属，根据H-H COSY谱中δ

3-(N-5-methyl pentanoate)aminodemethyl(oxy)aaptamine。

表1：抗肿瘤活性化合物的

本发明所述抗肿瘤活性化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，具体地说：所述化合物能用作抑制肺癌细胞H1299、肺癌细胞H520、胃癌细胞SCG7901、鼻咽癌细胞CNE-2、结肠癌细胞SW480增殖的抗肿瘤药物研发的先导化合物。

抗肿瘤活性测定

1、取上述实施例制备的抗肿瘤活性化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，再用培养液(含10％胎牛血清的RPMI1640培养液)配制成抗肿瘤活性化合物浓度为10mg/mL的储备液置于-20℃保存。临用前，用培养液稀释抗肿瘤活性化合物至终浓度分别为0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL和6mg/ml，且其中任意稀释供试液中DMSO终浓度控制在0.01％以下。

2、将人非小细胞肺癌细胞株H1299、胞肺癌细胞株H520、人胃癌细胞株SCG7901、人鼻咽癌细胞株CNE-2、人结肠癌细胞株SW480，分别用0.25％的胰酶消化后，悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，轻轻吹打成单细胞悬液进行细胞计数，之后用培养液稀释至浓度为50000个细胞/mL。

3、取顺铂用DMSO溶解，用培养液(含10％胎牛血清的RPMI1640培养液)配制成顺铂浓度为5mM的储备液置于-20℃保存。临用前，再用培养液稀释至终浓度分别为5mM、1mM、0.5mM、0.25mM、0.125mM、0.0625mM，且其中任一稀释供试品中DMSO终浓度控制在0.01％以下，作为阳性对照药。

4、在96孔培养板的每一个孔中加入100μL生长良好的肿瘤细胞(约5000个细胞/孔)，24小时培养待细胞完全贴壁后，每孔分别加入1μL药物(抗肿瘤活性化合物和顺铂)，每组平行设六个复孔，并设阴性对照(加培养基和肿瘤细胞，不加药)和空白对照(只加培养基，不加肿瘤细胞)。置于37℃、CO

细胞存活率＝(OD样品-OD空白)/(OD阴性对照-OD空白)×100％

细胞增殖抑制率＝100％﹣细胞存活率

IC50：肿瘤细胞抑制率为50％时药物的质量浓度。

实验结果：阴性对照，细胞生长良好，无生长抑制现象，说明试验方法可行。

表2：供试液组所测得的IC 50值

以上通过CCK8方法对抗肿瘤活性化合物进行了肺癌H1299、肺癌H520、胃癌SCG7901、结肠癌SW480和鼻咽癌CNE-2这5种肿瘤细胞株的细胞毒活性筛选，其半数抑制量(IC 50值，μg/mL)的测定结果与已商品化的抗癌药物顺铂(DDP)相比较于表中。实验结果显示该化合物对肺癌H1299、肺癌H520和胃癌SCG7901具有更强的抗肿瘤活性，具有制备临床上抗肺癌和胃癌药物的应用价值。

以上仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构，直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理在本发明的专利保护范围之内。