一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，包括外植体的选择、诱导培养、增殖培养、体胚诱导培养、生根培养和移栽；本发明提供的一种以槟榔叶片为外植体材料，先脱分化诱导获得胚性愈伤组织，再去分化获得完整离体再生植株的培养方法，本发明的方法与槟榔种子育苗相比不需要槟榔母树为下一年留种育苗，育苗不受种源和季节限制，在短时间内可扩繁大量种苗，且培养的槟榔组培苗后代具有一致的基因型。本发明方法突破了槟榔只有单生长点无法进行无性繁殖的瓶颈，获得的再生植株具有与母本完全一致的遗传基因，实现了槟榔规模化的无性快繁。

说明书

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

槟榔(Areca catechu L.)是棕榈科槟榔属热带亚热带经济作物，我国是世界第二大槟榔主产区，我国种植槟榔已有1500多年的历史，其中海南和台湾是我国槟榔的主产区，广东、广西、云南、福建等省也有少量栽培。据统计，2017年槟榔总种植面积接近200万亩，是海南省重要的热带高效益经济作物。目前，槟榔已发展为海南省第二大热带经济作物，仅次于天然橡胶，成为海南的经济支柱产业之一。

槟榔的黄化病是目前严重危害槟榔产业发展最主要问题，培育高产、抗黄化病的槟榔品种时解决目前产业发展的关键，而槟榔育种周期长，杂交后代性状分离严重，因此通过组织培养技术对特异的槟榔种植材料进行繁育，培育性状稳定、表现一致、抗病虫害能力强的优良无性品系，是解决制约槟榔产业发展关键问题的一条新途径。同时也可以通过组织培养技术为基础，建立槟榔的遗传转化体系，可为槟榔分子生物学等基础研究提供平台。

国内黄丽云等人以‘热研1号’槟榔幼胚为外植体，实现槟榔胚的离体培养，但未能实现增殖，目前国内尚未有槟榔组培快繁的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：

S1.外植体的选择：采集槟榔叶片，清洗消毒后作为外植体备用；

S2.诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，所述诱导培养基为：改良MS培养基+N6培养基维生素+0-10mg/L毒莠定+30g/L蔗糖+2g植物凝胶或改良MS培养基+N6培养基维生素+0-20mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为5-6，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S3.增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+1-2mg/L 2-ip+0.1-5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为5-6，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S4.体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，所述体胚诱导培养基为：DKW+1-2mg/L 6-BA+0.1-5mg/L 2，4-D+60-90g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为5-6；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株；其中，所述的成熟培养基为：DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶或MS基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为5-6；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。

进一步地，步骤S1中所述清洗消毒的具体步骤为：将幼嫩叶片用流水冲洗10-30min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；先用75％的酒精浸泡1-2min，再用2％次氯酸钠浸泡10-20min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌培养皿中待用。

进一步地，步骤S2中所述暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为60-90天。

进一步地，步骤S2中所述诱导培养基为改良MS培养基+N6培养基维生素+5mg/L毒莠定+30g/L蔗糖+2g植物凝胶或改良MS培养基+N6培养基维生素+10mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g植物凝胶。

进一步地，步骤S3中所述暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为25-30天。

进一步地，步骤S4中所述暗培养时间为60天，30天继代一次，培养温度28±1℃。

进一步地，步骤S5中所述萌发培养的时间为20天，培养温度为28±1℃；所述光照条件为光照强度1000-3000Lx，光照时间16-18h/d，光照条件下培养的时间为60-90天，每30天继代一次。

进一步地，步骤S5中所述萌发培养基为DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶。

本发明具有以下优点：本发明提供了一种以槟榔叶片为外植体材料，先脱分化诱导获得胚性愈伤组织，再去分化获得完整离体再生植株的培养方法，本发明的方法与槟榔种子育苗相比不需要槟榔母树为下一年留种育苗，育苗不受种源和季节限制，在短时间内可扩繁大量种苗，且培养的槟榔组培苗后代具有一致的基因型。本发明方法突破了槟榔只有单生长点无法进行无性繁殖的瓶颈，获得的再生植株具有与母本完全一致的遗传基因，实现了槟榔规模化的无性快繁。

附图说明

图1为槟榔叶片诱导获得愈伤组织示意图；

图2为诱导获得槟榔体细胞胚示意图；

图3为槟榔体细胞胚萌发示意图；

图4为槟榔再生植株示意图；

图5为槟榔组培苗移栽成活示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

DKW培养基购买PhytoTechnology

N6维生素培养基购买PhytoTechnology

Picloram(毒莠定)购买PhytoTechnology

2,4D(2,4-二氯苯氧乙酸)购买PhytoTechnology

6-BA(6-苄氨基嘌呤)购买PhytoTechnology

2-iP(N6-异戊烯基腺嘌呤)购买PhytoTechnology

植物凝胶购买

谷氨酰胺购买PhytoTechnology

实施例1：一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：

S1.外植体的选择：采集槟榔叶片，将幼嫩叶片用流水冲洗10min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；先用75％的酒精浸泡1min，再用2％次氯酸钠浸泡10min，最后用无菌水冲洗5次，放入无菌培养皿中待用，清洗消毒后作为外植体备用；

S2.诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，如图1所示，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为60天，所述诱导培养基为：改良MS培养基+N6培养基维生素+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为5，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S3.增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为25天，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+1mg/L 2-ip+0.1mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为5，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S4.体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，如图2所示，暗培养时间为60天，30天继代一次，培养温度28±1℃，所述体胚诱导培养基为：DKW+1mg/L 6-BA+0.1mg/L 2，4-D+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为5；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，如图3所示，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养的时间为20天，培养温度为28±1℃，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株，如图4所示，所述光照条件为光照强度1000Lx，光照时间16h/d，光照条件下培养的时间为60天，每30天继代一次，其中，所述的成熟培养基为：DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为5；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养，如图5所示。

实施例2：一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：

S1.外植体的选择：采集槟榔叶片，将幼嫩叶片用流水冲洗30min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；先用75％的酒精浸泡2min，再用2％次氯酸钠浸泡20min，最后用无菌水冲洗6次，放入无菌培养皿中待用，清洗消毒后作为外植体备用；

S2.诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，如图1所示，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为90天，所述诱导培养基为：改良MS培养基+N6培养基维生素+10mg/L毒莠定+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为6，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S3.增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为30天，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+2mg/L 2-ip+5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为6，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S4.体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，如图2所示，暗培养时间为60天，30天继代一次，培养温度28±1℃，所述体胚诱导培养基为：DKW+2mg/L 6-BA+5mg/L 2，4-D+90g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为6；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，如图3所示，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养的时间为20天，培养温度为28±1℃，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株，如图4所示，所述光照条件为光照强度3000Lx，光照时间18h/d，光照条件下培养的时间为90天，每30天继代一次，其中，所述的成熟培养基为：MS基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为6；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养，如图5所示。

实施例3：一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：

S1.外植体的选择：采集槟榔叶片，将幼嫩叶片用流水冲洗15min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；先用75％的酒精浸泡1.5min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗5次，放入无菌培养皿中待用，清洗消毒后作为外植体备用；

S2.诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，如图1所示，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为70天，所述诱导培养基为：改良MS培养基+N6培养基维生素+5mg/L毒莠定+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为5.8，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S3.增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为27天，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+1.2mg/L 2-ip+0.5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为5.8，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S4.体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，如图2所示，暗培养时间为60天，30天继代一次，培养温度28±1℃，所述体胚诱导培养基为：DKW+1.5mg/L 6-BA+1mg/L 2，4-D+70g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为5.8；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，如图3所示，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养的时间为20天，培养温度为28±1℃，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株，如图4所示，所述光照条件为光照强度1500Lx，光照时间17h/d，光照条件下培养的时间为70天，每30天继代一次，其中，所述的成熟培养基为：DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为5.8；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养，如图5所示。

实施例4：一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：

S1.外植体的选择：采集槟榔叶片，将幼嫩叶片用流水冲洗20min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；先用75％的酒精浸泡2min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗6次，放入无菌培养皿中待用，清洗消毒后作为外植体备用；

S2.诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，如图1所示，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为80天，所述诱导培养基为：改良MS培养基+N6培养基维生素+20mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为5.8，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S3.增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为30天，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+1.5mg/L 2-ip+2mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为5.8，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S4.体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，如图2所示，暗培养时间为60天，30天继代一次，培养温度28±1℃，所述体胚诱导培养基为：DKW+1.5mg/L 6-BA+2mg/L 2，4-D+80g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为5.8；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，如图3所示，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养的时间为20天，培养温度为28±1℃，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株，如图4所示，所述光照条件为光照强度2000Lx，光照时间18h/d，光照条件下培养的时间为80天，每30天继代一次，其中，所述的成熟培养基为：MS基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为5.8；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养，如图5所示。

实施例5：一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：

S1.外植体的选择：采集槟榔叶片，将幼嫩叶片用流水冲洗25min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；先用75％的酒精浸泡2min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗5次，放入无菌培养皿中待用，清洗消毒后作为外植体备用；

S2.诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，如图1所示，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为60天，所述诱导培养基为：改良MS培养基+N6培养基维生素+10mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为5.8，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S3.增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为30天，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+1.8mg/L 2-ip+4mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为5.8，所述改良MS培养基的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40％；

S4.体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，如图2所示，暗培养时间为60天，30天继代一次，培养温度28±1℃，所述体胚诱导培养基为：DKW+1.8mg/L 6-BA+4mg/L 2，4-D+90g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为5.8；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，如图3所示，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养的时间为20天，培养温度为28±1℃，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株，如图4所示，所述光照条件为光照强度3000Lx，光照时间17h/d，光照条件下培养的时间为90天，每30天继代一次，其中，所述的成熟培养基为：DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为5.8；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养，如图5所示。

以下通过实验说明本发明的有益效果：

1.不同培养基配比对槟榔叶片愈伤组织诱导的影响

S1.外植体的选择：将采集的槟榔幼嫩叶片用流水冲洗20min，去除表面污垢。转移至超净工作台上，放入无菌烧杯中，用无菌水润洗1次。叶片表面消毒先用75％的酒精浸泡0.5min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌的培养皿中待用；

S2.诱导培养：将叶片切成2mm大小，接种至不同的体细胞胚诱导培养基中，培养基包括不同基本培养基配比+5mg/L毒莠定+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8，不同基本培养基配比处理因子及水平如表1所示，培养温度26±1℃，每30天继代一次，暗培养90天后，获得胚性愈伤组织；

S3.增殖培养：将所得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基包含:改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素1.5mg/L 2-ip+2mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，pH＝5.8，培养温度28±1℃，每30天继代1次；

S4.体胚诱导培养：将继代增殖后获得的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养，胚诱导培养基包含：DKW+1mg/L 6-BA+1mg/L 2，4-D+70g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养的温度为28±1℃，培养时间为60天获得槟榔体细胞胚；

S5.生根培养：将槟榔体细胞胚转移至成熟培养基，先进行暗培养，培养温度28±1℃；培养20天后转移至光照条件下继续培养，培养的温度为28±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16-18h/d，每30天继代一次，成熟培养基为DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶。

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。

表1不同培养基配比对槟榔叶片愈伤组织诱导的影响

从表1可知不同含量的硝酸铵盐与维生素组合对槟榔叶片愈伤组织诱导差异显著，A1处理(N6培养基的维生素)组合对槟榔叶片愈伤组织诱导率显著高于A2(MS培养基的维生素)处理组合。同时不同的硝酸铵盐的含量对槟榔叶片愈伤组织诱导差异显著，最佳的基本培养基配比为A1B4组合(N6维生素+40％MS硝酸铵盐)，愈伤组织诱导率可达到88.9％，同时愈伤组织质量好，颜色微黄。

2.不同种类生长素浓度对槟榔愈伤组织诱导的影响

S1.外植体的选择：将采集的槟榔幼嫩叶片用流水冲洗20min，去除表面污垢，转移至超净工作台上，放入无菌烧杯中，用无菌水润洗1次，叶片表面消毒先用75％的酒精浸泡0.5min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌的培养皿中待用；

S2.诱导培养：将叶片切成2mm大小，接种至不同的体细胞胚诱导培养基中，培养基包括改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素+不同浓度毒莠定或2,4D+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8，不同种类生长素的处理因子及水平如表2所示，培养温度26±1℃，每30天继代一次，暗培养90天后，获得胚性愈伤组织；

S3.增殖培养：将所得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基包含:改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素1.5mg/L 2-ip+2mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，pH＝5.8，培养温度28±1℃，每30天继代1次；

S4.体胚诱导培养：将继代增殖后获得的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养，胚诱导培养基包含：DKW+1mg/L 6-BA+1mg/L 2，4-D+70g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养的温度为28±1℃，培养时间为60天获得槟榔体细胞胚；

S5.生根培养：将槟榔体细胞胚转移至成熟培养基，先进行暗培养，培养温度28±1℃，培养20天后转移至光照条件下继续培养，培养的温度为28±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16-18h/d，每30天继代一次，成熟培养基为DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。

表2不同种类生长素浓度对槟榔愈伤组织诱导的影响

从表2可知，生长素是诱导槟榔产生愈伤组织的必要因子，在不添加生长素的培养基上，没有愈伤组织产生，不同种类的生长素对槟榔愈伤组织诱导效果不同，不同浓度生长素对槟榔愈伤组织诱导具有显著差异，添加毒莠定5mg/L诱导槟榔愈伤组织效果最好，愈伤诱导率达到88.9％。

3.不同浓度的植物激素组合对槟榔愈伤组织增殖效率的影响

S1.外植体的选择：将采集的槟榔幼嫩叶片用流水冲洗20min，去除表面污垢，转移至超净工作台上，放入无菌烧杯中，用无菌水润洗1次，叶片表面消毒先用75％的酒精浸泡0.5min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌的培养皿中待用；

S2.诱导培养：将叶片切成2mm大小，接种至体细胞胚诱导培养基中，培养基包括改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素+5mg/L毒莠定+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8，培养温度26±1℃，每30天继代一次，暗培养90天后，获得胚性愈伤组织；

S3.增殖培养：将所得的胚性愈伤组织转移至不同的增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基处理为:改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素+不同浓度2-iP+不同浓度2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，不同浓度的植物激素组合处理因子及水平如表3所示，培养温度28±1℃，每30天继代1次；

S4.体胚诱导培养：将继代增殖后获得的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养，胚诱导培养基包含：DKW+1mg/L 6-BA+1mg/L 2，4-D+70g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养的温度为28±1℃，培养时间为60天获得槟榔体细胞胚；

S5.生根培养：将槟榔体细胞胚转移至成熟培养基，先进行暗培养，培养温度28±1℃；培养20天后转移至光照条件下继续培养，培养的温度为28±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16-18h/d，每30天继代一次。成熟培养基为DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。

表3不同浓度的植物激素组合对槟榔愈伤组织增殖效率的影响

从表3可以知，在不同浓度2,4-D与2-iP的配比下，槟榔增殖效率差异显著，最佳配比为2mg/L2,4-D与1.5mg/L 2-iP的组合，增殖系数达到6.33。

4.不同2,4-D与6-BA配比对槟榔体细胞胚诱导的影响

S1.外植体的选择：将采集的槟榔幼嫩叶片用流水冲洗20min，去除表面污垢，转移至超净工作台上，放入无菌烧杯中，用无菌水润洗1次，叶片表面消毒先用75％的酒精浸泡0.5min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌的培养皿中待用；

S2.诱导培养：将叶片切成2mm大小，接种至体细胞胚诱导培养基中，培养基包括改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素+5mg/L毒莠定+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8，培养温度26±1℃，每30天继代一次，暗培养90天后，获得胚性愈伤组织；

S3.增殖培养：将所得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基包含：改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素+1.5mg/L 2-ip+2mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，pH＝5.8，培养温度28±1℃，每30天继代1次；

S4.体胚诱导培养：将继代增殖后获得的胚性愈伤组织转移至不同的体胚诱导培养基暗培养，胚诱导培养基为：DKW+不同浓度6-BA+不同浓度2，4-D+70g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，处理浓度如表4所示，培养的温度为28±1℃，培养时间为60天获得槟榔体细胞胚；

S5.生根培养：将槟榔体细胞胚转移至成熟培养基，先进行暗培养，培养温度28±1℃，培养20天后转移至光照条件下继续培养，培养的温度为28±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16-18h/d，每30天继代一次，成熟培养基为DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶；

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。

表4不同2,4-D与6-BA配比对槟榔体细胞胚诱导的影响

从表4可以知，在不同浓度2,4-D与6-BA的配比下，槟榔体细胞胚胎诱导率差异显著，最佳配比为1mg/L 2,4-D与1mg/L 6-BA的组合，体细胞胚胎诱导率达到47.8％。

5.不同基本培养基对槟榔体细胞胚胎成熟的影响

S1.外植体的选择：将采集的槟榔幼嫩叶片用流水冲洗20min，去除表面污垢，转移至超净工作台上，放入无菌烧杯中，用无菌水润洗1次，叶片表面消毒先用75％的酒精浸泡0.5min，再用2％次氯酸钠浸泡15min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌的培养皿中待用；

S2.诱导培养：将叶片切成2mm大小，接种至体细胞胚诱导培养基中，培养基包括改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素+5mg/L毒莠定+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，pH＝5.8，培养温度26±1℃，每30天继代一次，暗培养90天后，获得胚性愈伤组织；

S3.增殖培养：将所得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基进行增殖培养，增殖培养基包含:改良MS无机盐(硝酸铵为原用量的40％)+N6培养基维生素+1.5mg/L 2-ip+2mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，pH＝5.8，培养温度28±1℃，每30天继代1次；

S4.体胚诱导培养：将继代增殖后获得的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养，胚诱导培养基包含：DKW+1mg/L 6-BA+1mg/L 2，4-D+70g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养的温度为28±1℃，培养时间为60天获得槟榔体细胞胚；

S5.生根培养：将槟榔体细胞胚转移至成熟培养基，先进行暗培养，培养温度28±1℃；培养20天后转移至光照条件下继续培养，培养的温度为28±1℃，光照强度为1000-3000Lx，光照时间为16-18h/d，每30天继代一次，成熟培养基为DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶和MS基本培养+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶。

S6.移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。

表5不同基本培养基对槟榔体细胞胚胎成熟的影响

由表5可知，在DKW和MS培养基均可以实现槟榔体细胞胚的成熟，DKW培养基的萌发效率较好达到86.69％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。