一种适用于TSH粉末状国际标准物质浓度准确配制的方法

摘要

本发明公开了一种适用于TSH粉末状国际标准物质浓度准确配制的方法。所述方法包括如下步骤：切割盛放粉末状的TSH国际标准物质的安瓿瓶的凹陷部位；将离心管竖直放置并使管口位于安剖瓶的切割部位，打开安剖瓶，使可能外洒的粉末状标准物质落入离心管内；采用稀释液多次洗涤被分隔成两部分的安剖瓶的内壁，并将所有液体移至离心管中；将离心管中的液体用吸管转移至小管中，并称取其最终质量为M1，作为TSH国际标准物质的原液；测定标准物质的原液的密度，则得原液中TSH的浓度，记为C1；采用TSH 0值混合人血清稀释标准物质的原液，得到不同浓度的标准物质的标准系列溶液。本发明方法为各体外诊断试剂厂商进行量值溯源提供了方法选择，也为正确度验证样本的配制提供参考。

说明书

技术领域

本发明涉及标准物质使用领域，具体涉及一种将TSH国际标准物质配制成不同浓度的方法。

背景技术

促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH)是腺垂体嗜碱性细胞分泌的一种糖蛋白类激素，由211个氨基酸组成，其分子结构由非共价的α、β亚基异二聚体组成，其中该激素发挥生物和免疫功能特异性的是β亚基，α亚基与黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)及人绒毛膜促性腺激素(HCG)的α亚基基本相同。TSH能促进T3(三碘甲腺原氨酸)及T4(甲状腺素)的分泌，同时又受T3及T4的负反馈，是判断甲状腺功能最敏感的指标，在甲状腺疾病治疗过程中，应密切监测该指标的水平。

目前TSH的免疫分析主要为放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA)，免疫放射分析法(immunoradiometric assay,IRMA)，化学发光免疫分析法 (ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)，电化学发光免疫分析法 (Electrochemiluminescence Immunoassay,ECLIA)，时间分辨荧光免疫分析法 (Time-resolved Fluoroimmunoassay,TrFIA)和化学发光酶免疫分析法 (Chemiluminescence Enzyme Immunoassay,CLEIA)等。TSH各厂商检测结果差异较大，有些低浓度的TSH检测值，贝克曼Access 2高于西门子Immulite 2000约20倍。最近有研究表明，TSH在正常浓度时，方法间差异较小，而在异常浓度时差异较大。国内马东红等人对6种TSH检测方法对比研究发现方法间存在不同程度的差异，并且发现放免法和免疫放射法与自动化检测系统的相关性差(r为0.38-0.41)。造成系统间结果差异的原因有很多，如各厂商使用不同的抗体不同，检测人员和仪器间本身的差异等。但是各厂商在校准品的赋值过程中能否正确使用通用的国际标准物质(WHO NIBSC 81/565)并将其值进行准确的传递是重要的影响因素。

鉴于WHO NIBSC 81/565是高浓度TSH冻干粉末，各厂商在利用该标准物质溯源时必须进行一系列的多点稀释。早在2008年，

这些方法涉及的国际标准物质为冻干人血清，使用时仅需要使用天平准确添加适量的水(1.00ml)到小瓶中，该小瓶为带有橡皮塞和螺旋盖，比较容易操作。而TSH 的国际标准物质WHO 81/565为冻干的纯化的人垂体提取物质(约2μg)，该粉末状物质被密封于长条形的安瓿瓶中并储存在-20℃或以下，每个安瓿瓶中TSH含量为11.5 mIU，其基质还包含无肽酶的人血清白蛋白(1mg)和乳糖(5mg)的冻干物质。该安瓿瓶中含有高浓度的TSH，使用时容易发生外洒，而且加入的稀释液的体积需要极其精确，采用直接稀释容易造成最终浓度不准确。因此需要提供一种可以将这类粉末状高浓度国际标准物质准确稀释的简单的方法，从而为这类物质的正确使用提供专用技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确配制TSH国际标准物质(WHO NIBSC 81/565)的方法。

本发明所提供的稀释TSH国际标准物质的方法，包括如下步骤：

(a1)将盛放粉末状的TSH国际标准物质的安瓿瓶放置于室温中至少半小时，然后在不通风的环境中切割所述安剖瓶的凹陷部位；

(a2)将离心管竖直放置并使管口位于所述安剖瓶的切割部位，打开所述安剖瓶，使任何可能外洒的粉末状TSH国际标准物质落入所述离心管内；

(a3)采用稀释液多次洗涤所述被分隔成两部分的安剖瓶内壁，并将所有液体用吸管转移至所述离心管中，反复多次；将所述离心管中的液体用吸管转移至小管中，反复多次洗涤离心管，并称取其最终质量为M1，作为TSH国际标准物质的原液；

(a4)测定所述TSH国际标准物质的原液的密度，则得到所述TSH国际标准物质的原液中TSH的浓度，记为C1；

(a5)采用TSH 0值混合人血清(即采用检测仪器测得TSH浓度为0μIU/mL的血清)稀释所述TSH国际标准物质的原液，得到系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的标准系列溶液，测定所述TSH国际标准物质的标准系列溶液的浓度，即实现对所述TSH国际标准物质的稀释。

上述的方法中，步骤(a1)中，采用砂轮充分切割所述安瓿瓶的凹陷部位，即颈部。

上述的方法中，步骤(a2)中，如果有破碎的玻璃，也要确保落入随时离心管中。

上述的方法中，步骤(a3)中，所述稀释液为含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，所述牛血清白蛋白的浓度为40～55g/L，优选46g/L；

转移所述离心管中的液体时，采用所述稀释液洗涤所述离心管。

上述的方法中，步骤(a4)中，按照下述步骤测定所述TSH国际标准物质的原液的密度：

(b1)称量容器和加样枪枪头的总质量，记为m1，可重复测定3～5次；

(b2)采用所述加样枪枪头吸取体积为v的待测样本，然后置于所述容器中，并整体称重，记为m2，可重复测定3～5次；

(b3)按照公式(1)计算所述待测样本的密度；

ρ待测＝(m2-m1)/v (1)。

上述的方法中，步骤(a4)中，根据所述TSH国际标准物质的原液的密度和质量(M1)，得到所述TSH国际标准物质的原液的体积；由质量和体积，即得到所述 TSH国际标准物质的原液的浓度C1。

上述的方法中，步骤(a5)中，按照下述步骤得到所述TSH国际标准物质的标准系列溶液的浓度：

(A)测定系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的标准系列溶液中每种稀释溶液的密度，记为ρ2；

(B)按照式(2)得到系列不同浓度的所述TSH国际标准物质的标准系列溶液中每种稀释溶液的认证浓度，记为C；

其中，ρ1表示所述TSH国际标准物质的密度；M2表示所述TSH国际标准物质的标准系列溶液中稀释液的质量。

上述的方法中，按照步骤(a4)的方法测定所述TSH国际标准物质的稀释溶液的密度ρ2。

本发明采用的方法将TSH国际标准物质进行稀释，为各厂商进行量值溯源提供了方法选择，也为正确度验证样本的配制提供参考。本发明方法可推进北京地区乃至全国范围内TSH的临床检验质量的提高、从而使各厂商TSH检测结果准确可比；本发明能提高防病治病工作的有效性、为节约和有效利用卫生资源提供必要的技术支持，将来可产生一定的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为国际标准物质(NIBSC 81/565)的实物图。

图2为标准曲线认证值与检测值拟合曲线1。

图3为标准曲线认证值与检测值拟合曲线2。

图4为标准曲线认证值与检测值拟合曲线3。

图5为标准曲线认证值与检测值拟合曲线4。

图6为标准曲线认证值与检测值拟合曲线5。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

TSH国际标准物质(NIBSC 81/565)的实物图如图1所示。

一、按照下述步骤准确稀释TSH国际标准物质：

(a1)将盛放粉末状TSH国际标准物质的安瓿瓶从-80度冰箱中拿出来，放置到室温半小时，同时配制含46g/L牛血清白蛋白(SIGMA公司，货号B2064)的PBS 溶液(Gibco公司，货号10010023)100ml备用。

(a2)为了防止风吹走冻干粉末，在关闭通风的通风橱中，用砂轮充分切割安瓿瓶的凹陷部位(“颈部”)。

(a3)将盛有粉末状物质安瓿瓶在桌面竖立轻敲，使其集中到安瓿管的长端一侧。将50ml离心管竖立放置于桌面上，将切割部位放置于管口上，操作人员戴棉布手套和护目镜，使用配带的开启工具，打开安瓿瓶，保证所有可能外洒的粉末全部落入离心管中。如果有破碎的玻璃，确保落入离心管中。

(a4)用(a1)配制的稀释液，将安瓿瓶中的粉末全部溶解(具体做法是少量多次)转移到离心管中。

(a5)将离心管中的液体一次转移到置于天平上的小管中，反复用(a4)中的稀释液润洗大离心管几次，将所有液体多次转移到天平中的小管中，称出质量M1＝9.939 g作为TSH国际标准物质的原液。

(a6)按照下述步骤测定稀释后的国际标准物质原液的密度：

(b1)称出容器和加样枪枪头的质量，记为m1；

(b2)用(b1)中的加样枪枪头吸取体积为常数v(100μL)的待测样本，然后置于(b1)的所述容器中(之前包括擦去加样枪枪头外面粘附的待测样本的步骤)，并整体称重，记为m2；

(b3)按照如下公式计算待测样本的密度：ρ待测＝(m2-m1)/v。

其中，步骤(b1)和(b2)根据需要可进行3～5次重复。相应的，步骤(b3)中的公式等号左边的参数ρ待测取3～5次重复的平均值。

如下，0.1025g、0.1022g、0.1023g、0.1019g、0.1013g和0.1024g，密度均值为1.021。

(a7)由质量(m＝9.939g)和密度(ρ＝1.021)，得出其体积v＝m/ρ，得到体积为9.734574 ml，算得TSH国际标准物质的原液的浓度为115000/9.734574＝1181.356μIU/mL，即 C1。

(a8)采用TSH 0值混合人血清将TSH国际标准物质的原液进行稀释，配制过程如表1和表2，密度测量方法同步骤(a6)。

(a9)国际标准物质认证值的浓度，步骤如下：

(A)配制不同浓度的TSH标准物质的标准系列溶液：将稀释液和TSH国际标准物质的原液按照不同体积比混合(见表1)，从而获得不同浓度的TSH国际标准物质的标准系列溶液；在配制每份TSH国际标准物质的标准系列溶液的过程中，均对组成TSH国际标准物质的标准系列溶液的稀释液和TSH国际标准物质原液分别进行称重。

(B)不同浓度的TSH国际标准物质的标准系列溶液的密度测定：分别测量步骤 (A)中配制的不同浓度的TSH国际标准物质系列的稀释溶液的各自的密度。

(C)获得不同浓度的TSH国际标准物质的标准系列溶液中TSH的理论浓度：按照如下公式计算不同浓度的TSH国际标准物质的标准系列溶液中的每份稀释溶液中 TSH的认证浓度，

式中，C1表示TSH国际标准物质的原液中TSH的浓度；ρ1表示TSH国际标准物质的原液的密度；M1表示TSH国际标准物质的原液的质量；M2表示TSH国际标准物质的标准系列溶液中稀释液的质量；ρ2表示TSH国际标准物质的标准系列溶液的密度；C表示TSH国际标准物质的标准系列的认证浓度。

(a10)检测所用的仪器为雅培Architect i2000sr，货号7K62-35，批号91052UI00，质控物质为伯乐Immunoassay Plus Control(批号40340)，室内质控在控。

表1.TSH国际标准物质标准系列浓度配制

备注：编号1-5溶液的所用的原液为编号为6的溶液

表2 TSH国际标准物质标准系列密度测定(体积v＝100μL)

二、结果

如表3所示，相对偏倚的均值为4.1％，小于生物学变异度导出的中等的允许偏倚(7.82％)，绝对偏倚均值为-0.2。各相关直线的相关系数均为1.000，斜率接近于1，截距接近于0，如表4所示。

表3 TSH国际标准物质(WHO 81/565)稀释后各点与认证值的偏差

表4 TSH国际标准物质(WHO 81/565)稀释后的标准曲线

本发明所提供的粉末状TSH国际标准物质应用方法，可用于厂商校准品的赋值和室间质评机构的正确度验证。采用适当的稀释液溶解粉末状的国际标准物质，整个过程都采用称重法，采用临床常用的检测系统进行检测。实验结果证明，本发明方法设计严密，易于实行，为一种正确利用密封在安瓿瓶中的定值国际标准物质新方法。