一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备及外泌体乳霜的制备方法

摘要

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备及外泌体乳霜的制备方法，其中制备方法包括：将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养；直到细胞达60％‑70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12‑16h；将无血清的饥饿培养液换为含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液，梯度离心，将离心所得的上清液用滤器过滤。将得到的人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方配置得到乳霜。本发明制备的乳霜能够改善细胞分裂并分泌出大量的细胞外基质帮助完成肌肤细胞的更新，改善细胞状态。

说明书

技术领域

本发明涉及护肤品领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法及外泌体乳霜的制备方法。

背景技术

人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesnchymalstem cells，hUCMSC)是来源于新生儿脐带组织的一种具有自我更新能力、多向分化多潜能和较强免疫调节功能的间充质干细胞，它具有干细胞的所有共性。通过体外无血清培养上清的蛋白质组学分析发现，UCMSC可分泌数百种涉及细胞生长、分化、合成、代谢相关的因子，其中至少有30种以上可促进损伤组织的原位细胞分裂增殖、血管再生、抑制炎症反应等有利于促进损伤修复的因子，hUCMSC能分泌多种细胞因子和外泌体。外泌体(exosome，Exo)活细胞分泌的直径为30-150nm的双层膜性囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为″exosome″，即外泌体。外泌体起源于细胞内吞过程中形成的内体，最后再从细胞中释放到胞外。人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，外泌体广泛存在并分布于各种体液中(包括血液、唾液、尿液和母乳)，作为重要的传递信号分子，形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递系统，如图1a-图1b所示。研究表明hUCMSC来源的外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质类物质等，具有组织修复、免疫调节等多种功能。与传统的干细胞疗法不同，外泌体是活细胞分泌的囊泡，因此在被注射到身体的受损伤部位后，不会发展成为癌细胞。因此，外泌体作为替代间充质干细胞治疗的新策略正在迅速获得重视，并且能够克服细胞治疗中的诸多风险和困难。

目前市场上大多数美容制剂的活性成分单一，个体针对性不强，产品效果不佳，只是通过遮掩瑕疵或在皮肤的表层起作用，且产品同质化严重。而hUCMSC来源的外泌体内含细胞生长和分化所需要的各种营养和物质信息，可快速激活人体的修护系统，根据不同肌肤问题进行智能修护和护理。因此，开发一种能够发挥媲美干细胞因子的最佳修护功效的美容制剂是亟待解决的问题。

中国专利文献CN110317783A公开了一种脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法和护肤品。该脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法包括以下步骤：培养脐带间充质干细胞，在细胞融合度为85％～95％时，收集培养上清；去除培养上清中的脐带间充质干细胞、细胞碎片和细胞器，得到粗提液；用孔径为0.22μm的滤膜过滤粗提液，得到滤液；及在将滤液离心，得到脐带间充质干细胞的外泌体。上述脐带间充质干细胞的外泌体的制备方法得到的外泌体的产量多且纯度高。护肤品以质量份数计，透明质酸的份数为1份～5份、甘油的份数为5份～15份、胶原蛋白的份数为0.5份～2份、茶多酚的份数为0.2份～1份，寡肽-5的份数为0.1份～0.5份，白细胞提取物的份数为0.01份～0.02份，脐带间充质干细胞的外泌体的份数为0.001份～0.1份。

中国专利文献CN110548001A公开了一种含脐带间充质干细胞外泌体的修复抗衰护肤品，包括以下成分：间充质干细胞外泌体、甘露醇、EDTA-2Na、黄原胶、丁二醇、甘油、水溶性霍霍巴油、橄榄油、聚二甲基硅氧烷、羟乙基纤维素、氢化卵磷脂、枯草杆菌脂肽钠、PCANa、尿素、透明质酸、β-葡聚糖、干细胞分泌素、血清白蛋白、神经酰胺-2和水。其中间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：A、取胎盘，分离出绒毛膜，用PBS缓冲液冲洗去除红细胞，将绒毛膜剪成10～20mm

中国专利文献CN107510098A公开了一种含有干细胞外泌体的电子烟烟液及其制备方法与应用，涉及电子烟。其原料组成按质量百分比为：65％～80％丙二醇、1％～2％香料、15％～20％甘油、5％～15％水，另外包含脐带间充质干细胞外泌体，脐带间充质干细胞外泌体的含量为1mg/g。脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：将P3代脐带间充质干细胞种植于T175细胞培养瓶中，当细胞融合后清洗，然后更换无血清培养基继续培养，收集细胞上清用于外泌体分离制备；然后根据CapturemTMExosome Isolation Kit的使用说明进行外泌体的分离制备。

发明内容

有鉴于此，为解决上述技术问题，本发明的目的在于提出一种一种人脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法及外泌体乳霜的制备，用人脐带间充质干细胞外泌体提取液制备的乳霜能够改善细胞分裂并分泌出大量的细胞外基质帮助完成肌肤细胞的更新，改善细胞状态。

所采用的技术方案为：

一种脐带间充质干细胞外泌体提取液的制备方法，包括如下步骤：

S1.将人脐带间充质干细胞置于培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养；

S2.直到细胞达60％-70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12-16h；

S3.将无血清的饥饿培养液换为含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF和角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液；

S4.将细胞培养上清液梯度离心，将离心所得的上清液用滤器过滤，得到人脐带间充质干细胞外泌体提取液。

进一步地，S3中，含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，其细胞因子浓度为10-20ng/ml。

进一步地，S1中，人脐带间充质干细胞是以脐带组织块为原代，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1:3的比例进行传代培养，选择P2-P5代的人脐带间充质干细胞。

进一步地，S1中，人脐带间充质干细胞是以脐带组织块为原代，原代的细胞培养环境是VitroGel 3D与DMEM培养基混合形成的多糖水凝胶体系，其中VitroGel 3D的稀释比例为1:1，然后与DMEM培养基的混合体积比例为4:1。

一种乳霜，包括上述方案所述的制备方法所制得的脐带间充质干细胞外泌体提取液，以及乳霜基础配方，所述人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方的质量比为1：10-30。

进一步地，所述基础配方包括质量百分比如下的成分：

保湿剂 12％-15％

柔润剂 7％-12％

皮肤调理剂 5％-10％

乳化剂 4％-7％

防腐剂 1％-3％

pH调节剂 0.5％-1％。

进一步地，所述皮肤调理剂包括胶原蛋白、表皮细胞生长因子、透明质酸、维生素B3、阿魏酸中的一种或几种。

进一步地，所述保湿剂包括甘油、甘氨酸、精氨酸、乳酸、丙二醇、丁二醇、山梨醇、透明质酸钠、海藻提取物、生育酚中的一种或几种。

进一步地，所述柔润剂包括环己硅氧烷、角鲨烷、异十二烷、油醇油酸酯、油醇、胆甾醇、氢化椰油、氢化棕榈油、鲸蜡硬酸酯醇、鲸蜡醇乙基己酸脂、三羟甲基丙烷三异硬脂酸酯、二苯基甲硅烷氧基苯基聚三甲基硅氧烷中的一种或几种。

进一步地，所述乳化剂包括硬脂醇、辛基十二醇、甘油硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-8二异硬脂酸酯、聚山梨醇酯-20、PEG-7橄榄油羧酸钠、月桂醇聚醚-7中的一种或几种；

所述防腐剂包括苯氧乙醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯、甲基氯异噻唑啉酮中的一种或几种；

所述pH调节剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、偏磷酸钠、碳酸钠、氢氧化钠中的一种或几种。

本发明的有益效果在于：

1.在制备方法中，本发明用表皮生长因子(EGF，主要作用于表皮受损肌肤的修复与再生)，成纤维细胞生长因子(FGF，能刺激胶原蛋白产生)，角质细胞生长因子(KGF，能促进角质层生长)等多种细胞因子，诱导hUCMSC大量合成和分泌外泌体。

2.该hUCMSC的分泌体用于乳霜中，所制备的乳霜能够改善细胞分裂并分泌出大量的细胞外基质帮助完成肌肤细胞的更新，改善细胞状态，防止细胞衰老和缺水，恢复皮肤细胞再生与分泌能力，重回年轻肌肤的水润状态。

附图说明

图1a为外泌体示意图；图1b为外泌体在细胞-细胞之间信息传递图。

图2a为VitroGel 3D凝胶扫描电镜图；图2b为VitroGel 3D-RGD凝胶扫描电镜图；图2c-图2d为即用型可控水凝胶系统VitroGel 3D细胞培养图。

无动物源性多糖水凝胶，可高度模拟天然的细胞外基质(ECM)环境，其诸多优点填补了体外和体内研究间的鸿沟。VitroGel 3D-RGD是RGD肽修饰的VitroGel 3D，细胞粘附性更好。

图3为VitroGel 3D水凝胶与DMEM培养基在不同的稀释和混合比例下水凝胶的强度图。

稀释后的水凝胶与细胞培养基不同的混合比例影响最终的成胶速度和凝胶强度。在相同的凝胶稀释比例下，混合的培养基体积越大，凝胶形成速度越快(凝胶形成速度：2：1＞3：1＞4：1(混合比例)。稀释比例:即用型水凝胶的稀释比(v/v)，混合比例：水凝胶溶液与细胞悬液的混合比例(v/v)图。

图4为外泌体超速离心分离图。

超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。

图5a-图5c为外泌体具有促进成纤维细胞新生和胶原合成的效果的实验结果图。

通过细胞划痕试验，观察外泌体对成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。来自骨髓间充质干细胞(MSC)和成纤维细胞(HDFs)的外泌体都能显著促进成纤维细胞的增殖并增加胶原的合成。

图6为乳霜涂抹在小鼠皮肤，使得皮肤皱纹更细，减少紫外线暴露皱纹，胶原蛋白合成增强的照片。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明优选的实施例，而不是全部的实施例。这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

一.hUCMSC类器官(Organoid)环境培养

VitroGel

脐带采集的操作过程是严防污染发生的关键环节。采集脐带用的物料、容器应使用无菌器材。脐带采集前检查采集容器是否完整，封口是否严密。采集脐带时必须无菌操作，应在胎儿娩出后，立即截取脐带并将脐带置于事先分装有基础培养基的无菌塑料采集管内，拧紧采集管的螺旋盖并用封口膜封口，如果脐带较长，可剪断分多个管放置，盖好瓶盖后，在容器外贴上标签，将置于专用运输箱或袋中，尽可能快地将脐带转运到实验室。

hUCMSC类器官(Organoid)环境培养，模拟天然细胞外基质(ECM)环境的类器官培养环境，VitroGel 3D与DMEM培养基在不同稀释和混合比例(稀释与混合比是v/v比)下的水凝胶强度不同。有研究表明，不同基质硬度能够影响细胞的行为，Vitrogel可更好地模拟不同器官的基质硬度。

类器官的培养环境更适合hUCMSC生长合成外泌体，同时，模拟的体内环境更有利于丰富外泌体内容物，在改善皮肤的年轻状态更有优势。与2D细胞扩增相比，这些环境模拟的3D培养的产生的胶原蛋白含量更高、更有效的外泌体。

二、脐带间充质干细胞的原代培养

1.在无菌条件下取脐带一根，转移入50ml离心管中加入生理盐水反复冲洗3遍以上，最后用双抗水浸泡5～10分钟，用生理盐水冲洗干净后，在无菌的培养皿中，用镊子配合剪刀去除被膜、血管等，再用生理盐水冲洗去除血液和杂质。如果是制备临床应用细胞，必须是取自检查合格的脐带，最低检测标准至少应符合临床输血要求，HIV、HBV、HCV、梅毒、CMV检测为阴性的健康产妇。

2.用高压灭菌过的眼科虹膜剪将组织分离为0.5cm长的组织块若干，再将组织块转移至一个1.5ml EP管内，用虹膜剪将EP管内的组织剪碎至糊状，一般使组织块在1mm

3.加入等量DMEM/F12(GibcoDulbecco's Modified Eagle Medium：F-12)基础培养基，直接将EP管内的糊状组织接种于培养瓶中，瓶内预先制备好上述所述的多糖水凝胶体系。一个EP管对应一个T175的培养瓶，然后加入10ml已调整好pH值的含10％FBS的完全DMEM/F12培养液，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5％CO

4.静置培养24小时后，在倒置显微镜下观察，组织块贴壁牢固后，可补加完全培养基10～15ml之后3～4天换1次培养液，静置培养7～9天后，可见大量细胞贴壁。此时，用吸管轻轻吸出一半培养液，轻轻摇晃培养瓶，使组织块脱离瓶底，吸弃上清和悬浮组织块并接种于新培养瓶中加入新鲜10％FBS的完全DMEM/F12培养液继续进行贴壁培养，密切观察细胞生长情况，依据细胞生长情况每隔3～4天换液1次。

5.第1次贴壁培养成功并更换培养液时，可用吸管反复吹打，使微组织快脱落，再将脱落下来的组织块接种至相同面积的另一塑料培养瓶的瓶底进行贴壁培养。同一脐带组织块至少可反复进行3次重复贴壁培养，即可获得常规培养3倍数量以上的原代UCMSC。

6.脐带组织块培养后2周左右，细胞可长满瓶底，达到80％以上融合，此时可用吸除培养基，加入适量0.25％的胰酶，充分摇晃均匀，置于37℃培养箱中放置5分钟，注意观察细胞形态变化，发现细胞收缩，摇晃培养瓶有片状细胞脱落时，立即加入含10％血清的培养液10～15ml终止反应，用吸管吹打使细胞完全脱落，然后将细胞悬液移入离心管中，300～400×g离心10分钟，再加入生理盐水10ml，离心洗涤，反复3次后，计数活细胞，用完全培养基稀释，收集细胞进行冻存或继续传代培养。传代培养的过程是纯化间充质干细胞的过程。

7.传代培养通常采用专用细胞培养瓶，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1:3的比例进行传代培养。作者所在实验室创建了一种以脐带组织块培养法为基础的高效大规模体外制备技术，组织块可反复接种培养3次以上，获得原代细胞的数量在1×10

三、多种干细胞因子组合诱导hUCMSC分泌外泌体和外泌体提取

将得到的P2-P5代的人脐带间充质干细胞置于37℃培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养，直到细胞达60％-70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12～16h，将无血清的饥饿培养液换为含有表皮细胞生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF、角质细胞生长因子KGF的DMEM/F12培养液，细胞因子浓度为10ng/ml，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液300g、10000g梯度离心60～120min，将离心所得上清液用0.22μm滤器过滤，得到人脐带间充质干细胞外泌体提取液，如图4所示。

一种具体步骤如下：

1.将收集到的细胞上清液约100ml分装于2个50ml离心管中，4℃，300×g离心10分钟除去残余细胞。

2.2000×g离心10-20分钟除去细胞碎片。

3.小心收集上清并用0.22μm孔径过滤器进行过滤。

4.将收集到的上清液加入装有100000NW-CO超滤膜的Model18050旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下。

5.打开磁力搅拌器，使涡漩高度为液体高度的1/3。

6.待上清液超滤完毕后加入50mlPBS并再次超滤，重复3次。

7.超滤完毕后，用0.5mlPBS重悬超滤膜上的外泌体，并转移至1.5ml的EP管中。-80℃冰箱中保存备用。

该人脐带间充质干细胞外泌体提取液是多种干细胞因子EGF、FGF和KGF组合诱导外泌体的合成和分泌。表皮生长因子(EGF)能促进细胞增殖和胞外基质合成，增强细胞活性。主要用于促进受损表皮的修复与再生，提高肌肤愈合速率，美容抗衰，诱导成熟细胞逆分化，如图5a-图5c。成纤维细胞生长因子FGF则能刺激胶原蛋白产生，角质细胞生长因子(KGF)，其作用原理是：

1.促进皮肤组织的生长繁殖；

2.通过与细胞表面特异受体结合调控皮肤上皮、内皮和基质细胞的分裂增殖和生长分化，促进细胞的代谢，增强氧化作用；

3.促进与皮肤损伤有关细胞的迅速增殖，并调节细胞间基质(如胶原蛋白等)的合成与分泌及分解，从而促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基底层的修复，组织培养时，促进人体皮肤上皮细胞生长；

4.增强表皮细胞的蛋白质及RNA的合成能力和细胞正常代谢；

5.具有延缓皮肤细胞衰老、促使人皮肤细胞的修复和生长的作用，使皮肤光滑丰润，如图6。这些细胞因子比传统的单因子刺激诱导更具有效率、具有细胞活性，诱导hUCMSC大量合成和分泌外泌体，能全方位地从表层肌肤到深层肌肤修护受损肌肤，刺激新的年轻活力细胞再生，皮肤缺陷组织回复到先前年轻时的正常形态，使得皮肤肌肤光滑饱满，吹弹可破。

该人脐带间充质干细胞外泌体提取液可智能型修复受损的皮肤，改善皮肤环境。外泌体可根据皮肤的受损状态，受外源性的因子刺激，外泌体内的营养因子分泌到细胞间质，改善皮肤的细胞外环境，对受损的皮肤细胞进行智能型修复，改善皮肤的生存状态，使得皮肤回到年轻的娇嫩，细胞外基质得以改善和修改。

四.人脐带间充质干细胞外泌体外用乳霜制备

人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方质量比为1：30～1：10配置，并低温保存；该基础配方包括质量百分比如下的成分：

保湿剂 12％-15％

柔润剂 7％-12％

皮肤调理剂 5％-10％

乳化剂 4％-7％

防腐剂 1％-3％

pH调节剂 0.5％-1％。

皮肤调理剂包括胶原蛋白、表皮细胞生长因子、透明质酸、维生素B3、阿魏酸中的一种或几种。

保湿剂包括甘油、甘氨酸、精氨酸、乳酸、丙二醇、丁二醇、山梨醇、透明质酸钠、海藻提取物、生育酚中的一种或几种。

柔润剂包括环己硅氧烷、角鲨烷、异十二烷、油醇油酸酯、油醇、胆甾醇、氢化椰油、氢化棕榈油、鲸蜡硬酸酯醇、鲸蜡醇乙基己酸脂、三羟甲基丙烷三异硬脂酸酯、二苯基甲硅烷氧基苯基聚三甲基硅氧烷中的一种或几种。

乳化剂包括硬脂醇、辛基十二醇、甘油硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-8二异硬脂酸酯、聚山梨醇酯-20、PEG-7橄榄油羧酸钠、月桂醇聚醚-7中的一种或几种。

防腐剂包括苯氧乙醇、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯、甲基氯异噻唑啉酮中的一种或几种。

pH调节剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、偏磷酸钠、碳酸钠、氢氧化钠中的一种或几种。

通过人脐带间充质干细胞外泌体为P2-P5代人脐带间充质干细胞经培养后的提取液，用EGF、FGF和KGF组合细胞生长因子刺激后提取获得。人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方质量比为(1：30)～(1：10)配制成乳霜，使得外用乳霜能适应更多的皮肤状态，有适应的弹性空间，能够使皮肤细胞找到舒适的胞外环境。

实施例1

一种乳霜，由上述制备的人脐带间充质干细胞外泌体提取液，以及乳霜基础配方混合配置而成，人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方的质量比为1：10；

该基础配方由质量百分比如下的成分组成：

保湿剂 12％

柔润剂 7％

皮肤调理剂 5％

乳化剂 4％

防腐剂 1％

pH调节剂 0.5％

去离子水 余量。

实施例2

一种乳霜，由上述制备的人脐带间充质干细胞外泌体提取液，以及乳霜基础配方混合配置而成，人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方的质量比为1：20；

该基础配方由质量百分比如下的成分组成：

保湿剂 14％

柔润剂 10％

皮肤调理剂 8％

乳化剂 6％

防腐剂 2％

pH调节剂0.8％

去离子水 余量。

实施例3

一种乳霜，由上述制备的人脐带间充质干细胞外泌体提取液，以及乳霜基础配方混合配置而成，人脐带间充质干细胞外泌体提取液与乳霜基础配方的质量比为1：30；

该基础配方由质量百分比如下的成分组成：

保湿剂 15％

柔润剂 12％

皮肤调理剂 10％

乳化剂 7％

防腐剂 3％

pH调节剂 1％

去离子水 余量。

实验测试：

将实施例1、实施例2或实施例3的乳霜涂抹在小鼠皮肤表面，观察小鼠皮肤表面变化，结果参见图6所示。

乳霜在小鼠皮肤，使得皮肤皱纹更细，减少紫外线暴露皱纹，胶原蛋白合成增强。

小鼠暴露于紫外线B(UVB)光下，这会加速衰老并导致皱纹形成。与未治疗的小鼠或接受局部视黄酸(一种标准的抗衰老药物)的小鼠相比，治疗的小鼠显示出明显更细，更浅的皱纹。与未经处理的小鼠的皮肤相比，经外泌体处理的小鼠的皮肤更厚，并显示出减少的炎症和增强的胶原蛋白合成。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。