一种具有抑制肥胖作用的多肽及其应用

摘要

本发明公开了一种具有抑制肥胖作用的多肽及其应用，该多肽命名为TAT‑MC4R1，为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。本发明提供的多肽TAT‑MC4R1来源于MC4R1受体羧基末端氨基酸序列，TAT‑MC4R1能够在激动剂作用于MC4R1受体时，和MC4R1受体羧基末端序列竞争性的被G蛋白偶联受体激酶磷酸化，TAT‑MC4R1磷酸化后能够与β‑arrestin 2相结合，替代MC4R1受体和β‑arrestin 2发生相互作用，从而对肥胖及其诱发的糖尿病等并发症产生抗性。本发明的多肽TAT‑MC4R1在减肥和预防糖尿病等肥胖并发症过程中具有应用潜力。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有抑制肥胖作用的多肽及其应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，加上不健康的生活方式，肥胖越来越成为一个值得关注的问题。由于肥胖导致的诸如糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病，严重威胁人类的健康。目前已经发现多种分子机制参与调控体重，并基于此发现了多种减肥治疗方案，然而，这些药物或者缺乏靶标专一性，或者能够影响靶蛋白下游的多种信号通路，产生多种副作用，而不能长期使用。所以，安全高效的减肥方法是目前急需的。

G蛋白偶联受体(GPCR)是市场上大约30％的药物的作用靶标，也是新药研发的重要靶向。一般当GPCR和配体结合后，会通过与GTP结合蛋白(简称G蛋白)互作，传导信号，调控基因转录，其后涉及GRKs(GPCR kinases)磷酸化和β-arrestin蛋白质结合，结合β-arrestin后将抑制G蛋白和GPCR的相互作用。

研究证实黑皮质素4受体(melanocortin 4receptor，MC4R)是参与体重调控的重要GPCR，进食后会诱发黑皮质素肽、α和β-促黑激素的释放，进而激活MC4R表达的神经元，从而减少进食。啮齿类动物中靶向敲除MC4R基因会导致体重增加。一些肥胖的孩童和成年人中则检测出MC4R基因突变，突变体导致Gα

通过研究发现某些MC4R突变体与肥胖密切相关，因为这些突变体会导致MC4R功能丧失，和MC4R基因敲除有类似的功效。当然，也发现某些功能获得的MC4R突变体与低BMI和降低患肥胖、二型糖尿病及冠状动脉疾病几率等密切相关。

β-arrestin 2的结合能够将MC4R从G蛋白上释放，进而促使MC4R脱敏、内吞。而选择性干扰β-arrestin 2和MC4R的相互作用，阻止β-arrestin 2到MC4R的聚集，可能阻止MC4R脱敏和内吞，消除影响。因此，研究和开发阻断β-arrestin 2和MC4R相互作用的干扰多肽，将具有很好的减肥作用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有抑制肥胖作用的多肽，能够进入细胞内靶向结合β-arrestin 2，从而阻断β-arrestin 2和MC4R的相互作用。

为实现上述目的，本发明提供一种具有抑制肥胖作用的多肽，名称为TAT-MC4R1，为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。

其中，序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列由29个氨基酸残基组成，序列1中第1-11位氨基酸残基组成具有穿透细胞膜作用的区域，该区域可以被具有相同作用的其他序列替换；序列1中第12-39位氨基酸残基构成能够取代MC4R1受体和β-arrestin 2蛋白质结合的区域。

本发明的第二个目的是提供编码所述多肽的核酸分子。

为实现上述目的，本发明所提供的编码所述多肽的核酸分子，为SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

其中，序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的长度为120bp，其编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：1所示的多肽。

本发明的第三个目的是提供含有所述多肽的编码核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

本发明的第四个目的是提供所述多肽和/或所述核酸分子在制备减肥和预防肥胖并发症产品中的应用。

所述肥胖并发症包括糖尿病、高血压、动脉粥样硬化。

本发明还提供一种具有减肥和预防肥胖并发症作用的产品，其活性成分为所述的多肽和/或所述的核酸分子。

所述产品的给药方式包括口服、腹腔注射、静脉注射或鞘内注射等。

本发明提供的多肽TAT-MC4R1来源于获得功能MC4R1受体突变体的羧基末端，所述多肽TAT-MC4R1能够在黑皮质素作用于MC4R1受体时，和MC4R1受体羧基末端竞争性的被G蛋白偶联受体激酶(GRK)所磷酸化，所述多肽TAT-MC4R1磷酸化后能够与β-arrestin 2相结合，取代MC4R1受体和β-arrestin 2之间的相互作用。本发明的多肽TAT-MC4R1在肥胖及其并发症如糖尿病等的预防和治疗中具有保健应用潜力。

附图说明

图1为MC4R1肽段序列和β-arrestin 2之间的相互作用。

图2为TAT-MC4R1肽段对小鼠进食量的影响。

图3为TAT-MC4R1肽段对小鼠体重的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的分子生物学方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中HEK293细胞来源于ATCC(美国模式培养物集存库)，昆明种实验小鼠，体重20-25g，均为健康雄性小鼠，来源于徐州医科大学实验动物中心。

实施例1多肽TAT-MC4R1的获得

(1)哺乳动物细胞双杂交

将MC4R1多肽片段和pBIND的重组子(上游引物5'CTCAGTCTAGACGGAGTCAAGAACTGAGGAAAACCTTCAAAGAGATCGTCTGTT 3'(SEQ ID NO.3)和下游引物5'CATCGGGTACCATATCTGCTAGACAAGTCACAAAGGCCTCCCAGGGGATAGCAACAGACGATCTCTTTGAAGG 3'(SEQ ID NO.4))，与β-arrestin 2和pACT的重组子(上游引物5'CTCAGTCTAGAATGGGAGAAAAACCCGGGAC 3'(SEQ IDNO.5)和下游引物5'CATCGGGTACCCTAGCAAAACTGGTCATCACAGTCA 3'(SEQ ID NO.6))和报告基因载体pG5luc，共转染HEK293细胞，加入1μM NDP-αMSH处理细胞，继续培养48h之后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Beyotime RG009)使用GloMax-Multi detection system(Promega)检测荧光素酶的活性。

由图1结果可知，MC4R1多肽片段能够与β-arrestin 2发生相互作用，这种相互作用依赖于激动剂的存在。

(2)具有穿膜活性的TAT-MC4R1多肽获得

通过PCR获得MC4R1受体羧基末端多肽序列，其上游引物：CCATCTCGAGATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTCGGAGTCAAGAACTGAGGAAAACCTTCAAAGAGATCGTCTGTT(SEQ IDNO.7)，下游引物：5'CGTCGGATCCATATCTGCTAGACAAGTCACAAAGGCCTCCCAGGGGATAGCAACAGACGATCTCTTTGAAGG 3'(SEQ ID NO.8)，在上游引物内插入TAT编码序列，在上下游引物分别加入XhoI和BamHI酶切位点，通过酶切连接法构建大肠杆菌表达载体pWaldo-TAT-MC4R1，转化BL21(DE3)获得重组子。

接种重组子菌株于500ml LB培养基中，37℃培养过夜，转种50ml培养物至1L LB培养基中，37℃培养至OD

将细胞悬浮于100ml裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl，pH 7.5；300mM NaCl和5％甘油)，加入50μg/ml溶菌酶，200U DnaseI和1片蛋白酶抑制剂(cocktail)，1200bar高压破碎细胞，10,000rpm，4℃离心30min去除细胞碎片；将上清与已经平衡的Ni-NTA柱子结合(平衡缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 7.5；300mM NaCl和5％甘油)，让含有目的蛋白质的样品自然通过柱子；冲洗缓冲液(20mM Tris-HCL，pH 7.5，300mM NaCl，5％甘油和30mM咪唑)洗100ml，再用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCL，pH7.5，300mM NaCl，5％甘油和300mM咪唑)洗脱，收集蛋白质样品，通过AKTA pure M系统分子筛柱子(缓冲液：20mM Tris-HCL，pH7.5，300mM NaCl，5％甘油)进行纯化，此步骤能够获得较高纯度的TAT-MC4R1多肽和GFP融合的产物。

为了进一步获得TAT-MC4R1多肽，收集的蛋白质样品加入200μl浓度为3mg/ml的TEV(烟草花叶病毒)蛋白酶，4℃酶切过夜。样品重新通过Ni柱，将没有酶切完全的含有GFP的蛋白质和酶切后的GFP去掉。最终收集的TAT-MC4R1多肽样品，通过截留分子量1,000的浓缩管，浓缩至5mg/ml左右。SDS-PAGE检测样品的纯度>95％，可以用于功能研究。纯化的多肽TAT-MC4R1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2多肽TAT-MC4R1的应用研究

小鼠每天腹腔注射10mg/kg的TAT-MC4R1多肽，对照组给与等量对照多肽，连续给药15天，检测小鼠进食情况和小鼠体重变化。

由图2、图3可知，TAT-MC4R1能够明显减少小鼠进食量，促使小鼠体重降低。且给予多肽后与对照组相比，小鼠健康未发现明显异常。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种具有抑制肥胖作用的多肽及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Ser Gln Glu Leu

1 5 10 15

Arg Lys Thr Phe Lys Glu Ile Val Cys Cys Tyr Pro Leu Gly Gly Leu

20 25 30

Cys Asp Leu Ser Ser Arg Tyr

35

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggtcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgtcggagtc aagaactgag gaaaaccttc 60

aaagagatcg tctgttgcta tcccctggga ggcctttgtg acttgtctag cagatattaa 120

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcagtctag acggagtcaa gaactgagga aaaccttcaa agagatcgtc tgtt 54

<210> 4

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catcgggtac catatctgct agacaagtca caaaggcctc ccaggggata gcaacagacg 60

atctctttga agg 73

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcagtctag aatgggagaa aaacccggga c 31

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catcgggtac cctagcaaaa ctggtcatca cagtca 36

<210> 7

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccatctcgag atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgtcgga gtcaagaact 60

gaggaaaacc ttcaaagaga tcgtctgtt 89

<210> 8

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgtcggatcc atatctgcta gacaagtcac aaaggcctcc caggggatag caacagacga 60

tctctttgaa gg 72