一种新型广谱抗病毒靶点及用于靶向该抗病毒靶点的药物

摘要

本发明提供一种新型广谱抗病毒靶点及用于靶向该抗病毒靶点的药物，所述的抗病毒靶点为线粒体，所述的药物为核苷酸、肽、蛋白、抗体或其他影响线粒体功能的化合物中的至少一种；本发明阐明了密码子偏好性对病毒相关蛋白特别是富含稀有密码子的病毒蛋白如SARS‑CoV‑2刺突、11型腺病毒鞭毛等蛋白丰度的影响，首次证实了病毒感染引起的线粒体功能改变以及病毒RNA的线粒体定位是病毒蛋白翻译所必需的，使用线粒体靶向药物能够抑制病毒相关蛋白的翻译及病毒复制，本发明为广谱抗病毒药物的研发提供了新的策略，新的治疗靶点，也为防治新冠肺炎提供了新的理论依据。

说明书

技术领域

本发明属于病毒学、生物信息学、及分子生物学领域，具体涉及一种新型广谱抗病毒靶点及用于靶向该抗病毒靶点的药物。

背景技术

病毒具有高度寄生性，其生存与复制依赖于宿主细胞的转录、翻译以及能量代谢系统，并通过劫持宿主细胞完成从侵入到复制再到装配裂解的过程。目前针对病毒感染的治疗药物主要分为病毒复制抑制剂（抗病毒药）、病毒感染阻断药物和平衡宿主免疫应答的免疫调节剂，这也是治疗新冠病毒肺炎的主要策略。根据病毒感染宿主细胞的过程，抗病毒药根据其作用机制可分为病毒穿入/脱壳抑制剂、DNA多聚酶抑制剂、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂以及干扰素等其他广谱抗病毒药物。最新研究证实逆转录酶抑制剂瑞德西韦可通过阻断RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的活性进而抑制SARS-CoV-2的复制。然而HIV 3C蛋白酶抑制剂洛匹那韦/利托那韦尽管在过往研究中体外具有抗SARS-CoV活性，但在治疗SARS-CoV-2感染患者时并未观察到明显疗效，这也致使全球科学家开始筛选开发基于SARS-CoV-2蛋白酶的抑制药物。然而，这一临床结果也提示，虽然不同病毒来源的一些关键蛋白具有保守型，但其在结构和识别基序上的差异将限制抗病毒药物的广谱性，因此单纯基于病毒特异性蛋白进行抗病毒药物的开发存在一定的局限性。

核糖体介导的mRNA-蛋白质翻译过程是机体最重要的生物学过程之一。大量研究表明，密码子偏好性可通过影响核糖体上mRNA的运输、稳定性以及蛋白质折叠调控蛋白质表达。由于大多数病毒无tRNA编码序列，其蛋白翻译依赖于宿主细胞，因此病毒密码子使用偏好性对于病毒复制以及宿主的选择至关重要。此外，突变压力和自然选择引起的病毒密子偏好性的变化也已被用于病毒进化学的研究。近年来的研究发现，病毒感染可以操纵宿主tRNA使其更加适合病毒蛋白翻译，干扰这一过程可以显著限制病毒的复制。我们前期研究也表明密码子的优化对于新冠病毒刺突蛋白（Spike，S）的表达十分重要，提示病毒蛋白翻译或tRNA相关途径是抗病毒潜在新靶点。

线粒体是生物体内主要的能量代谢细胞器，广泛介导细胞各种生物过程，如程序性细胞死亡，ATP生成，钙稳态等。人类线粒体基因组仅包37个基因，其中2个是核糖体RNA（rRNA），22个 tRNA基因和13种蛋白质编码基因。哺乳动物的线粒体DNA（mtDNA）无内含子序列及保护性组蛋白，且对AT具有较高偏好性，使得线粒体具有与核基因组不同的密码子使用频率。此外，研究表明，线粒体可以作为宿主的免疫枢纽，参与病原体相关识别受体触发的信号传导，并诱导宿主细胞产生抗病毒反应。病毒能够诱导宿主线粒体功能障碍并通过代谢重编程来完成其复制周期。最近，SARS-CoV-2感染细胞的基因表达及蛋白互作网络图谱显示，SARS-COV-2感染可诱导线粒体功能相关信号通路高度活化与富集，表明线粒体形态动力学功能异常对于SARS-COV-2感染可能发挥至关重要的作用。最新电镜结果显示，感染细胞的病毒颗粒周围存在大量线粒体，并且部分线粒体内可见SARS-CoV-2病毒颗粒，提示线粒体可能是新冠病毒成熟的关键场所之一。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种新型广谱抗病毒靶点及用于靶向该抗病毒靶点的药物。

本发明采用的技术方案为：

一种新型广谱抗病毒靶点，所述的抗病毒靶点为线粒体。

所述的病毒的RNA 的5’前导序列(或称5’UTR)和3’UTR序列具有线粒体定位信号或其他线粒体定位信号的核酸序列。

本发明所述的病毒为DNA或RNA病毒，且具有与人线粒体相似的密码子偏好性。所述的病毒包括但不局限于SARS-CoV-1、SARS-CoV-2，CoV-229E、CoV-N63、Influenza A 、Influenza B、 Influenza C、Ebola、Nipah、Lassa、HIV、Adenovirus 5、Adenovirus 11、HBV、HCV、HPV。

所述的病毒的RNA进入线粒体后通过影响线粒体本身或相关信号通路从而影响病毒蛋白翻译。

一种用于靶向如上所述的新型广谱抗病毒靶点的药物，所述的药物为核苷酸、肽、蛋白、抗体或其他影响线粒体功能的化合物中的至少一种。

所述的药物为虎杖苷（polydatin）、氯尼达明（Lonidamine）或其同类衍生物中的至少一种。

本研究发现新冠病毒（SARS-CoV-2）的刺突蛋白S、包膜蛋白E、非结构蛋白6（ORF6）和非结构蛋白8（ORF8）的过表达质粒的表达丰度较低，而膜蛋白M、核基质蛋白N、非结构蛋白3（ORF3）及非结构蛋白7（ORF7）过表达质粒表达丰度较高，而蛋白表达丰度的高低与稀有密码子偏好性密切相关。

本研究还发现多种常见病毒的密码子偏好性与人线粒体密码子使用情况更为相似，病毒RNA通过5’前导序列、3’非转录区（UTR）或其他序列如RNA加工内切核酸酶结合序列引起的线粒体定位能够促进病毒相关序列特别是富含稀有密码子序列的蛋白表达，靶向线粒体的相关药物可抑制病毒蛋白的表达及病毒复制。

本发明所提供的新型广谱抗病毒药物的研发策略为抑制病毒关键蛋白的表达，所提供的抗病毒药物的新靶点为线粒体。

本发明所述蛋白表达序列为富含稀有密码子的病毒序列，优选的上述病毒序列表达的蛋白为SARS-CoV-2的刺突蛋白/Spike（RNA病毒）、11型腺病毒（Adenovirus 11）鞭毛蛋白/Fiber（DNA病毒）。

本发明提供了线粒体靶向药物在抗病毒治疗中的应用。

优选的，上述线粒体靶向药物为己糖激酶、线粒体丙酮酸载体、质膜单羧酸转运蛋白抑制剂、G6PD抑制剂、抗氧化剂。

优选的上述己糖激酶、线粒体丙酮酸载体和质膜单羧酸转运蛋白抑制剂为氯尼达明。所述G6PD抑制剂、抗氧化剂为虎杖苷。

本发明还提供了氯尼达明和虎杖苷在抗病毒中的应用。

本发明的有益效果是：本发明阐明了密码子偏好性对病毒相关蛋白特别是富含稀有密码子的病毒蛋白如SARS-CoV-2刺突、11型腺病毒鞭毛等蛋白丰度的影响，首次证实了病毒感染引起的线粒体功能改变以及病毒RNA的线粒体定位是病毒蛋白翻译所必需的，使用线粒体靶向药物能够抑制病毒相关蛋白的翻译及病毒复制，本发明为广谱抗病毒药物的研发提供了新的策略，新的治疗靶点，也为防治新冠肺炎提供了新的理论依据。

附图说明

图1：Western Blot 验证SARS-CoV-2来源序列在人HEK293细胞中的表达丰度。

图2：免疫荧光化学法检测SARS-CoV-2来源序列在人A549细胞中的表达。

图3：稀有密码子影响SARS-CoV-2相关序列的蛋白表达丰度：（A）使用GCUA软件分析8种SARS-CoV-2序列与人标准密码子使用情况的差异性；（B）常见稀有密码子（占比<0.15，频数/千个氨基酸<15）在上述8种SARS-CoV-2病毒序列中出现的次数；（C）不同密码子（不含密码子“ATG”、“TGG”、“TAA”、“TAG”和“TGA”）在SARS-CoV-1、SARS-CoV-2以及8种SARS-CoV-2编码序列中的占比（Fraction）改变倍数的热图（相对于人标准密码子表占比）；（D）野生型刺突蛋白信号肽及密码子优化信号肽（将“Leu”的 4个稀有密码子突变为人高频使用密码子）对刺突蛋白受体结合域（人源密码子优化）蛋白表达的影响。

图4：病毒感染诱导激活通路参与病毒蛋白翻译：(A) UCSC数据库分析稀有密码子Leu-TTA相匹配转运RNA（tRNA）TRL-TAA4-1的基因组特征；(B) TRL-TAA潜在转录调节因子与SARS-CoV-2感染后表达上调基因的重叠分析；(C) 25种SARS-CoV-2感染活化转录因子的表达热图；(D)Western Blot检测与Egr1或ATF2过表达对SARS-CoV-2棘突蛋白表达的影响；（E）R Studio及Metascape分析SARS-CoV-2感染诱导的差异表达基因（GSE147507）主要信号通路富集情况；（F）ACE2、TMPRSS2、ATF2及25种关键转录因子在人肺组织不同细胞中的表达分布。

图5：线粒体定位影响SARS-CoV-2相关序列的蛋白表达：(A) Metascape软件分析刺突蛋白的互作蛋白质的主要富集情况；（B）主要稀有密码子在SARS-CoV-2、SARS-CoV-2刺突蛋白、人基因组（参照人标准密码子表）和人线粒体中使用频率的比较；（C）SARS-CoV-25’前导序列和3’UTR序列对刺突蛋白表达的影响；（D）Western blot分析EGR1、ATF2对含有5’前导序列和3’UTR序列的重组棘突质粒的蛋白表达影响；（E）不同线粒体定位信号（MLS）结构特征及SARS-CoV-2相关序列重组质粒模式图，RNASE P/ RP表示核糖核酸酶P结合序列，RMRP/ MRP表示线粒体RNA加工内切核酸酶结合序列；（F）不同线粒体定位信号对SARS-CoV-2来源序列蛋白表达的影响；（G）EGR1和ATF2对带有RMRP结合基序(MRP)的棘突蛋白表达的影响。

图6：生物信息学比较分析常见病毒对线粒体偏好密码子的使用频率。

图7：线粒体定位信号对11型腺病毒鞭毛蛋白表达的影响：（A）11型腺病毒鞭毛蛋白的密码子偏好性分析；（B）Western Blot 分析线粒体定位信号MRP对腺病毒鞭毛蛋白表达的影响。

图8：线粒体靶向药物抑制11型腺病毒的复制。

图9：线粒体靶向药物虎杖苷及氯尼达明抑制SARS-COV-2刺突蛋白的表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，实例中的实验方法如无特殊规定均为常规方法，所涉及的试剂耗材如无特殊规定均为常规试剂材料。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不是限制本发明的保护范围。本领域技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

一种新型广谱抗病毒靶点，所述的抗病毒靶点为线粒体。

所述的病毒的RNA 的5’前导序列和3’UTR序列具有线粒体定位信号，或其他线粒体定位信号的核酸序列。

所述的病毒包括但不局限于SARS-CoV-1、SARS-CoV-2，CoV-229E、CoV-N63、Influenza A 、Influenza B、 Influenza C、Ebola、Nipah、Lassa、HIV、Adenovirus 5、Adenovirus 11、HBV、HCV、HPV。

所述的病毒的RNA进入线粒体后通过影响线粒体本身或相关信号通路从而影响病毒蛋白翻译。

一种用于靶向如上所述的新型广谱抗病毒靶点的药物，所述的药物为核苷酸、肽、蛋白、抗体或其他影响线粒体功能的化合物中的至少一种。

所述的药物为虎杖苷（polydatin）、氯尼达明（Lonidamine）或其同类衍生物中的至少一种。

实施例1：如图1所示，为用 Western blot 分析SARS-CoV-2来源序列的蛋白表达丰度。

参照NCBI数据库公布序列（MN908947.3）由Sangon Biotech分别合成SARS-CoV-2的4种结构蛋白（刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核基质蛋白N）和4种非结构蛋白（ORF3、ORF6、ORF7和ORF8）并重组克隆至pcDNA3.1-his载体。使用阳离子转染试剂PEI分别将上述重组质粒转染至人HEK-293细胞中进行过表达，并使用Western blot 技术及抗His标签抗体检测各蛋白的表达丰度。

步骤如下：

使用预冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次后，用含蛋白酶抑制剂（PI，罗氏生物）及PMSF的RIPA裂解缓冲液提取细胞全蛋白，然后分别通过SDS-PAGE电泳及转膜将蛋白转印至PVDF膜（Millipore）。经5％脱脂奶封闭后一抗孵育过夜，次日使用TBST缓冲液将膜清洗3次并加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（1：5000，ZSBIO）室温孵育1小时， TBST清洗3次后，通过增强化学发光（ECL）系统（Thermo pierce，美国）进行蛋白进行检测。所用抗体包括，小鼠抗组氨酸标签mAb（Abmart，M20001S），HRP山羊抗小鼠IgG（ZSBIO，ZB -5305）。

结果表明，膜蛋白M、核基质蛋白N、ORF3和ORF7表达水平较高，而刺突蛋白S、包膜蛋白E、ORF6和ORF8的丰度很低，未见明显的阳性条带(图1)。

实施例2：如图2所示，用免疫荧光技术分析SARS-CoV-2来源序列的蛋白表达丰度。

设计合成引物IRES-RFP-F: AAGTCGACACGTTACTGGCCGAAGCCG，IRES-RFP-R：AAGGTACCTTAGGCGCCGGTGGAGTGG，以Addgene:#36975质粒为模板扩增IRES-RFP片段，构建携带SARS-CoV-2相关基因及IRES-RFP的重组质粒。将人A549 细胞接种至12孔板盖玻片内，培养过夜后使用阳离子转染试剂PEI转染上述重组质粒转染，36小时后使用小鼠抗组氨酸标签和绿色荧光二抗（Invitrogen，A32766）检测靶蛋白，使用DAPI（Invitrogen，D1306）标记细胞核，并用荧光显微镜观察拍照。

结果显示RFP转染阳性细胞中，膜蛋白M、核基质蛋白N、ORF3、ORF7以及密码子优化的S的荧光信号较强，而刺突蛋白S、包膜蛋白E、ORF6和ORF8未见显著荧光信号，揭示目的基因的表达丰度较低。

实施例3：如图3所示是用生物信息学分析SARS-COV-2密码子偏好性。

利用GCUA工具分析了SARS-CoV-2与人类密码子使用偏好。结果显示，低丰度病毒蛋白（刺突蛋白S、包膜蛋白E、ORF6、ORF8）比高丰度蛋白（膜蛋白M、核基质蛋白N、ORF3、ORF7）的密码使用具有更高的变异性（图3A）。此外，一些稀有密码子，特别是编码“亮氨酸”的密码子，在低丰度蛋白中的数量（图3B）和比例（图3C）较高。将刺突蛋白信号肽中的“Leu”稀有密码子优化（oSP）为人常用密码子（“CTG”）后，棘突蛋白（S）RBD结构域（受体结合结构域）（密码子优化）的蛋白质水平显著高于具有野生型信号肽（wSP）的RBD融合蛋白(图3D)。抗体明细如下：兔抗RBD PAb（多克隆抗体）（Sino Biological，＃40592-T62），HRP山羊抗兔IgG（ZSBIO，ZB-5301）。以上结果表明这表明密码子偏好性在病毒蛋白的翻译过程中起着重要作用。

实施例4：如图4所示，为病毒感染时稀有密码子潜在调控通路。

由于tRNA是参与蛋白质翻译的最重要分子，通过使用UCSC数据库分析稀有密码子Leu-TAA匹配的tRNA “TRL-TAA”，可见TRL-TAA附近存在较多转录因子(TF)结合及组蛋白修饰信号(图4A)，提示转录调控对于TRL-TAA的表达可能十分重要。使用R studio软件分析SARS-CoV-2感染细胞基因表达数据（GSE147507），并对感染上调的基因与TRL-TAA潜在转录调控因子进行重叠分析，发现有25转录因子在SARS-CoV-2感染的人A549-hACE2细胞与Calu3细胞中表达显著升高（图4B和图4C）。已有文献证实，痘苗病毒或巨细胞病毒诱导的宿主EGR1可增强病毒的复制和感染性，因而我们将EGR1与野生型刺突质粒共同转染至人HEK-293细胞，并使用Western Blot检测其表达。结果显示高表达EGR1可略微升高刺突蛋白的表达（图4D）。

为进一步探索其他可能潜在转录因子，我们使用Metascape软件对SARS-CoV-2感染上调的基因进行富集分析，结果显示感染活化基因主要富集于TNF信号、细胞因子产生、ATF2途径和炎症反应等信号通路。激活转录因子2（ATF2）是bZIP转录因子家族的成员，该蛋白的活化（磷酸化途径）参与应激诱导的炎症基因转录和线粒体蛋白稳定。最新研究也表明，阻断ATF2上游激酶如p38能够减少SARS-CoV-2的复制，表明ATF2是一个潜在的治疗靶点。然而Western Blot结果显示共转染ATF2与刺突质粒无明显提高刺突蛋白的表达（图4E）。为了进一步研究SARS-CoV-2感染的关键转录因子，我们使用人肺单细胞转录数据对ACE2、TMPRSS2、ATF2以及上述25个转录因子的细胞分布进行了评估。如图4F所示，这些蛋白在纤毛细胞和肺泡细胞中表达，且此两类细胞已被证实为为SARS-CoV-2靶向细胞。然而最新蛋白质谱学分析表明，刺突蛋白在SARS-CoV-2感染细胞中具有较高丰度，提示机体细胞中可能还存在其他分子机制调控S蛋白的表达。

实施例5：如图5所示，为线粒体定位影响SARS-CoV-2相关序列的蛋白表达。

为进一步阐明刺突蛋白的调控机制，我们使用Metascape对刺突蛋白的相互蛋白质进行了富集分析，结果显示S结合蛋白主要富集于蛋白质折叠、mRNA剪接、蛋白质翻译，尤其是线粒体翻译的生物过程中（图5A）。由于线粒体基因组富含AT序列，并具有与人基因组不同的密码子使用偏好性，因此我们进一步比较了SARS-CoV-2偏好的稀有密码子在线粒体中使用情况，结果显示SARS-CoV-2和S蛋白关键稀有密码子的偏好性与人类线粒体的更接近（图5B）。最近，SARS-CoV-2转录组显示，感染细胞中有近一半来自SARS-CoV-2的RNA具有5’前导序列（或5’非翻译区，5’UTR），相关生物信息学分析文献显示SARS-CoV-2的5’前导序列和3’UTR具有潜在的线粒体定位信号。通过构建含SARS-CoV-2 5’前导序列及3’UTR的重组质粒，我们发现添加5’前导序列和3’UTR序列能够显著增强S蛋白丰度(图5C)。且过表达EGR1和ATF2能够进一步增强这种线粒体依赖的蛋白表达（图5D）。为了进一步证明线粒体定位是病毒蛋白翻译所必需的，我们将两个已报道的线粒体RNA靶向信号序列插入到病毒相关序列的上游构建重组质粒(图5E)。蛋白表达结果显示，带有RMRP结合序列（即MRP）的S和ORF8的蛋白质水平显著提高（图5F），且MRP介导的刺突蛋白的表达同样可被EGR1与ATF2增强（图5G）。最近SARS-CoV-2感染的人肺上皮的透射电镜(TEM)的结果也发现，感染细胞内的病毒颗粒被大量的线粒体包围，且部分病毒可被线粒体膜包裹，这进一步证实线粒体定位对于病毒的形成至关重要。

实施例6：如图6所示，多数病毒密码子偏好性与线粒体相似。

为进一步验证线粒体依赖的蛋白翻译现象广泛适用于病毒领域，我们从密码子数据库（http://www.kazusa.or.jp/codon/）中下载了17种人类常见病毒（12种RNA病毒和5种DNA病毒）的密码子使用表，并分析它们对线粒体偏好稀有密码子（L-TTA、L-CTT、L-CTA、V-GTA）的使用情况，结果显示，与人基因组密码子使用频率相比，病毒对这些稀有密码子的使用频率与线粒体更为接近（图6）。

实施例7：如图7所示，线粒体定位信号对11型腺病毒鞭毛表达的影响。

为了验证线粒体依赖的病毒蛋白翻译具有普遍性，我们选用11型人腺病毒进行验证。图7A显示11型人腺病毒（Ad11）鞭毛（介导AD11与受体蛋白的结合）具有较高比例的L-TTA、L-CTT稀有密码子比例，且与线粒体更为接近。5’端加入RMRP结合序列（即MRP）后能够显著提高鞭毛蛋白的表达（图7B）。

实施例8：如图8所示，线粒体靶向药物抑制11型腺病毒的复制。

为进一步验证线粒体功能是否影响11型人腺病毒复制，将2*10

实施例9：如图9所示为线粒体靶向药物虎杖苷及氯尼达明抑制刺突蛋白的表达。

为进一步验证线粒体靶向药物在新冠中的潜在应用，我们使用PEI试剂将UTR-S重组质粒转入人HEK-293细胞中，并分别向细胞中加入DMSO、10μM 虎杖苷（polydatin）、10μM氯尼达明（Lonidamine）进行处理。48小时后收取细胞，并用Western Blot对刺突蛋白的表达进行验证。结果显示线粒体靶向药物虎杖苷及氯尼达明可显著抑制SARS-CoV-2刺突蛋白的表达。最新研究证实，葡萄糖类似物2-脱氧-D-葡萄糖(2DG)可以阻止SARS-COV-2在Caco-2细胞中的复制，进一步验证线粒体是新冠潜在的治疗靶点。

综上所述，本发明阐述了密码子偏好性对SARS-CoV-2病毒刺突蛋白、腺病毒核鞭毛蛋白等稀有富含密码子病毒蛋白翻译表达的影响，首次证实了病毒感染引起的线粒体劫持以及病毒RNA的线粒体定位对于病毒蛋白的表达至关重要，使用线粒体靶向药物能够抑制病毒的复制及相关蛋白的表达。本发明为广谱抗病毒药物的研发提供了新策略，并提供了一种新的抗病毒药物作用靶点，也为新冠肺炎的防治提供了新的理论依据。