荧光检测探针及测定家禽肝脏组织中药物残留的方法

摘要

本发明提供了一种荧光检测探针及测定家禽肝脏组织中药物残留的方法。本发明以氮掺杂荧光碳点为荧光材料，氧四环素为模板剂，甲基丙烯酸和2,3‑环氧丙烷甲基丙烯酸酯为聚合单体，通过聚合反应得到共聚产物后，再对所述共聚产物进行亲水改性处理制备而成。本发明提供的测定家禽肝脏组织中药物残留的方法，采用自制的荧光检测探针进行药物残留的测定，该方法操作简单快速、大大缩短了检测时间，可以有效避免传统方法中复杂的分离过程并能够高效提高对氧四环素的选择性识别能力，有效提高了荧光检测探针的灵敏度和选择性。

说明书

技术领域

本发明涉及药物残留检测技术领域，尤其涉及一种荧光检测探针及测定家禽肝脏组织中药物残留的方法。

背景技术

四环素抗生素是一种广谱抗生素，因其具有良好的口服吸收能力、使用方便、低毒性低成本以及广谱抗菌活性等优点，被广泛应用于兽医药领域，并在动物饲料中的大量使用。然而，家禽动物组织中残留的四环素存在着一定的安全隐患：食用该动物组织类产品可能会引起人的过敏反应，并导致各种细菌产生耐药性，严重威胁着人类健康。

荧光碳点因具有良好的水溶性、光学稳定性、出色的生物相容性、生物低毒性以及强荧光性能，在分析物检测、荧光标记、催化剂、探针等领域展现出良好的应用前景。将荧光碳点和分子印迹技术相结合能够有效提高荧光检测过程的选择性。

申请号为CN201910284988.1的发明专利公开了一种分子印迹比率荧光探针的制备方法及利用其检测土霉素的方法。该荧光探针的制备方法为首先，制备碳量子点；然后，制备介孔分子印迹聚合物；最后，制备分子印迹比率荧光探针。该检测土霉素的方法为先制备分散液；再确定猝灭常数；最后检测待测样品，按Stern-Volmer方程计算出待测样品中土霉素的浓度。但是，该荧光探针的制备方法复杂，且操作过程繁琐且不易控制反应过程。同时，其抗干扰能力欠佳，容易与检测体系中的生物大分子蛋白质等共存干扰物质结合吸附，影响其识别性能；还存在特异性选择性能欠佳，活性识别位点没有很大程度上的提高和增多的技术缺陷。

申请号为CN201811062602.4的发明专利公开了一种四环素碳点荧光分子印迹材料的制备方法。该方法采用CDs作为载体，以甲醇/水为溶剂，加入四环素、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈合成了一种四环素碳点荧光分子印迹复合材料。但是，该四环素碳点荧光分子印迹材料的抗干扰能力欠佳，其容易与检测体系中的生物大分子蛋白质等共存干扰物质结合吸附，影响其识别性能；同时，该材料还存在特异性选择性能欠佳，活性识别位点没有很大程度上的提高和增多的技术缺陷。

有鉴于此，有必要设计一种改进的荧光检测探针及将其应用于测定家禽肝脏组织中药物残留的方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光检测探针及测定家禽肝脏组织中药物残留的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种荧光检测探针，其以氮掺杂荧光碳点为荧光材料，氧四环素为模板剂，甲基丙烯酸和2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯为聚合单体，2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯为交联剂，通过聚合反应得到共聚产物后，再对所述共聚产物进行亲水改性处理制备而成；所述荧光检测探针的激发波长为340～380nm。

作为本发明的进一步改进，所述荧光检测探针的制备方法，包括如下步骤：

P1，制备氮掺杂荧光碳点：以生物质材料作为前驱体，采用水热合成法制备出氮掺杂荧光碳点；

P2，制备荧光微球：按预定添加比例，将氧四环素分散在1～2L盐酸/乙醇混合溶液中，超声处理使所述氧四环素完全溶解，得到混合溶液；并向所述混合溶液中依次加入甲基丙烯酸、2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯、2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯、引发剂和步骤P1制备的所述氮掺杂荧光碳点，在预定条件下，进行共聚反应，制备得到共聚产物；然后，将所述共聚产物洗涤烘干处理，得到荧光微球；

P3，制备荧光检测探针：取3～6g步骤P2制备的所述荧光微球，加入到200～300mL高氯酸溶液中，在室温下搅拌20～30h，得到反应产物；然后，用甲醇/乙酸混合溶液洗脱所述反应产物，直到完全除去氧四环素，干燥后处理，制备得到荧光检测探针。

作为本发明的进一步改进，在步骤P2所述共聚反应的反应体系中，所述氧四环素、所述甲基丙烯酸、所述2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯、所述2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯和所述氮掺杂荧光碳点五者的添加比例为(1～10)mmol：(30～50)mmol：(80～120)mmol：(2～6)mL：(0.5～5)g。

作为本发明的进一步改进，在步骤P2中，所述共聚反应的条件为：在氮气氛围、50～80℃条件下，搅拌18～30h。

作为本发明的进一步改进，在步骤P3所述的高氯酸溶液中，高氯酸的浓度为8～12％。

为实现上述发明目的，本发明还提供了一种测定家禽肝脏组织中药物残留的方法，该方法采用上述荧光检测探针进行检测，包括如下步骤：

S1，制备家禽肝脏组织样品：取预定量的家禽肝脏组织绞碎混匀后，向其内加入提取溶剂进行涡旋处理0.5～2min，接着，10000～15000r/min转速下匀浆1～2min，再超声提取8～15min，在4000～8000r/min转速下离心3～10min，获取上清液，随后进行重复提取，合并上清液，制备得到家禽肝脏组织样品；

S2，计算荧光减弱程度与氧四环素浓度的线性回归方程；

S3，制备氧四环素检测体系：将步骤S1得到的所述家禽肝脏组织样品与预定浓度的荧光检测探针溶液按1：1的体积比混合均匀，并用PBS缓冲液将检测体系调节至预定pH值；充分混合3～8min后，在340～380nm激发波长下测量荧光信号；

S4，计算检测结果：根据步骤S2计算得到的线性回归方程，通过所述荧光检测探针的荧光减弱程度来计算家禽肝脏组织样品中的氧四环素的含量。

作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述氧四环素检测体系的pH值设置为8～9。

作为本发明的进一步改进，所述氧四环素检测体系中，所述氧四环素的检测限不低于14.0ng/mL。

作为本发明的进一步改进，在步骤S3中，所述荧光检测探针溶液的浓度为0.1～0.8mg/mL。

作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述荧光减弱程度与氧四环素浓度之间的关系式为：

I

I

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的荧光检测探针，以氮掺杂荧光碳点为荧光材料，氧四环素为模板剂，甲基丙烯酸和2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯为聚合单体，2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯为交联剂，通过聚合反应得到共聚产物后，再对所述共聚产物进行亲水改性处理制备而成。将以氧四环素为模板剂的分子印迹聚合物与氮掺杂荧光碳点相结合，有效提高了荧光检测探针检测的特定选择性。其中，2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯在荧光微球表面分子印迹的合成过程中作为共聚功能单体参与反应，其含有活性环氧环，随着共聚反应的不断进行，该环氧基水解产生大量羟基，可以较少地干扰共聚反应。其后，采用高氯酸对2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯的环氧环进行开环处理，从而在荧光微球表面进行亲水性修饰改性处理，该亲水修饰改性不仅能够增大荧光检测探针的溶解性能，还能够有效防止或减少大分子蛋白质等的粘附。

2、本发明提供的荧光检测探针，本发明将2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯共聚和开环亲水改性两步法结合起来，对合成的荧光微球进行修饰以使得亲水性基团显露在荧光微球的外表面，使得荧光检测探针不仅可以通过亲水基团的存在而获得化学屏障，还能够产生亲水的外表面避免了其与蛋白质的不可逆结合，即，该修饰过程可以为荧光检测探针提供双重表面配置，使得其内表面只允许小分子进入，并具有优异的分离和保留能力；其外表面则利用优异的亲水作用和尺寸排阻作用来阻止检测体系中生物大分子，例如蛋白质等共存干扰物质进入内部，从而提高了荧光检测探针的抗干扰能力。

3、本发明提供的荧光检测探针，采用天然廉价的生物质材料作为前驱体，通过简单的一步水热合成法制备出高荧光量子产率的氮掺杂荧光碳点，掺杂的氮原子能够嵌入到碳点的结构中形成新的能级或调节初始带隙，由此提高荧光碳点的量子产率及荧光强度，同时，还能够在荧光碳点中提供活性位点，从而有效提高荧光检测探针的特异识别性能和选择性。

4、本发明提供的测定家禽肝脏组织中药物残留的方法，采用自制的荧光检测探针进行药物残留的测定，该方法操作简单快速、大大缩短了检测时间，可以有效避免传统方法中复杂的分离过程并能够高效提高对氧四环素的选择性识别能力，有效提高了荧光检测探针的灵敏度和选择性；其测定原理在于：当检测体系中不存在氧四环素时，电子与空穴之间的重组会使得该荧光检测探针发出荧光；当检测体系中存在氧四环素时，氧四环素用作电子受体，可防止荧光检测探针界面处的空穴和电子复合，从而导致荧光猝灭，根据荧光强度的变化来计算检测体系中氧四环素的含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面具体实施例对本发明进行详细描述。

需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本发明还提供一种测定家禽肝脏组织中药物残留的方法，该方法采用荧光检测探针进行检测，包括如下步骤：

S1，制备家禽肝脏组织样品：取预定量的家禽肝脏组织绞碎混匀后，向其内加入提取溶剂进行涡旋处理0.5～2min，接着，10000～1500r/min转速下匀浆1～2min，再超声提取8～15min，在4000～8000r/min转速下离心3～10min，获取上清液，随后进行重复提取，合并上清液，制备得到家禽肝脏组织样品；

S2，计算荧光减弱程度与氧四环素浓度的线性回归方程；

S3，制备氧四环素检测体系：将步骤S1得到的所述家禽肝脏组织样品与预定浓度的荧光检测探针溶液按1：1的体积比混合均匀，并用PBS缓冲液将检测体系调节至预定pH值；充分混合3～8min后，在340～380nm激发波长下测量荧光信号；

S4，计算检测结果：根据步骤S2计算得到的线性回归方程，通过所述荧光检测探针的荧光减弱程度来计算家禽肝脏组织样品中的氧四环素的含量。

作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，所述氧四环素检测体系的pH值设置为8～9。

优选的，所述氧四环素检测体系中，所述氧四环素的检测限不低于14.0ng/mL。

优选的，在步骤S3中，所述荧光检测探针溶液的浓度为0.1～0.8mg/mL。

优选的，在步骤S2中，所述荧光减弱程度与氧四环素浓度之间的关系式为：

I

I

下面就具体实施例对本发明进行进一步详细描述。

实施例1

一、制备荧光检测探针：

P1，制备氮掺杂荧光碳点：以生物质材料作为前驱体，采用水热合成法制备出氮掺杂荧光碳点，具体过程为：将生物质火龙果皮等果渣废弃物洗净并破碎成浆，称取10g分散于20mL乙醇溶剂中，超声处理30min后，转移至水热反应釜中，恒定200℃温度下水热反应10h，反应结束后将反应釜自然冷却至室温，得到的浅棕色溶液用滤膜超滤去除大颗粒聚集物，并透析12h，制备得到CDs-N溶液，冷冻干燥法处理，制备得到氮掺杂荧光碳点；

P2，制备荧光微球：将5mmol氧四环素分散在1.5L盐酸/乙醇混合溶液中，超声15min使所述氧四环素完全溶解，得到混合溶液；并向所述混合溶液中依次加入40mmol甲基丙烯酸、100mmol 2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯、5mL 2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯、5mmol引发剂2，2`-偶氮双(2-甲基丙腈)和2g步骤P1制备的所述氮掺杂荧光碳点，在氮气氛围、65℃条件下，搅拌24h，进行共聚反应，制备得到共聚产物；然后，将所述共聚产物洗涤烘干处理，得到荧光微球；

P3，制备荧光检测探针：取4g步骤P2制备的所述荧光微球，加入到300mL高氯酸溶液(高氯酸的浓度为10％)中，在室温下搅拌20h，充分反应得到反应产物；然后，用甲醇/乙酸混合溶液洗脱所述反应产物，直到完全除去氧四环素，干燥后处理，制备得到荧光检测探针，并制备0.5mg/mL的荧光检测探针/PBS缓冲液混合溶液，待用。

二、一种测定家禽肝脏组织中药物残留的方法，采用上述荧光检测探针进行检测，包括如下步骤：

S1，制备家禽肝脏组织样品：取2.00g的家禽肝脏组织绞碎混匀后，向其内加入提取溶剂乙腈进行涡旋处理1.5min，接着，15000r/min转速下匀浆2min，再超声提取10min，在6000r/min转速下离心10min，获取上清液，随后进行重复提取三次，合并上清液，制备得到家禽肝脏组织样品。

S2，计算荧光减弱程度与氧四环素浓度的线性回归方程，所述荧光减弱程度与氧四环素浓度之间的关系式为：

I

I

配制不同浓度N值的氧四环素(50、200、400、600、800、1000和1200ng/mL)的标准溶液1mL，将其与0.5mg/mL的荧光检测探针溶液按1：1的体积比混合均匀，并用PBS缓冲液将检测体系调节至pH值为8；充分混合5min后，在360nm激发波长下测量荧光信号，计算结果表明荧光减弱程度与氧四环素浓度呈现出良好的线性关系，线性回归方程如下：

I

该荧光检测探针-氧四环素复合体系中，氧四环素的检出限为14.6ng/mL。其中，氧四环素的回收率为94.6～102.3％，相对标准偏差为1.7～3.5％。

S3，制备氧四环素检测体系：将步骤S1得到的所述家禽肝脏组织样品1mL，与0.5mg/mL的荧光检测探针溶液按1：1的体积比混合均匀，并用PBS缓冲液将检测体系调节至pH值为8；充分混合5min后，在360nm激发波长下测量荧光信号。

S4，计算检测结果：根据步骤S2计算得到的线性回归方程，通过所述荧光检测探针的荧光减弱程度来计算家禽肝脏组织样品中的氧四环素的含量为27.9ng/mL。

对比例1

与实施例1的不同之处在于：荧光检测探针的制备过程中，没有进行步骤P3的改性处理。

该对比例1制备的氮掺杂荧光碳点-氧四环素复合体系中，氧四环素的检出限为16.9ng/mL。其中，氧四环素的回收率为92.4～97.3％，相对标准偏差为2.2～4.0％。

本发明实施例1相对于对比例1来讲，其具备更高的灵敏度和更强的结合能力，这是因为本发明实施例1将2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯共聚和开环亲水改性两步法结合起来，对合成的荧光微球进行修饰以使得亲水性基团显露在荧光微球的外表面，使得荧光检测探针不仅可以通过亲水基团的存在而获得化学屏障，还能够产生亲水的外表面避免了其与蛋白质的不可逆结合，从而提高了荧光检测探针的抗干扰能力。

对比例2

与实施例1的不同之处在于：荧光检测探针的制备过程中，没有进行步骤P2和P3的处理，仅采用氮掺杂荧光碳点进行检测。

该对比例2制备的氮掺杂荧光碳点-氧四环素复合体系中，氧四环素的检出限为43.7ng/mL。其中，氧四环素的回收率为70.2～79.2％，相对标准偏差为4.2～6.7％。

本发明实施例1相对于对比例2来讲，其具备更高的灵敏度和更强的结合能力，这是因为模板剂氧四环素在荧光微球的分子印迹表面留下了特定的识别位点，抗干扰能力显著增强，可以实现与待检测样品中的氧四环素进行快速结合。而对比例2提供的氮掺杂荧光碳点对氧四环素的识别能力和选择性能均欠佳。

对比例3

与实施例1的不同之处在于：荧光检测探针的制备过程中，步骤P1采用没有氮掺杂的荧光碳点进行荧光检测探针的制备。

该对比例3制备的荧光碳点检测探针-氧四环素复合体系中，氧四环素的检出限为17.5ng/mL。其中，氧四环素的回收率为89.9～96.2％，相对标准偏差为1.8～4.1％。

本发明实施例1相对于对比例3来讲，其具备更高的灵敏度和更强的结合能力，这是因为氮掺杂荧光碳点提高了荧光强度，同时，还能够在荧光检测探针中提供更多的活性识别位点，从而有效提高荧光检测探针对氧四环素的特异识别性能和选择性。

实施例2

与实施例1的不同之处在于：荧光检测探针的制备过程中，步骤P2中氧四环素的添加量为1mmol。

实施例3

与实施例1的不同之处在于：荧光检测探针的制备过程中，步骤P2中氧四环素的添加量为10mmol。

与实施例1相比，实施例2和实施例3制备的荧光检测探针-氧四环素复合体系中，氧四环素的检出限分别为26.8ng/mL和24.5ng/mL。上述数据表明，模板剂氧四环素的添加量能够影响荧光检测探针的检测能力。

综上所述，本发明提供了一种荧光检测探针及测定家禽肝脏组织中药物残留的方法。本发明以氮掺杂荧光碳点为荧光材料，氧四环素为模板剂，甲基丙烯酸和2,3-环氧丙烷甲基丙烯酸酯为聚合单体，通过聚合反应得到共聚产物后，再对所述共聚产物进行亲水改性处理制备而成。本发明提供的测定家禽肝脏组织中药物残留的方法，采用自制的荧光检测探针进行药物残留的测定，该方法操作简单快速、大大缩短了检测时间，可以有效避免传统方法中复杂的分离过程并能够高效提高对氧四环素的选择性识别能力，有效提高了荧光检测探针的灵敏度和选择性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。