番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b及其克隆方法与应用方法

摘要

本发明提供了一种番茄抗晚疫病的基因Sly‑miR166b，其DNA分子序列如SEQ ID NO.1所示；提供了该基因的克隆方法，以野生型感晚疫病番茄早粉2号的DNA为模板进行PCR扩增；将得到的PCR产物与pMD‑19T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序；还提供了该基因的应用方法，用于番茄抵御病原菌侵染。本发明方法得到Sly‑miR166b在番茄中瞬时过表达后，植株中Sly‑miR166b的表达量高于野生型植株，其抗晚疫病效果更优，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b及其克隆方法与应用方法。

背景技术

番茄是普遍栽培的最具价值的果蔬之一，营养丰富，风味独特。由致病疫霉(Phytophthora infestans,P.infestans)引起的晚疫病极大地影响了番茄产量和质量。通过对番茄与致病疫霉互作分子机制的研究，发现关键的抗病基因，并通过基因工程培育抗性品种，已成为可持续发展的新型策略。利用基因工程手段向番茄体内导入关键的miRNA基因可以有效的提高转基因植株的抗病性。

MicroRNA(miRNA)是非编码小RNA，长度为20–24个核苷酸(nucleotide,nt)。MIRNA基因转录后经由miRNA前体(pre-miRNA)剪切后形成成熟体，后根据碱基互补配对原则结合靶mRNA从而降解或者阻遏靶mRNA的翻译。miRNA在植物抗病过程中发挥的重要作用已被广泛报道。在拟南芥中过表达miR393可以增强植物的免疫系统并有助于植物抵抗细菌的侵害；在杨树中，miR472a参与了植株增强了对金黄壳囊孢菌的抗性；在番茄中，过表达miR172提高了植株对晚疫病的抗性。通过分析本实验室前期构建的致病疫霉侵染番茄前后的小RNA文库，发现sly-miR166b在致病疫霉侵染后表达量有显著变化。

MiR166家族是植物中成员众多的miRNA基因家族之一，其靶基因主要是III型同源异域型-亮氨酸拉链(class III homeodomain-leucine zipper，HD-ZIP III)转录因子，它可通过与下游基因结合，从而广泛参与调控植物生长发育、响应逆境等生物学过程。番茄中miR166家族共有miR166a/b/c三个成员。黄曲叶病毒侵染番茄后，Sly-miR166a与其靶向的HD-Zip III基因均响应胁迫且表达趋势相反；冷胁迫处理的番茄幼苗中Sly-miR166b在表达上调，其靶标HD-Zip III的表达下调；在番茄受干旱胁迫后，miR166的表达量变化显著。HD-Zip III家族基因在植物木质部的形成中发挥重要作用(Kim et al.,2005；Bloch etal.,2019)。木质素(lignin)是苯丙烷衍生物的聚合物，是最重要的细胞壁成分之一，胞间层、初生壁和次生壁都积累木质素，从而阻止病原物的扩展。

目前，关于Sly-miR166b在番茄抗晚疫病中的作用尚未有报道。

发明内容

为了进一步研究Sly-miR166b的功能，本发明从番茄中克隆Sly-miR166b基因，构建了过表达载体，通过瞬时表达技术了解Sly-miR166b在番茄抗病中的作用，为全面揭示Sly-miR166b参与抗病的分子机制奠定基础。

本发明的目的在于提供一种番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b及其克隆方法，并提供该基因在番茄抗晚疫病中的应用方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一个番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了上述番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的克隆方法，以感晚疫病番茄早粉2号的DNA为模板，以pre-miR166b-FP、pre-miR166b-RP为特异性引物，进行PCR扩增；所述特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

克隆所用特异性引物具体为如下：

pre-miR166b-FP：GCTCTAGAATGGGTGGATTTGATGATCATG；

pre-miR166b-RP：CGAGCTCTTACATCTGAGGTCCAAGCGA；

将得到的PCR产物与pMD-19T克隆载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落，摇菌后提取质粒，进行质粒PCR后将质粒送测序，测序结果如SEQ ID NO.1的质粒即正确。

本发明还提供了番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的应用方法，用于番茄抵御病原菌侵染。

具体通过以下技术方案实现：

将含有番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的重组表达载体转化农杆菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、链霉素及利福平的YEB固体培养基上，挑取单菌落进行菌液PCR验证；取五叶期番茄作为处理对象，以注射的方式向所述五叶期番茄叶片内导入制得的阳性工程菌菌液，进而实现番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的过表达。

优选所述重组表达载体由将所述番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b插入表达载体得到。

更进一步地，所述重组表达载体的具体制备方法为：

以感晚疫病番茄早粉2号的DNA为模板，以pre-miR166b-FP、pre-miR166b-RP为特异性引物，进行PCR扩增；

所述特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

将得到的PCR产物与pMD-19T克隆载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落摇菌后提取质粒，进行质粒PCR后将质粒送测序，测序结果如SEQ ID NO.1的质粒即正确。用限制性内切酶BamHI及SacI双酶切测序正确的质粒，回收得到目的片段，将所述目的片段与去除GUS基因的pBI121表达载体连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在含有卡那青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落，摇菌后提取质粒，进行质粒PCR后将质粒送测序，测序正确的即为重组表达载体。

本发明的技术创新在于：

本发明克隆得到了一个番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b；构建了含有番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的重组表达载体；借由本发明番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的过表达，可以实现对番茄晚疫病抗性基因的调控。具体地，Sly-miR166b的过表达可以抑制植物体内HD-Zip III型转录因子的表达，而HD-Zip III转录因子与植物体内木质素合成相关，能间接影响植株的抗病性。本发明方法得到的瞬时过表达植株中Sly-miR166b的表达量高于空载植株，其抗晚疫病效果更优。本发明通过过表达Sly-miR166b基因使番茄对晚疫病的抗性增强，对培育抗晚疫病番茄品种具有重要意义。

附图说明

图1为瞬时过表达空载和Sly-miR166b植株中Sly-miR166b及其靶基因的表达量；

图2为晚疫病菌处理5天后瞬时过表达空载和Sly-miR166b植株表型；

图3为晚疫病菌处理5天后瞬时过表达空载和Sly-miR166b叶片相对病斑面积。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。实施例中未注明的实验条件及方法，均为常规方法。

实施例一：番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的克隆

1.番茄DNA的提取

(1)剪取约0.1g的番茄叶片迅速置于研钵中，加入液氮后充分研磨至粉末为止。

(2)将上述样品加入到700μL预热的GP1缓冲液中，颠倒混匀6次后，65℃水浴20min，颠倒混匀样品数次。

(3)将700μL氯仿加入至上述水浴后的混合液中，颠倒混匀6次后，12000rpm离心5min。

(4)将离心后的液体上层水相吸入到一个新的离心管中，加入700μL的GP2缓冲液，充分混匀6次。

(5)将上述混匀的液体移至吸附柱CB3中，12000rpm离心1min后，弃废液。

(6)将500μL的GD缓冲液加入上述吸附柱CB3中，12000rpm离心1min，弃废液。

(7)将600μL的漂洗液PW加入吸附柱CB3中，12000rpm离心1min，弃废液。

(8)重复步骤(7)。

(9)将吸附柱放回收集管中，12000rpm空离2min，弃掉废液，室温放置数分钟，直至晾干残留在吸附柱中的PW。

(10)将吸附柱重置于一个新的离心管中，并向吸附柱膜中央滴加50μL预热的ddH

2.Sly-miR166b基因的PCR扩增

以番茄早粉2号的DNA为模板，应用特异性引物，进行PCR扩增。

克隆所用特异性引物如下：

pre-miR166b-FP：CGGGATCCCGTTGTACATTGTTTTCTTAAT

pre-miR166b-RP：CGAGCTCGAATATTAGCTTTTGTCACT

反应条件如下：

3.PCR扩增产物的回收纯化

1％琼脂糖凝胶电泳检测上述PCR产物后，用切胶回收试剂盒(购自Takara)回收符合目标片段大小的PCR产物。

4.目标片段与克隆载体连接

将上述回收得到的目标片段与克隆载体pMD-19T(购自Takara)连接，反应体系如下：

16℃连接8h，即得到连接产物pMD-19T-miR166b。

5.连接产物转化大肠杆菌

(1)将10μL的连接产物加入至上述200μL的大肠杆菌感受态细胞中，吹打混匀后，冰水浴30min；

(2)将上述冰水浴后的混合液立即转移至42℃水浴锅中，90s后再次冰水浴2min；

(3)向上述混合液中加入1mL新鲜的LB培养基，于37℃恒温摇床中，180rpm振荡培养1.5h；

(4)将上述菌液于4000r/min离心10min，吸去1mL上清，留下200μL菌液，将其充分吹打悬浮后，均匀涂布于LB平板上(含100mg/L氨苄青霉素、24mg/L IPTG以及20mg/L X-Gal)，于37℃恒温培养箱中培养过夜；

(5)挑取白色单菌落，接至LB液体培养基(含100mg/L氨苄青霉素)中，于37℃恒温摇床中180rpm振荡培养过夜。

6.pMD-19T-miR166b质粒的提取

依据质粒小提试剂盒(购自TIANGEN)的说明，提取上述菌液中所含有的pMD-19T-miR166b质粒。取5μL的质粒样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

7.质粒PCR检测

以提取的pMD-19T-miR166b质粒为模板，利用pre-miR166b-FP，pre-miR166b-RP为引物进行PCR，反应条件及反应体系同“实施例一，2”。

8.测序

将得到的质粒送至华大基因(北京)公司测序，分析测序结果，与SEQ ID NO.1一致的即为连接pMD-19T正确的质粒。

实施例二：番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b重组表达载体的构建

1.pMD-19T-miR166b质粒的酶切

将pMD-19T-miR166b质粒用BamH I和Sac I(购自Takara)进行双酶切，回收目标片段即小片段。酶切反应体系及方法如下：

37℃酶切6h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

2.pBI121质粒双酶切

用BamH I和Sac I对pBI121质粒进行双酶切，切除GUS基因，回收pBI121片段即大片段。反应体系如下：

37℃酶切6h，1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

3.目标片段与pBI121载体连接

利用T4 DNA连接酶(购自Takara)，将上述切胶回收得到的目标片段和切掉GUS基因的pBI121载体连接。反应体系如下：

16℃连接过夜，连接产物按照“实施例一，5”的方法转化大肠杆菌，后涂布于含有卡那青霉素的LB固体培养基上，挑取单菌落摇菌后提取质粒，进行质粒PCR后将质粒送测序，测序正确的即为重组表达载体pBI121-miR166b。

实施例三：番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b的应用

1.pBI121-miR166b农杆菌工程菌的制备

(1)将2μL的pBI121-miR166b质粒加入到200μL的农杆菌感受态细胞中，充分吹打混匀后，冰水浴10min，之后迅速移至液氮中冷冻5min；

(2)将冷冻后的混合液于37℃水浴5min，加入1mL新鲜的YEB培养基，置于28℃恒温摇床中，180rpm振荡培养3h；

(3)将上述得到的菌液离心后，吸去1mL上清，充分吹打悬浮余下的200μL菌液，将其均匀涂布于YEB固体培养基上(含100mg/L链霉素、100mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)，28℃培养36h。

(4)农杆菌工程菌的PCR检测

挑取上述平板中经抗生素筛选得到的菌落，置于5mL YEB中，28℃，180rpm振荡培养16-17h。

吸取上述菌液2μL，加入18μL的ddH

以上述DNA为模板，利用pre-miR166b特异性引物进行PCR，反应条件及反应体系同“实施例一，2”。

2.瞬时侵染体系的建立与相关检测

(1)将保存的晚疫病菌菌种接种于燕麦培养基上，于20℃的黑暗环境下培养15天，用无菌水将菌体全部洗下，并用三层纱布过滤菌液。调节晚疫病菌孢子终浓度至1×l0

(2)分别挑取pBI121-miR166b根癌农杆菌的单菌落和pBI121空载(Empty Vector，EV)的单菌落至5mL的YEB液体培养基(含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)，于28℃，180rpm振荡培养过夜。吸取1mL上述菌液加入100mL的YEB液体培养基(含100mg/L利福平，50mg/L卡那霉素，10mmol/L一水吗啉乙磺酸，20μmol/L乙酰丁香酮和2mmol/L硫酸镁，pH＝5.6)，于28℃，180rpm振荡培养过夜。之后于4℃，4000r/min离心10min收集根癌农杆菌菌体，重悬菌体于悬浮液MMA(含10mmol/L一水吗啉乙磺酸，20μmol/L乙酰丁香酮和10mmol/L氯化镁，pH＝5.6)中，调节OD

(3)转化前，将五叶期番茄置于弱光条件下，用细砂纸打磨叶背面表皮，将上述菌液注射叶片，取过表达5天后的叶片，提取叶片总RNA，RNA提取步骤如下：

①将样品放入研钵中，加入液氮充分研磨至粉末。

②取适量粉末，置于1.5mL RNase/DNase Free离心管中，同时迅速加入1mL预冷的Trizol，摇匀，室温静置5min。

③向离心管中加入200μL氯仿，摇匀，室温静置5min，4℃12000r/min离心15min。

④将上清转移至新离心管中，并加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃静置20min后，4℃12000r/min离心10min。

⑤弃去上清，加入1mL预冷的75％乙醇，清洗沉淀，4℃12000r/min离心5min。

⑥小心弃去上清，在室温下开盖放置，待乙醇完全挥发后，加入20μL RNase FreedH2O溶解沉淀。

⑦取5μL RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)用miRNA反转录试剂盒TransScript miRNAFirst-Strand cDNASynthesisSuperMix(购自北京全式金)将样品组织的RNA反转录成cDNA模板，用实时荧光定量试剂盒TransStart Tip Green qPCR SuperMix(购自北京全式金)完成qRT-PCR反应。实时荧光定量PCR实验中，Sly-miR166b及其靶基因的实时荧光定量引物如表1所示，它们的表达结果如图1所示，瞬时过表达sly-miR166b(transiently overexpressing sly-miR166b,TO166b)的植株中sly-miR166b表达量明显上升，其靶基因的表达量明显下降，证明植株有效的过表达了sly-miR166b，且sly-miR166b与其靶基因之间呈现负调控关系。

选取过表达5天的完好番茄植株叶片，在其接种晚疫病菌后，瞬时过表达sly-miR166b的叶片上病斑明显小于瞬时过表达空载的叶片上的病斑(图2)；统计分析后发现，瞬时过表达Sly-miR166b叶片上相对病斑面积明显小于瞬时过表达空载叶片上的相对病斑面积(图3)。

表1 Sly-miR166b及其靶基因的特异性引物

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 番茄抗晚疫病基因Sly-miR166b及其克隆方法与应用方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcccatagat catatggagg aagttctctc agttgagggg aatgttgtct ggctcgaggt 60

caccaattag atccataatc cctatatata ccatgctttt caaaaaaaag atttataata 120

tgaaaagggg ttatgaatca tgtgttagtg ttgtcggacc aggcttcatt ccccccaatt 180

gttactcctc tagctagggg a 201

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctctagaat gggtggattt gatgatcatg 30

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgagctctta catctgaggt ccaagcga 28