一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统及成像方法

摘要

本发明公开了一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统及成像方法，利用片上发光器件同时产生同一方向传输的三种波长的倏逝场，利用彩色相机对同一方向同时照明的三波长倏逝场产生的移频图像进行采集，其中三种波长对应红、绿、蓝三个波段移频信号，每种波长照明具有不同移频量。在图像重构过程中将同时拍摄到的多波长信息分离出来分别进行插值处理，由此获得不同移频量、不同照明方向的样品信息。最后进行图像重构，在频谱空间利用拼接算法将样品的不同方向的高频和低频频谱拼接，最终恢复出突破传统显微镜光学衍射极限的高分辨率图像。本发明在牺牲一定图像采样率的情况下，可以有效降低倏逝场移频超分辨方法的图像采集数量，提高成像速度。

说明书

技术领域

本发明涉及超分辨显微领域，尤其涉及一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统及成像方法。

背景技术

传统光学系统受到阿贝衍射极限的限制，其成像分辨率具有一定的极限。为了突破光学显微系统的分辨率极限，一系列的荧光标记和非荧光标记方法相继被提出。其中，移频超分辨显微成像技术打破了传统成像系统与探测器件的带宽限制，并展现出快速、大视场成像等优势。移频无标记超分辨显微术无需荧光标记，可以实现对非生物样品的超分辨成像，具有广泛的应用前景。

倏逝场移频无标记超分辨显微方法采用倏逝场照明样品，可以将样品的高频空间信息转移到传统显微镜的低频带宽范围。成像过程中通过采集不同照明方向不同移频量的样品空间信息，在频谱空间以及利用拼接算法将样品的不同方向的高频和低频频谱拼接，最终恢复出突破传统显微镜光学衍射极限的高分辨率图像。倏逝场移频成像是将光场耦合到高折射率波导中激发倏逝场，利用倏逝场的高横向波失特性来进行移频成像，其频谱移频量取决于波导的有效折射率。一般为了获得比较高的成像分辨率，需要采用高折射率的波导进行成像。然而，仅仅追求高移频量的频谱信息而忽略低频信息是无法恢复出真实的样品形貌的。在频谱拼接的过程中，为了进行正确的频谱拼接以实现无畸变成像，同样必须获取样品的低频频谱信息，且需确保低频与高频之间具有一定的频谱重叠面积。

为了同时获取样品的不同移频量的频谱信息，实现倏逝场移频量可调是一种有效方案。目前已有的倏逝场移频无标记超分辨显微技术通过改变入射光波长来调节照明倏逝场的移频量，但在图像获取的过程中分开采集各移频信息，这意味着每获取一帧超高分辨率的图像，需要采集多幅低分辨率的移频图像。而每幅图像采集过程中都需要一定的相机积分时间，限制了该成像方法的成像速度，不利于获取高帧率的动态图像。

发明内容

本发明目的在于针对现有技术的不足，提出一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统及成像方法。利用电调制的多波长片上发光器件同时产生同一方向传输的三种波长的倏逝场，利用彩色相机对同一方向同时照明的三波长倏逝场产生的移频图像进行采集，其中三种波长对应红、绿、蓝三个波段的移频信号，每种波长照明具有不同的移频量。在图像重构的过程中将同时拍摄到的多波长信息分离出来分别进行插值处理，由此获得不同移频量、不同照明方向的样品信息。最后进行图像重构，在频谱空间利用拼接算法将样品的不同方向的高频和低频频谱拼接，最终恢复出突破传统显微镜光学衍射极限的高分辨率图像。该方法在牺牲一定图像采样率的情况下，可以有效降低倏逝场移频超分辨方法的图像采集数量，提高成像速度。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统，该系统包括：倏逝场移频成像芯片及其发光控制单元、彩色相机、图像存储和重构计算单元、物镜和透镜，所述物镜和透镜将样品的移频散射像共轭成像到彩色相机，图像存储和重构计算单元对彩色相机记录到的移频散射图进行重构，得到样品的超分辨显微图；

光电集成的倏逝场移频成像芯片，用于支撑所需观察的微纳尺寸样品及产生倏逝场照明该样品。倏逝场移频成像芯片由芯片衬底、波导层和发光层组成。发光层在倏逝场移频成像芯片的表面围成一圈多边形发光区域，构成片上发光器件，片上发光器件的每条发光边可单独控制；

所述倏逝场移频成像芯片的发光控制单元，用于控制围成多边形的片上发光器件每条发光边的发光顺序；

所述物镜，用于收集微纳尺寸样品被倏逝场移频后的散射光；

所述透镜，用于将物镜收集的散射光成像到彩色相机；

所述彩色相机，用于记录微纳尺寸样品移频后的散射光；

所述图像存储和重构计算单元，用于存储彩色相机记录的样品移频后的低频散射光，并进行图像重构，恢复出超分辨图像。

所述图像重构过程包括：

(1)将彩色相机记录的散射图按照颜色通道分离；

(2)根据需要对分离出的三通道进行插值处理，其中每个颜色通道代表不同的移频量；

(3)将得到的各个方向的、具有各个移频量的移频图像在频谱区域进行迭代拼接，最后进行逆傅里叶变换得到一张超分辨图像。

进一步地，该系统应用于成像速度大于40Hz的倏逝场成像。

进一步地，所述片上发光器件可以是芯片集成的有机发光白光二极管、半导体白光二极管，或者是通过光纤、波导等外界耦合的白光光源。所采用的发光材料为半导体量子点或稀土掺杂材料等。所述发光层由三种具有不同禁带宽度的材料混合而成，分别能发出红绿蓝三色光，其材料配置比例保证最终耦合进光波导的强度接近于1:1:1。

进一步地，倏逝场移频成像芯片产生三种波长倏逝场照明样品，波长的选取需要满足移频在频谱域具有一定的重叠量，以保证最优的成像效果。

进一步地，为了将片上发光器件发出的光耦合到波导层中，发光层中的下电极选用透明导电材料。包括但不限于ITO、ZnO等TCO薄膜材料。

进一步地，所述倏逝场移频成像芯片的波导层材料包括TiO

进一步地，发光层围成的多边形尺寸由光在波导层中的横向传输距离决定。即相对两条边的间距小于光在波导中的传输距离的两倍，以保证相对两边的发光能有效传输到中心区域与样品相互作用。

进一步地，为了提高片上发光器件与波导层的倏逝场耦合效率，倏逝场移频成像芯片的成像区域增镀一层波导，使一部分光得以从发光层耦合到成像区域的波导。

进一步地，彩色相机的像素尺寸需要跟物镜的数值孔径相匹配，满足奈奎斯特采样定理。

本发明还提供一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统的成像方法，该方法包括：

(1)将制备的微纳尺寸样品放置在片上发光器件所围成的多边形的中间，片上发光器件的发光层发出红绿蓝三色光；

(2)分别将位于多边形上每条边的三色片上发光器件点亮；

(3)片上发光器件发出的三色光耦合到波导层中，并在波导表面产生倏逝场。传输到样品区域的倏逝场将会与样品发生光学衍射作用，产生的散射光即样品在该照明方向的高频信息。其移频量由倏逝场的有效折射率决定；通过物镜和透镜将散射光成像到彩色相机；

(4)彩色相机分别记录每个照明方向的散射光，存储为raw格式，传输到图像存储和重构计算单元；

(5)通过图像存储和重构计算单元将彩色相机记录的彩色移频图按照颜色通道分离；根据需要对分离出的三通道进行插值处理，其中每个颜色通道代表不同的移频量；将得到的各个方向的，具有各个移频量的移频图像在频谱区域进行迭代拼接，最后进行逆傅里叶变换得到一张超分辨图。

本发明的有益效果：该方法在牺牲一定图像采样率的情况下，可以有效降低图像采集数量，提高成像速度。相比以往利用三通道信息进行重构的情况下，其图像采集速度可以提高为原先三倍。

附图说明

图1是倏逝场移频超分辨显微成像的光学系统结构图，其中101是彩色相机，102是透镜，103是物镜，104是倏逝场移频成像芯片，105是图像存储和重构计算单元，106是倏逝场移频成像芯片的发光控制单元；

图2是倏逝场移频成像芯片的一种结构图，采用片上集成光源方式；图a是倏逝场移频成像芯片的俯视图，图b是倏逝场移频成像芯片的侧视图；图c是另一种芯片侧视图，相比图b的设计方案，其成像区域增镀了一层波导层；其中201是芯片衬底，202是芯片波导，203是LED的下电极，204是LED的发光层，205是LED的上电极；

图3是倏逝场移频成像芯片的一种结构图，采用外界耦合光源方式；其中206是集成波导衬底上的条形波导；

图4是倏逝场移频超分辨显微成像的重构流程图；

图5是采用该技术重构出的超分辨成像结果图。

具体实施方式

为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例和附图来详细说明本发明。

本发明提供的一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统，该系统应用于成像速度大于40Hz的倏逝场成像。高速倏逝场移频超分辨显微成像系统包括：倏逝场移频成像芯片104及其发光控制单元106、彩色相机101、图像存储和重构计算单元105、物镜103和透镜102，所述物镜103和透镜102将样品的移频散射像共轭成像到彩色相机101，图像存储和重构计算单元105对彩色相机101记录到的移频散射图进行重构，得到样品的超分辨显微图；

光电集成的倏逝场移频成像芯片104，用于支撑所需观察的微纳尺寸样品及产生三种波长倏逝场照明该样品。波长的选取需要满足移频在频谱域具有一定的重叠量，以保证最优的成像效果。倏逝场移频成像芯片104由芯片衬底201、波导层202和发光层组成。所述倏逝场移频成像芯片104的波导层材料包括TiO

所述片上发光器件可以是芯片集成的有机发光白光二极管、半导体白光二极管，或者是通过光纤、波导等外界耦合的白光光源。所采用的发光材料为半导体量子点或稀土掺杂材料等。所述发光层由三种具有不同禁带宽度的材料混合而成，分别能发出红绿蓝三色光，其材料配置比例保证最终耦合进光波导的强度接近于1:1:1。

发光层围成的多边形尺寸由光在波导层202中的横向传输距离决定。即相对两条边的间距小于光在波导中的传输距离的两倍，以保证相对两边的发光能有效传输到中心区域与样品相互作用。

倏逝场移频成像芯片104发光层包括LED的下电极203，LED的发光层204，LED的上电极205，为了将片上发光器件发出的光耦合到波导层202中，LED的下电极203选用透明导电材料。包括但不限于ITO、ZnO等TCO薄膜材料。为了提高片上发光器件与波导层202的倏逝场耦合效率，倏逝场移频成像芯片104的成像区域增镀一层波导，使一部分光得以从发光层耦合到成像区域的波导。

所述倏逝场移频成像芯片的发光控制单元106，用于控制围成多边形的片上发光器件每条发光边的发光顺序；

所述物镜103，用于收集微纳尺寸样品被倏逝场移频后的低频散射光，低频的频率为物镜能接受的频谱范围；

所述透镜102，用于将物镜收集的散射光成像到彩色相机101；

所述彩色相机101，用于记录微纳尺寸样品移频后的散射光；彩色相机的像素尺寸需要跟物镜的数值孔径相匹配，满足奈奎斯特采样定理。

所述图像存储和重构计算单元105，用于存储彩色相机101记录的样品移频后的低频散射光，并进行图像重构，恢复出超分辨图像。

所述图像重构过程包括：

(1)将彩色相机101记录的散射图按照颜色通道分离；

(2)根据需要对分离出的三通道进行插值处理，其中每个颜色通道代表不同的移频量；

(3)将得到的各个方向的、具有各个移频量的移频图像在频谱区域进行迭代拼接，最后进行逆傅里叶变换得到一张超分辨图像。

本发明还提供了一种高速倏逝场移频超分辨显微成像系统的成像方法，该方法包括：

1、将制备的微纳尺寸样品放置在片上发光器件所围成的多边形的中间，片上发光器件的发光层发出红绿蓝三色光；

2、分别将位于多边形上每条边的三色片上发光器件点亮；

3、片上发光器件发出的三色光耦合到波导层202中，并在波导表面产生倏逝场。传输到样品区域的倏逝场将会与样品发生光学衍射作用，产生的散射光即样品在该照明方向的高频信息，所述高频信息为相对物镜能接收的更高频率的信息。其移频量由倏逝场的有效折射率决定；通过物镜103和透镜102将散射光成像到彩色相机101；

4、彩色相机101分别记录每个照明方向的散射光，存储为raw格式，传输到图像存储和重构计算单元105；

5、通过图像存储和重构计算单元105将彩色相机101记录的彩色移频图按照颜色通道分离；根据需要对分离出的三通道进行插值处理，其中每个颜色通道代表不同的移频量；将得到的各个方向的，具有各个移频量的移频图像在频谱区域进行迭代拼接，最后进行逆傅里叶变换得到一张超分辨图。

实施例：

以”ZJU”字样的双沟道亚波长结构为样品，举例实现超分辨图像重构过程，其中样品每条边的间距是144nm。

如图1所示，本发明提供的一种快速倏逝场移频超分辨显微成像的光学系统结构，该光学系统结构包括：

(1)光电集成的倏逝场移频成像芯片，用于支撑所需观察的微纳尺寸样品及产生调控的倏逝场照明该样品；芯片表面有一圈发光的多色LED，形成八边形，每边LED可以单独控制发光；LED采用三种带隙的量子点混合，三色光波长分别为：405nm,532nm,700nm。

(2)倏逝场移频成像芯片的发光控制单元，用于控制不同角度的多色LED的发光顺序；

(3)物镜，用于收集样品被倏逝场移频后产生的低频散射光；物镜的数值孔径为0.85，放大倍率为100倍。

(4)镜筒透镜，用于将物镜后的像成到彩色相机；

(5)彩色相机，用于记录样品移频后的低频散射光；相机的每个像素的尺寸为3.6微米。

(6)图像重构计算单元，用于存储彩色相机记录的图像，并进行图像重构，恢复出超分辨图。

该倏逝场移频成像芯片结构如图2所示，其中波导采用Si

如图3所示，为倏逝场移频成像芯片的另一种结构图，采用外界耦合光源方式；其中206是集成波导衬底上的条形波导；

如图4所示，一种提高倏逝场移频超分辨显微成像速度的图像采集和图像重构流程，该流程包括：

(1)将制备的样品放置在片上发光器件所围成的多边形的中间。

(2)分别将位于多边形上每条边的多色片上发光器件点亮；

(3)片上发光器件发出的多色光耦合到光学波导中，并在波导表面产生具有高移频量的倏逝场。传输到样品区域的倏逝场将会与样品发生光学衍射作用，产生的散射光即样品在该照明方向的高频信息。其移频量由倏逝场的有效折射率决定；

(4)彩色相机分别记录每个照明方向的散射光，存储为raw格式；

(5)将彩色相机记录的彩色移频图按照颜色通道分离；

(6)根据需要对分离出的三通道进行插值处理，其中每个颜色通道代表不同的移频量；

(7)将得到的各个方向的，具有各个移频量的移频图像在频谱区域进行迭代拼接，最后进行逆傅里叶变换得到一张超分辨图。

如图5所示，图(a)是放置在多边形波导区域中间的样品图。图(b)是样品的垂直照明宽场显微图，可看出由于光学衍射极限，三个字母的每一划的双沟道细节信息都无法分辨。图(c)是采用单色照明单次拍摄重构出的超分辨显微图。图(d)是利用色彩复用照明重构所得到的超分辨显微图。可以看出图(b)中无法区分的细节信息在图(c)、(d)中被区分。相比图(c)而言，图(d)的重构质量稍有降低，但该方法的成像速度相比图(c)的方法可以提高三倍。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内。