一种检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的免疫层析试纸条、制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的免疫层析试纸条、制备方法及其应用。本发明制备的免疫层析试纸条，具有良好的灵敏度、特异性和稳定性，且储存方便、保存期长、操作简单，检测速度快，适用于猫泛白细胞减少综合征病毒感染的快速诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的免疫层析试纸条、制备方法及其应用。

背景技术

猫泛白细胞减少综合征病毒 ( feline panleukopenia virus，FPV) 又称猫细小病毒、猫传染性肠炎病毒或猫瘟病毒，能引起急性、高度接触性传染病，以高热、呕吐、肠炎和白细胞严重减少为特征。该病毒主要感染猫科和鼬科等多种动物，是目前肉食动物细小病毒属中感染范围最广、致病性最强的一种病毒。且幼龄动物感染性较高，对野生动物和宠物猫造成了很大的威胁。该病在世界范围内存在，我国多地均有本病发生，对猫及其它猫科动物危害极大。针对该病免疫，有多种商品化疫苗( 荷兰英特威、美国辉瑞和法国维克等)可以选择，但是针对该病的诊断试剂却参差不齐，因此，建立一种快速灵敏、特异性强、操作简单、经济实用的诊断方法势在必行。

FPV病毒在电子显微镜下观察，呈等轴对称的正二十面体结构，外层没有囊膜包裹，粒子直径在20-25nm之间。该病毒是一种线性、单链的DNA病毒，基因组长约为5123bp。FPV主要由两种蛋白组成，分别是结构蛋白(VP1，VP2)和非结构蛋白（NS1，NS2）。结构蛋白包括；VP1蛋白，分子量73KD，共编码727个氨基酸；VP2蛋白，分子量为60KD，共编码584个氨基酸，VP2蛋白是细小病毒衣壳的最主要成分，该蛋白中某些关键位点的氨基酸变化会导致细小病毒的抗原特性和细胞向性发生改变，同时也会造成细小病毒发病机制的改变。VP2蛋白的三级结构主要由Loop1 ~ Loop5这5个环状结构形成，其中Loop1、Loop2和 Loop4共同构成病毒蛋白的三折叠单元纤突最顶端的结构，而环Loop3是组成病毒三折叠蛋白单元纤突的肩部。VP2 蛋白上有很多特定的抗原结合位点，而上述的五个 Loop环是组成 VP2 蛋白的关键氨基酸位点，同时这些特异性氨基酸能够与相对应的病毒单克隆抗体结合，因此，当Loop环上的氨基酸发生突变时会影响病毒与单克隆抗体结合。

猫泛白细胞减少综合征病毒主要是通过疫苗预防，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

目前已建立的用于检测FPV抗体的血清学方法主要有酶联免疫吸附试验、病毒中和抗体试验、乳胶凝集试验，血凝抑制试验等。血凝抑制试验需要新鲜且敏感性高的红细胞，检测时间需要2～3h；中和试验操作繁琐，需要较高的试验条件和操作水平，整个试验周期长；酶联免疫吸附方法操作要求高，需要酶标仪测定结果，且不适合做单个样本的检测。上述的种种不便都限制了它们在猫细小病毒抗体临床检测中的应用。

本发明专利的目的就是克服以上几种方法的缺点，建立一种操作简便、灵敏、特异、快速的猫泛白细胞减少综合征病毒抗体定性检测方法，应用于猫泛白细胞减少综合征病毒免疫效果的监测，从而限制猫泛白细胞减少综合征病毒的流行。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的抗原。

本发明的目的之二在于提供一种利用上面所述的抗原制备而成的免疫检测产品。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的抗原，所述抗原选自以下组：猫泛白细胞减少综合征病毒VP2蛋白的第22位-第125位的肽段，猫泛白细胞减少综合征病毒VP2蛋白的第105位-第235位的肽段，猫泛白细胞减少综合征病毒VP2蛋白的第333位-第400位的肽段，猫泛白细胞减少综合征病毒VP2蛋白的第22位-第235位的肽段，肽段P5-P

本发明还提供了上述抗原的衍生物。抗原的衍生物序列是由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守性或保守性取代或它们的组合而不同于天然氨基酸序列的序列，是具有天然氨基酸序列同样的生物学活性或提高了结构稳定性(如抗热、抗pH等)的衍生物。

本发明的所述衍生物与天然氨基酸序列的序列同一性至少80%。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了编码前面所述的抗原的DNA分子。在本发明的具体实施方案中，所述编码肽段P5-P

根据本发明的又一个方面，本发明提供了包含前面所述的DNA分子的载体。

术语“载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。可能的表达载体包括但不限于转座子，粘粒，质粒或修饰的病毒(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒和慢病毒) ，只要该载体与所用的宿主细胞相容即可。表达载体“适合转化宿主细胞”，这意味着表达载体含有本发明的抗原基因和基于宿主细胞选择以用于表达的调节序列，其与抗原基因序列可操作地连接。“可操作地连接”意指核酸以允许核酸表达的方式与调节序列连接。

合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物或昆虫基因。合适的调节序列的选择取决于如下所讨论选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地完成。此类调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，取决于所选择的宿主细胞和所用的载体，可以将其他序列，例如复制起点，额外的DNA限制性位点，增强子和赋予转录诱导能力的序列掺入表达载体中。

本发明的载体还可含有选择标志物基因，其有助于选择用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。选择标志物基因的实例是编码赋予对某些药物的抗性的蛋白质的基因，例如新霉素和潮霉素，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，萤火虫萤光素酶或免疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG。通过选择标志物蛋白质如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶的浓度变化来监测选择标志物基因的转录。

可以将载体引入宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语 “转化”，“转导”和 “转染”旨在包括通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体) 引入细胞中。如本文所用的，术语“转化的宿主细胞”或“转导的宿主细胞”还意图包括已经用本发明的载体转化的能够糖基化的细胞。可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化用核酸转化原核细胞。例如，可以通过常规技术，例如磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质转染，电穿孔或显微注射将核酸引入哺乳动物细胞的方法可以在现有技术中找到。

本发明的载体可以转导或转染到任何细胞类型中，例如，载体可以转导入真核宿主细胞和原核细胞，例如，真核细胞或酵母细胞或哺乳动物细胞或大肠杆菌。哺乳动物细胞可以包括：COS ，BHK，CHO，HeLa，293，NS-1细胞，NSO。用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适的载体通常包括启动子(例如，源自病毒材料，例如多瘤，腺病毒2，巨细胞病毒和猿猴病毒40或源自任何病毒LTR) ，以及其他转录和翻译控制序列。哺乳动物载体的实例包括pCDM8，pMT2PC和pMP71。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的免疫检测产品，所述免疫检测产品包括前面所述的抗原。

进一步，所述免疫检测产品包括ELISA试剂盒、免疫层析试纸条、含有所述免疫层析试纸条的检测卡、含有所述免疫层析试纸条或所述检测卡的试剂盒。

在本发明的一个具体实施方案中，所述免疫检测产品是免疫层析试纸条。

本发明的免疫层析试纸条包括底板，以及顺次相互搭接粘附在底板上的样品吸收垫、结合物释放垫、包被有检测线T和质控线C的反应垫、吸水垫。

进一步，结合物释放垫喷涂有山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物；优选地，结合物释放垫喷涂有标记物标记的链霉亲和素与山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物形成的结合物。

优选地，所述山羊抗猫抗抗体为山羊抗猫IgG的IgG。

优选地，所述标记物包括胶体金、胶体银、或胶体硒；更优选地，所述标记物是胶体金。

进一步，所述检测线T包被有前面所述的抗原；优选地，所述抗原的浓度为5μg/mL，包被量为1.0μL/cm。

进一步，所述质控线C包被有兔抗山羊抗抗体；优选地，兔抗山羊抗抗体为兔抗山羊IgG的多抗；更优选地，所述兔抗山羊抗抗体为200μg/mL，包被量为1.0μL/cm。

进一步，所述反应垫包括醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜；优选地，所述反应垫是硝酸纤维素膜。

进一步，所述结合物释放垫包括玻璃棉或聚酯材料；优选地，所述结合物释放垫是玻璃棉。

进一步，所述样品吸收垫包括吸滤纸、滤油纸、玻璃纤维膜或聚酯纤维膜；优选地，所述样品吸收垫为玻璃纤维膜。

进一步，所述底板包括PS底板或其他硬质不吸水的材料；优选地，所述底板为PS底板；

进一步，所述吸水垫为吸水纸；

进一步，所述检测卡是将所述免疫层析试纸条放入塑料卡壳内，压实，以铝箔袋密封；

进一步，所述试剂盒还包括样品获取工具，说明书。

优选地，所述样品获取工具包括滴管。

优选地，所述说明书记载了结果判断标准：质控线与检测线同时显现紫色条带，检测结果为阳性；质控线显现紫色条带，检测线未显现条带，检测结果为阴性。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的免疫层析试纸条的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）制备喷涂有山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫；

（2）制备包被有检测线T和质控线C的反应垫；

（3）在底板上，将所述反应垫、所述样品吸收垫、所述结合物释放垫、所述吸水垫等按如下工艺组装在一起：所述反应垫的底面粘贴在所述底板上面，在所述反应垫的两端上分别粘贴所述结合物释放垫和所述吸水垫，在所述结合物释放垫的另一端粘贴所述样品吸收垫。

优选地，步骤（1）为：制备喷涂有山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物和胶体金标记的链霉亲和素形成的结合物的结合物释放垫。

步骤（1）具体操作如下：

1) 链霉亲和素-胶体金标记物的制备

将胶体金溶液和链霉亲和素溶液混合获得混合液，所述混合液中胶体金与链霉亲和素的质量比为750:1；之后加入BSA和聚乙二醇20000，振荡混匀；离心，弃去上清；取复溶液复溶，混匀。

2) 山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物的制备

将100μL山羊抗猫抗抗体加入至40μL 2%的生物素溶液中，摇床振荡混匀；用PBS 4℃透析过夜。

3) 胶体金标记的链霉亲和素和山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物形成的结合物的制备

取500μL上述制备的链霉亲和素-胶体金标记物，添加5μL上述制备的山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物，室温摇床振荡混匀，后置4℃冰箱。

优选地，复溶液配方为：含1.0% BSA、2.0%蔗糖、pH 8.2的0.05mol/L的Tris缓冲液。

4）结合物释放垫的制备

将所述结合物喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂1μL所述结合物，然后置于40℃环境中16h后取出，置于干燥环境中保存备用。

步骤（2）具体操作如下：用PBS稀释兔抗山羊抗抗体在硝酸纤维素膜上划线形成质控线C，用PBS稀释前面所述的抗原在硝酸纤维素膜上划线形成检测线T，室温干燥1-2h；将含有1% BSA的PBS溶液均匀滴加在硝酸纤维素膜上，室温封闭1h后，干燥后备用；

优选地，稀释后的兔抗山羊抗抗体浓度为200μg/mL，质控线C上所述兔抗山羊抗抗体的包被量为1.0μL/cm；

优选地，稀释后的所述的抗原浓度为5μg/mL，检测线T上所述抗原的包被量为1.0μL/cm。

步骤（3）的具体操作如下：将所述样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PS底板上；结合物释放垫从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PS底板的始端对齐，吸水垫的末端与PS底板的末端对齐； 所述硝酸纤维素膜上有检测线T和质控线C，检测线T和质控线C均呈与所述免疫层析试纸条的长相垂直的条状带；检测线T位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧。将免疫层析试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种体外检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的方法，所述方法包括如下步骤：利用前面所述的抗原或前面所述的免疫检测产品检测包含猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的样品。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的抗原在制备猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的检测产品中的应用。

优选地，所述检测产品是前面所述的免疫检测产品。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的免疫层析试纸条、检测卡或试剂盒在制备猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的检测产品中的应用。

优选地，所述检测产品是前面所述的免疫检测产品。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的抗原在制备猫泛白细胞减少综合征病毒感染的诊断产品中的应用。

优选地，所述诊断产品是前面所述的免疫检测产品。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的免疫层析试纸条、检测卡或试剂盒在制备猫泛白细胞减少综合征病毒感染的诊断产品中的应用。

优选地，所述诊断产品是前面所述的免疫检测产品。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明制备的免疫层析试纸条，具有良好的灵敏度、特异性和稳定性，且储存方便、保存期长、操作简单，检测速度快，适用于猫泛白细胞减少综合征病毒抗感染的快速诊断。

附图说明

图1显示VP2蛋白的分段示意图；

图 2 显示VP2蛋白分段表达结果图，其中，A：P1；B：P2；C：P3和P4；D：P5；E：P6；

图3 显示P

图4 显示免疫层析试纸条的结构示意图；

图5显示免疫层析试纸条检测灵敏度结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

实施例1 猫泛白细胞减少综合征病毒VP2重组蛋白的表达纯化及鉴定

1、在Genbank查找VP2 基因，登录号为：MN451692，序列如SEQ ID NO.1所示。

2、分段表达VP2重组蛋白

将VP2蛋白截短的肽段分多个片段分别表达，所用载体为PET-32a。采用分段表达肽段的方法，将去掉信号肽的VP2蛋白分6段表达，使每条肽段有部分重叠（分段示意图如图1所示），各片段扩增引物如下所示：

扩增P1片段的引物：

F1 5’-caaggatccGGATCTGGGAACGGGTCTGGAG-3’（SEQ ID NO.2），

R1 5’-caagtcgacATCTCCTGGATTAAACCAAAC-3’（SEQ ID NO.3）；

扩增P2片段的引物：

F2 5’-aaaggatccATTGTAACACCTTGGTCATTGG-3’ （SEQ ID NO.4），

R2 5’-cacgtcgacACCATGGTATATATTTGTTGGTG-3’ （SEQ ID NO.5）；

扩增P3片段的引物：

F3 5’-caaggatccTGGAAACCAACCATACCAACTC-3’ （SEQ ID NO.6），

R3 5’-caagtcgacTGGTGCACTATAACCAACCTCA-3’ （SEQ ID NO.7）；

扩增P4片段的引物：

F4 5’-caaggatccAGACGTGGTGTAACTCAAATGG-3’ （SEQ ID NO.8），

R4 5’-caagtcgacTCCAATCTCCTTCTGGATATC-3’ （SEQ ID NO.9）；

扩增P5片段的引物：

F5 5’-caaggatccACTACCACAACAGGAGAAACA-3’ （SEQ ID NO.10），

R5 5’-caagtcgacCAGTATCAAATTCTTTATCC-3’ （SEQ ID NO.11）；

扩增P6片段的引物：

F6 5’-caaggatccTATTTAATACTTATGGTCCT-3’ （SEQ ID NO.12），

R6 5’-caagtcgacTTAGTATAATTTTCTAGGTG-3’ （SEQ ID NO.13）。

VP2重组蛋白表达步骤如下：

1）扩增合成编码各个重组蛋白的DNA，连接载体到pET-28a上，酶切位点为BamHI、SalI；

2）诱导条件：37℃摇到OD600=0.4左右，加1mmol/L的IPTG诱导，30℃、190r/min诱导4h左右，收菌；

3）纯化蛋白条件：500mL菌用40mL平衡液重悬，超声(功率220W，超声40min)，离心(12000r/min，30min)，收上清，过HIS柱。

纯化流程如下：

1）样品准备：样品在上样前用0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子；

2）样品纯化：将柱装入层析柱，用5倍柱体积的buffer A进行平衡；将样品缓慢加入到平衡好的HIS镍柱子中；用5倍柱体积的buffer A进行清洗；用5～10倍体积的buffer B，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

3）超滤浓缩：纯化后蛋白含量较低，用30kd的超滤浓缩管浓缩蛋白并降低咪唑浓度。将原咪唑替换为PBS。

SDS-PAGE检测：

使用SDS-PAGE检测纯化效果，证明已成功表达各个VP2重组蛋白（图2）。

3、ELISA实验筛选特异性、灵敏度好的抗原

VP2重组蛋白包被ELISA板，采集猫泛白细胞减少综合征阳性血清、阴性血清进行检测，筛选特异性、灵敏度好的抗原。

ELISA实验如表1所示，经过分段抗原筛选，VP2重组蛋白P1（22-125）、VP2重组蛋白P2（105-235）、VP2重组蛋白P5（333-400）有活性。

表1 ELISA鉴定各肽段与血清反应活性

4、肽段串联表达

用F1，R2引物扩增，将P1、P2合并，与P5抗原串联表达。P1、P2是自然的组合，作为一个有效的肽段P

同时表达纯化了VP2蛋白全长，表达纯化步骤通前面所述，使用SDS-PAGE检测纯化效果，证明已成功表达P

实施例2 胶体金标记的链霉亲和素与山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物的结合物的制备

(1) 链霉亲和素-胶体金标记物的制备

取常温放置的1.5%胶体金，以移液器取1mL置PE管内，加入3μL 0.2M 碳酸钾振荡混匀，备用；将链霉亲和素用0.01M PBS(pH 8.0)配制成5mg/ml的溶液，以移液器取4μL加入至胶体金溶液中，振荡混匀，静止10min；以移液器吸取10μL 10% BSA加入至胶体金溶液中，振荡混匀，静止8min；以移液器吸取10μL 10% 聚乙二醇20000加入至胶体金溶液中，振荡混匀；12000r/min离心5min；弃去上清，取100μL复溶液复溶，混匀。

(2) 山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物的制备

称取0.02g生物素至PE管内，以移液器吸取1mL DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解；将市售的山羊抗猫抗抗体（Jackson，亲和纯化山羊抗猫IgG（H+L），货号：102-005-003），以移液器吸取100μL至PE管内，添加上述配制的生物素40μL，摇床振荡混匀2h；用0.01M PBS 4℃透析过夜。

(3) 胶体金标记的链霉亲和素与山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物的结合物的制备

取500μL上述制备的链霉亲和素-胶体金标记物至PE管内，添加5μL上述制备的山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物，室温摇床振荡混匀2h，混匀后置4℃冰箱备用。

复溶液：含1.0% BSA、2.0%蔗糖(质量分数)、pH 8.2的0.05mol/L的Tris缓冲液。

实施例3 结合物释放垫的制备

用Bio dot划膜仪将制备好的有胶体金标记的链霉亲和素与山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物的结合物均匀喷涂在结合物释放垫上(结合物释放垫)，每1cm结合物释放垫喷涂1μL有胶体金标记的链霉亲和素与山羊抗猫抗抗体-生物素偶联物的结合物，然后置于40℃环境中16h后取出，置于干燥环境中保存备用。

实施例4 硝酸纤维素膜的制备

将表达的猫泛白细胞减少综合征病毒VP2重组蛋白包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，将兔抗山羊抗抗体包被在硝酸纤维素膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将表达的猫细小病毒VP2重组蛋白稀释到5μg/mL，用Biodot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为1.0μL/cm；用0.03mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液将兔抗山羊抗抗体稀释到200μg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的硝酸纤维素膜置于40℃条件下干燥16h，备用。

实施例5 免疫层析试纸条制备及使用

一、免疫层析试纸条制备

将样品吸收垫(2)、结合物释放垫(7)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)依次按顺序粘贴在PS底板(1)上；结合物释放垫从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，硝酸纤维素膜从起始端有1/4区域被结合物释放垫覆盖，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PS底板的始端对齐，吸水垫的末端与PS底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线(T)(5)和质控线(C)(6)，检测线和质控线均呈与所述免疫层析试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧。将免疫层析试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。本发明的免疫层析试纸条的结构示意图见图4。

二、免疫层析试纸条使用

1、样本的制备

(1)血浆样本：用抗凝管采血，将采集血液加入并缓慢摇匀，3000～5000r/min室温离心10～30min。吸取上层黄色清亮液体即为血浆样本。

(2)血清样本：将采集血液加入采血管内，室温倾斜放置，待上层有黄色清亮液体析出时3000～5000r/min室温离心10～30min。吸取上层黄色清亮液体即为血清样本。

2、免疫层析试纸条检测

取已恢复至室温的上述样本，以移液器准确吸取5μL垂直加入加样孔中，再用移液器吸取样本稀释液测液80μL垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，反应10min，对免疫层析试纸条进行判读。若未出现C线，表明不正确的操作过程或免疫层析试纸条已失效，应用新的免疫层析试纸条重新测试。

3、检测结果判读

质控线（C）与检测线（T）同时显现紫色条带，检测结果为阳性；质控线（C）显现紫色条带，检测线（T）未显现条带，检测结果为阴性。

结果解释见表2：

表2 结果解释

实施例6 免疫层析试纸条性能测定

1、灵敏度测定

将猫泛白细胞减少综合征病毒抗体标准品用样本稀释液配制成系列浓度：1/80、1/40、1/20、1/10，分别用免疫层析试纸条进行检测。

结果如图5所示，本发明的免疫层析试纸条检测灵敏度好。

2、符合率测定

分别用P1、P2、P

表3 验证各抗原肽段的符合率

3、特异性测定

分别用P1、P2、P

表4 验证各抗原肽段的特异性

4、37℃老化实验

为了验证产品的稳定性，分别用P5- P

表5 37℃老化实验结果

序列表

<110> 北京纳百生物科技有限公司

<120> 一种检测猫泛白细胞减少综合征病毒抗体的免疫层析试纸条、制备方法及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1754

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 1

atgagtgatg gagcagtaca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60

acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120

tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180

atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240

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tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840

acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggagat 900

actaactttg gtcatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960

aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020

ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080

cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140

ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacataa 1200

tagcacatca agatacagga agatatccag aaggagattg gattcaaaat attaacttta 1260

accttcctgt aacaaatgat aatgtattgc taccaacaga tccaattgga ggtaaaacag 1320

gaattaacta tactaatata tttaatactt atggtccttt aactgcctta aataatgtac 1380

caccagttta tccaaatggt caaatttggg ataaagaatt tgatactgac ttaaaaccaa 1440

gacttcatgt aaatgcacca tttgtttgtc aaaataattg tcctggtcaa ttatttgtga 1500

aagttgcgcc taatttaaca aatgaatatg atcctgatgc atctgctaat atgtcaagaa 1560

ttgtaactta ctcagatttt tggtggaaag gtaaattagt atttaaagct aaactaagag 1620

cctctcatac ttggaatcca attcaacaaa tgagtattaa tgtagataac caatttaact 1680

atgtaccaag taatattgga ggtatgaaaa ttgtatatga aaaatctcaa ctagcaccta 1740

gaaaattata ctaa 1754

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caaggatccg gatctgggaa cgggtctgga g 31

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagtcgaca tctcctggat taaaccaaac 30

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaaggatcca ttgtaacacc ttggtcattg g 31

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacgtcgaca ccatggtata tatttgttgg tg 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaggatcct ggaaaccaac cataccaact c 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caagtcgact ggtgcactat aaccaacctc a 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caaggatcca gacgtggtgt aactcaaatg g 31

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caagtcgact ccaatctcct tctggatatc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caaggatcca ctaccacaac aggagaaaca 30

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagtcgacc agtatcaaat tctttatcc 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caaggatcct atttaatact tatggtcct 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caagtcgact tagtataatt ttctaggtg 29

<210> 14

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser

1 5 10 15

Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala

20 25 30

Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe

35 40 45

Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu

50 55 60

Arg Phe Thr Tyr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln Thr

85 90 95

Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn Ser

100 105 110

Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Lys Arg

115 120 125

Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Lys Gly Asn Met Ala

130 135 140

Leu Asp Asp Thr His Val Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val Asp

145 150 155 160

Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu Ile

165 170 175

Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu Ile

180 185 190

Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro Pro

195 200 205

Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala Leu

210 215 220

Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser Glu

225 230 235 240

Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp Arg

245 250 255

Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly Thr

260 265 270

Ser Gly Thr Pro Thr Asn Val Tyr His Gly

275 280

<210> 15

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccggctgaag ttggttactc tgctccgtac tactctttcg aagcttctac ccagggtccg 60

ttcaaaaccc cgatcgctgc tggtcgtggt ggtgctcaga ccgacgaaaa ccaggctgct 120

gacggtgacc cgcgttacgc tttcggtcgt cagcacggtc agaaaaccac caccaccggt 180

gaaaccccgg aacgtttcac ctacggttct ggtaacggtt ctggtggtgg tggtggtggt 240

ggttctggtg gtgttggtat ctctaccggt accttcaaca accagaccga attcaaattc 300

ctggaaaacg gttgggttga aatcaccgct aactcttctc gtctggttca cctgaacatg 360

ccggaatctg aaaactacaa acgtgttgtt gttaacaaca tggacaaaac cgctgttaaa 420

ggtaacatgg ctctggacga cacccacgtt cagatcgtta ccccgtggtc tctggttgac 480

gctaacgctt ggggtgtttg gttcaacccg ggtgactggc agctgatcgt taacaccatg 540

tctgaactgc acctggtttc tttcgaacag gaaatcttca acgttgttct gaaaaccgtt 600

tctgaatctg ctacccagcc gccgaccaaa gtttacaaca acgacctgac cgcttctctg 660

atggttgctc tggactctaa caacaccatg ccgttcaccc cggctgctat gcgttctgaa 720

accctgggtt tctacccgtg gaaaccgacc atcccgaccc cgtggcgtta ctacttccag 780

tgggaccgta ccctgatccc gtctcacacc ggtacctctg gtaccccgac caacgtttac 840

cacggt 846