一种用于猕猴桃的RAPD分子标记多态性选育方法及引物和试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于猕猴桃的RAPD分子标记多态性选育方法及引物和试剂盒，该方法包含：以待测猕猴桃的基因组DNA为模板，以如SEQ ID.NO1所示的核苷酸序列或如SEQ ID.NO2所示的核苷酸序列为引物，进行PCR反应，根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳条带判断待测猕猴桃的变异多态性：若PCR扩增产物与对照相比特异条带大于或等于1条，同时扩增条带大于或等于7条，则该枝条、种苗或果实为具有丰富变异多态性；如果PCR扩增产物与对照相比无特异条带，且小于7条扩增条带，则枝条、种苗或果实为非变异多态性枝条。本发明的方法提高了猕猴桃育种和筛选效率，缩短育种年限。

说明书

技术领域

本发明涉及一种多态性选育方法，具体涉及一种用于猕猴桃的RAPD分子标记多态性选育方法及引物和试剂盒。

背景技术

猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属藤本果树，被誉为“水果之王”，酸甜可口，营养丰富。我国是猕猴桃属植物的原始起源中心和分布中心，拥有丰富的猕猴桃种质资源。全世界共发现66个猕猴桃种，约118个种下分类单元(变种，变型)，其中有62个种原产于我国。尽管我国猕猴桃种质资源蕴藏丰富，但猕猴桃品种的开发和利用发展缓慢。我国猕猴桃产业较新西兰起步晚，近年来虽有了迅猛的发展，但新品种的果实品质，耐贮性和抗逆性还有待改进。目前，我国的主要栽培种有海沃德、徐香、红阳、翠香、秦美、亚特、华美 2号、华光系列等，还有许多野生种，其中海沃德是新西兰引进的品种，其他是我国培育的品种，与国外品种相比较，我国的品种规模化种植水平较低，果实贮藏性和品种抗病虫能力不足。因此，通过常规技术与现代育种技术相结合，培育市场竞争力强的世界性新品种，对我国猕猴桃产业的持续发展具有重要意义。

由于猕猴桃是雌雄异株，并且自然杂交明显，利用常规的手段对其进行谱系分析、品种鉴定以及遗传多样性分析等存在一定的困难。猕猴桃属植物一般形态接近，传统方法存在主观的判断因素，且形态分类方法受到时间和空间的限制，对专业人员要求高，鉴别难度大，精确度低。因此学者们分别利用RAPD、SSR、SRAP、SCoT等分子标记手段对不同猕猴桃的遗传多样性进行了分析，并建立了相关的指纹图谱。

在近年来出现的众多的DNA指纹图谱技术中，随机扩增多态性DNA技术(RAPD)由于其简便、快速、有效等优点，克服了其他分子标记技术鉴别费用高，重复性差等缺点，已广泛应用于动、植物的遗传多样性研究中。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于猕猴桃的RAPD分子标记多态性选育方法及引物和试剂盒，提高了猕猴桃育种和筛选效率，缩短了育种年限。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于猕猴桃的RAPD分子标记多态性选育方法，该方法包含：以待测猕猴桃的基因组DNA为模板，以如SEQ ID.NO1所示的核苷酸序列或如SEQ ID.NO2所示的核苷酸序列为引物，进行PCR反应，根据PCR扩增产物和对照的琼脂糖凝胶电泳条带判断待测猕猴桃的变异多态性：若PCR扩增产物与对照相比特异条带大于或等于1条，同时扩增条带大于或等于7条，则该枝条、种苗或果实为具有丰富变异多态性；如果PCR扩增产物与对照相比无特异条带，且小于7条扩增条带，则枝条、种苗或果实为非变异多态性枝条；其中，所述对照为以亲本的基因组DNA 作为模板，以如SEQ ID.NO1所示的核苷酸序列或如SEQ ID.NO2所示的核苷酸序列为引物经PCR反应扩增得到的产物。

优选地，所述PCR反应的扩增体系为包含：MgCl

优选地，所述PCR反应的扩增体系为包含：MgCl

优选地，所述PCR反应的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性2 min，36℃退火1min，72℃延伸2min，34个循环；72℃10min；4℃保存。

本发明的另一目的是提供一种用于猕猴桃的RAPD-PCR扩增的引物，该引物包含：如SEQ ID.NO1所示的核苷酸序列或如SEQ ID.NO2所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种用于猕猴桃的RAPD分子标记多态性选育的试剂盒，该试剂盒中的引物采用所述的用于猕猴桃的RAPD-PCR扩增的引物。

本发明的用于猕猴桃的RAPD分子标记多态性选育方法及引物和试剂盒，具有以下优点：

本发明的方法通过PCR扩增条带多少及特异性就能鉴定猕猴桃新品种，并通过多态性条带及特异性条带预判将来的新品种，简单快速方便，经济有效，预测可信度高。本发明在幼苗初期和初果期即能预判新品种，可以用于猕猴桃新品种的早期筛选，在辐射育种初期就能筛选后代是否产生新的变异，准确可靠，达到新品种选育和种质创新的要求，同时鉴于猕猴桃的童期生长、遗传背景复杂等特点，本发明将会在很大程度上提高猕猴桃育种的效率，缩短育种年限。

附图说明

图1为RAPD分子标记引物在亲本混合DNA中PCR得到的电泳图。

图2为中子辐射猕猴桃茎段嫁接成活曲线。

图3为中子辐射猕猴桃种子萌发率曲线。

图4为中子辐射猕猴桃花粉存活力曲线。

图5为引物S1132在模板1中的特异性条带

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验例1海沃德和徐香的基因组DNA的提取

首先分别取现有的海沃德和徐香的嫩叶(注：夏天取新鲜叶片时应带冰盒，将取下叶片立刻放冰上，防止过度失水，另外取材尽量取用嫩组织)，用植物CTAB法提取基因组DNA。方法具体如下：

(1)取约1cm

(2)将离心管置于65℃水浴30min，其间每隔10min轻轻摇晃离心管，使其充分混匀使CTAB充分破坏细胞膜，与DNA结合形成复合物溶于高盐溶液；

(3)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，颠倒摇晃5min；

(4)12000r/min离心10min，收集上清；

(5)重复步骤(3)和(4)；

(6)向上清中加入两倍体积预先冰冻的无水乙醇，置于-20℃冰冻 40min；

(8)12000r/min离心10min，弃上清，加入75％的乙醇，悬浮沉淀，常温下静置5min，弃上清；

(9)室温干燥，溶于20μL无菌水中，然后加入1/10体积的RNAase (1mg/mL)37℃处理40min后-20℃保存备用；

实验例2 RAPD分子标记的筛选

以海沃德和徐香基因组DNA为模板，进行RAPD-PCR实验，筛选如下表1中的RAPD引物，从中筛选能扩增出特异性条带较多且条带清晰、明亮的引物。

RAPD-PCR扩增体系：采用KAPATaq HotStart PCR试剂盒(购自Kapa Biosystems)，其中MgCl

RAPD-PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性2min，36℃退火1min，72℃延伸2min，34个循环；72℃10min；4℃保存。

如图1所示，为RAPD分子标记引物PCR得到的电泳图(图中，4：S1104， 7：S1107，9：S1109，14：S1114，30：S1130，32：S1132，35：S1135，36： S1136，71：S1171，76：S1176，77：S1177)，共筛选出2条引物，分别是 S1132(SEQ ID.NO1)和S1176(SEQ ID.NO2)。

表1筛选的RAPD引物

实验例3待测猕猴桃材料准备

(1)育种材料准备

取海沃德和徐香猕猴桃成年树的一年生健壮枝条、成熟种子及花粉。枝条、成熟种子及花粉保鲜处理，包括枝条的杀菌保湿、种子和花粉的干燥。采集地点为陕西眉县，得到枝条600，种子500克，花粉500克。

(2)待测猕猴桃材料准备

选取海沃德和徐香的一年生健康枝条，截取长度为30-40cm，将枝条分为6组，每组30根，6组的辐射剂量分别是：0、20、40、60、80和100Gy，辐射时间为10分钟，随后将茎段嫁接到成年猕猴桃上，统计其嫁接成活率，从而得到猕猴桃茎段快中子辐射后的嫁接成活曲线，如图2所示。

选取猕猴桃成熟种子，种子分为6组，每组500克种子，6组的辐射剂量分别是：0、2、4、6、8和10Gy，辐射时间为1分钟，，统计辐射后的种子发芽率，种子发芽率曲线，如图3所示。

选取猕猴桃当年的成熟花粉，分别取6组，每组500克花粉，对花粉粒进行快中子辐射，6组的辐射剂量分别是：0、0.2、0.4、0.6、0.8和1Gy，辐射时间为20秒，每个处理花粉粒约500克。统计辐射后的花粉活力，如图4 所示。然后分别将不同辐射剂量处理的花粉授粉到徐香和海沃德猕猴桃将开未开的花朵上，进行套袋及标记，随后统计结果情况及生长情况。

实验例4多态性鉴定

(1)提取猕猴桃辐射枝条、种苗及果实的基因组DNA，提取方法采用 CTAB法，方法同上述实验例1。

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别用S1132、S1176引物进行PCR扩增，扩增条件具体如下：

扩增体系：MgCl

RAPD-PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性2min，36℃退火 1min，72℃延伸2min，34个循环；72℃10min；4℃保存。

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，若PCR扩增产物与图1中32或76两个扩增条带对照相比，假若特异条带大于或等于1条，同时扩增条带大于或等于7条，则该枝条、种苗或果实为具有丰富变异多态性(特异条带显示的是辐射诱导突变的条带，而条带数大于或等于7条说明与亲本保持一致)；如果PCR扩增产物与对照相比无特异条带，且小于7条扩增条带，则枝条、种苗或果实为非变异多态性枝条。如图5所示，模板1用引物S1132扩增的条带与亲本混合样本中该条引物扩增条带相比较有2条特异性条带，说明此模板具有辐射变异多态性条带，可作为后期的育种材料，具有形成新品种的潜力。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。