一种用于美容抗衰的干细胞制剂及其制备方法和应用

摘要

本发明适用于生物技术领域，提供了一种用于美容抗衰的干细胞制剂及其制备方法和应用，该干细胞制剂包括A组分和B组分；所述A组分包括血小板浓缩生长因子；所述B组分包括脐带间充质干细胞、胎盘多肽、血清、透明质酸溶液；所述胎盘多肽的质量为透明质酸溶液的8％～10％；所述血清的质量为透明质酸溶液的20％～35％。本发明提供的干细胞制剂具有注射后易于血管新生、组织再生、移植细胞成活率高等优点，可消除面部皱纹，改善皮肤质地，提亮肤色，修复效果好，维持时间长。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于美容抗衰的干细胞制剂及其制备方法和应用。

背景技术

目前美容行业在面部微整形中常用的是透明质酸，作为最受欢迎的注射材料之一，透明质酸具有便捷有效，快速生效，能够有效解决多种皱纹的作用。但是，透明质酸注射进入皮肤后，随着时间推移会被慢慢代谢消失，且代谢速度因人而异，一般维持4～6个月左右。具体而言，影响透明质酸代谢的因素主要有两个方面：一方面体质偏瘦的人注射透明质酸后吸收的速度要比体质偏胖的人快，另一方面年龄越大注射透明质酸后相对年轻的皮肤代谢更快，保持时间也相应更短些。而数据显示，实施面部除皱抗衰美容的人群大多集中在35～55岁之间，抗衰人群的皮肤自身合成透明质酸的能力下降，对外来的透明质酸代谢会更快。

更重要的是，透明质酸注射除皱仅有填充效果，而对与之联合使用的细胞无任何促进生长、增殖等营养作用，且其支撑作用也不足以为细胞增殖和分化提供良好的生存环境，不能使细胞充分发挥作用，抗衰效果单一。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种用于美容抗衰的干细胞制剂，旨在解决背景技术中提出的目前常用面部抗衰的单纯注射透明质酸或透明质酸与不同细胞联合注射，存在的维持时间短和效果单一的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种用于美容抗衰的干细胞制剂，其包括A组分和B组分；所述A组分包括血小板浓缩生长因子；所述B组分包括干细胞、胎盘多肽、血清、透明质酸溶液；所述胎盘多肽的质量为透明质酸溶液的8％～10％；所述血清的质量为透明质酸溶液的20％～35％。其中，血小板浓缩生长因子(PCGF)为自体PCGF，血清为自体血清。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述透明质酸溶液的质量百分比浓度为0.4％～0.8％。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述A组分与所述B组分的体积比为(2～4)∶5。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述干细胞包括但不限于脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘等来源的间充质干细胞。本行业涉及的干细胞与本发明制剂其余配方的组合均被认为包含在本发明内。

作为本发明实施例的另一种优选方案，每5mL所述B组分中包含(1.5～2)×10

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

取新鲜健康脐带，用缓冲液冲洗干净后，再用剪刀镊子剔去脐动脉及脐静脉，剥离出华通氏胶组织；

将华通氏胶组织充分剪碎后，再平铺于培养皿底，并加入无血清培养基，置于CO

培养3～7天后，进行半量换液和全换液，待细胞生长至融合率达80％～90％时，使用胰酶替代物消化并传代，并取第3～5代脐带间充质干细胞，备用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述干细胞制剂的制备方法，其包括以下步骤：

取血小板浓缩生长因子，并剪碎，得到A组分；

取干细胞，并加入胰酶替代物消化细胞，得到细胞悬液；

将细胞悬液进行离心处理，弃上清后，再加生理盐水重悬细胞，然后再次离心，弃上清，收集细胞；

以透明质酸溶液为母液，并加入8％～10％的胎盘多肽、20％～35％的血清，配制得到胶体状溶液；

用胶体状溶液重悬上述收集到的细胞，得到所述干细胞制剂。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的干细胞制剂。另外，上述的干细胞制剂可用于美容抗衰。

在本发明中：

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，具有旺盛的自我更新能力以及多向分化的潜能，在适宜的条件下，人脐带间充质干细胞能定向分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等，并且能够分泌多种细胞活性因子，通过免疫调节可以抑制炎症等。相较于脂肪等其他来源的细胞，脐带间充质干细胞取材更方便、增殖能力更强、免疫原性更低，应用范围更广且无伦理学争议。

胎盘多肽是分子量仅为3000道尔顿的小分子活性功能多肽，可以直接肌肉和静脉注射。既可用于临床治疗，又有保健预防功能，具有增加微循环，提高新陈代谢、修复受伤的皮肤组织，溶解老化的角质，美化肌肤，抑制发炎及抗过敏等作用。

随着整形外科、运动医学、牙周病学、口腔颌面外科、种植学的不断发展进步，能促进软、硬组织愈合的血小板浓缩物的开发成为新的研究热点，且在临床上被越来越广泛的运用。其研究的主体主要是存在于血浆和血小板中的生长因子，这些生长因子能在软、硬组织愈合的过程中发挥促进作用，加快细胞增殖和新生血管形成的进程。血小板浓缩生长因子(Platelet-Concentrated Growth Facto rs，PCGF)是继富血小板血浆(Platelet-RichPlasma，PRP)和富血小板纤维蛋白(Platelet-Rich Fibrin，PRF)之后的第三代血小板浓缩制品，是一种富含高浓度生长因子的纤维蛋白基质。PCGF作为最新一代的血小板提取物，各种活性因子含量更高，具有特殊的三维网架结构。相比PRP制备过程繁琐，需要添加凝血酶、CaCl

PCGF是一种修补生物材料，其中含有浓缩生长因子及纤维蛋白，具有改善并增强组织再生的独特性质，是再生医疗领域中组织刺激的新技术。其中，浓缩生长因子包含：转移生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、骨形成蛋白(BMPs)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)以及成纤维细胞生长因子(FGF)。PCGF具有柔性成型血凝块及弹性有机纤维蛋白网格，促进血管生成及移植物存活，从血小板及浓缩纤维蛋白中释放出的生长因子的生物学特性，并具有修复促进和调节功能。研究表明，注射PCGF 3个月后，眼眶周皱纹明显改善，表皮与真皮交界处厚度增加，胶原蛋白、成纤维细胞和新血管的数量也明显增多。说明PCGF不仅有填充支撑的作用，而且能够刺激内源性细胞增殖，促进细胞外基质的分泌。从根本上解决皮肤细胞衰老凋亡、胶原蛋白流失的问题。

血清是一种成分复杂的混合物，其中含有细胞生长所需的各种营养成份，包括氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物、激素、生长因子等，在体外培养时为细胞提供生长增殖所需的各种营养物质，同时所含的某些成份能对细胞起到保护作用，对于细胞活性和细胞活力的维持非常重要。另一方面，自体血清在体内对间充质干细胞可进行创伤性诱导：自体血清内含多种活性因子(如血小板衍生因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子等)及其它活性物质，离开血管后注射进入皮下，会启动创伤修复的效应，强化皮下组织再生的效果。

相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的干细胞制剂包括A、B两个组分，其中A组分为血小板浓缩生长因子(PCGF)；B组分包含脐带间充质干细胞、自体血清、透明质酸和胎盘多肽。A组分不仅本身具有极强的可塑性，能够支撑和填充皮肤凹陷，修复皮肤缺损，而且其中含有丰富的生长因子能够促进皮肤表皮细胞、血管再生，进入皮肤深层也能促进皮下组织新生，同时又可刺激成纤维细胞增殖，进而分泌更多的胶原蛋白和透明质酸；B组分中的脐带间充质干细胞能发挥免疫调控作用，为细胞生长提供良好的微环境，促使皱纹区皮肤组织细胞增殖、加强透明质酸和胶原蛋白的合成。A组分为B组分的细胞提供多种生长因子，保证细胞的活率，促进细胞增殖，延长细胞在体内的作用时间；当A组分被逐渐代谢吸收，在B组分干细胞的刺激下生长的新生组织将填充其原有的空间，提高整体的填充效果和组织成活率。两个组分协同作用，全面调节皮肤细胞代谢，消除皱纹，改善肤质，效果维持时间长。

(2)本发明提供的干细胞制剂采用分层注射的方式：A组分注射在面部皮肤的浅表层，B组分注射在面部皮肤的真皮层与皮下组织浅层之间。相比于所有成分均注射到同一皮肤深度，分层注射是根据各组分的不同特点和在皮肤内起作用的机制，使不同组分到达各自最佳的作用深度，更易发挥出各种成分的功能，效果更优。

(3)本发明提供的干细胞制剂是通过皮肤组织在皮下发生的生理性增生或生理性再生的机理来除皱，与单纯使用生物材料填充方式除皱或使用化学物质刺激皮肤组织发生异物样增生的方式除皱有本质区别，不仅见效快，而且能从根本上解决皮肤衰老的问题。

(4)本发明于本领域而言，操作方法简单、安全，利用再生医学技术，采用配方组合设计，避免了细胞活性的损失，极大地提高制剂的功效，可获得较持久的抗衰效果。

(5)本发明采用脐带间充质干细胞进行抗衰美容治疗，具有良好的促进机体再生的作用，而且免疫原性低，疗效显著。

(6)异体间充质干细胞来源充足，可应用库存细胞而获得及时治疗，从而克服了培养自体干细胞采样受限、培养周期长、活力不足等问题。

(7)本发明提供的干细胞制剂由A、B两个部分组成，可根据个体的皮肤状况及个人需求灵活搭配使用。

综上所述，本发明提供的制备方法简便易行，安全可靠，本发明提供的干细胞制剂具有注射后易于血管新生、组织再生、移植细胞成活率高等优点，可消除面部皱纹，改善皮肤质地，提亮肤色，修复效果好，维持时间长。

附图说明

图1为血液离心后的分层示意图。

图2为分离得到的血小板浓缩因子的外观图。

图3为第3代脐带间充质干细胞的观察图。

图4～10为脐带间充质干细胞流式检测结果图。

图11为注射实施例3提供的干细胞制剂使用前后的面部纹理对比图；其中，a为注射前，b为注射5天后。

图12为注射实施例3提供的干细胞制剂使用前后的面部红区对比图；其中，a为注射前，b为注射13天后。

图13为注射实施例3提供的干细胞制剂使用前后的面部毛孔对比图；其中，a为注射前，b为注射18天后。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

该实施例提供了一种用于美容抗衰的干细胞制剂，其包括A组分和B组分，具体的，该干细胞制剂的制备方法包括以下步骤：

S1、称取一定量的注射用中分子量透明质酸，用生理盐水配置成0.8％的透明质酸溶液，4℃冰箱避光保存并使其自然溶解，直至完全溶解大约需要72小时左右，备用。

S2、血小板浓缩生长因子(PCGF)及血清的获得：

(1)抽取自体血液8mL于未添加抗凝剂的采血管中，将采血管放入离心机中并配平。

(2)设置离心程序，离心设备通过：加速30sec，2700r/min 2min，2400r/min 4min，2700r/min 4min，3000r/min 3min，减速33sec的差速离心步骤获得分层样本。

(3)离心后分三层：上层淡黄色液体为血清，约2mL；中间黄色凝胶即血小板浓缩生长因子，约2mL；下层红色为红细胞与碎片，4mL。吸取上层血清并保存备用；将凝胶部分和少量分界层的红细胞分离出来，得到血小板浓缩生长因子，备用。

S3、脐带间充质干细胞的分离与培养：

(1)取新鲜健康脐带，用PBS缓冲液冲洗干净后，用剪刀镊子剔去脐动脉及脐静脉，剥离出华通氏胶组织。

(2)将所得的华通氏胶组织充分剪碎成1mm

(3)培养第5天进行半量换液，第7天进行全量换液，培养7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形。

(4)待细胞生长至融合率达90％时，使用胰酶替代物消化并传代。

(5)取第4代的脐带间充质干细胞，备用。

S4、A组分的制备：取上述得到的血小板浓缩生长因子，并剪碎至1mm

S5、B组分的制备：

(1)选用培养至第4代的脐带间充质干细胞，镜下观察细胞状态是否良好，融合率是否达到90％。

(2)取合格品，吸弃培养皿中培养基，用生理盐水洗涤残留的培养基两遍。

(3)加入胰酶替代物消化细胞，将培养皿置于CO

(4)待细胞变圆，终止消化，得到细胞悬液；接着，用移液管反复吹打皿底，将细胞悬液转入离心管，用生理盐水洗涤培养皿两遍，将皿内的细胞悬液转移至离心管。

(5)配平，离心，1100r/min，5min。离心结束倒掉上清，加生理盐水至45mL重悬细胞，再次离心。

(6)弃上清，加生理盐水重悬细胞，取样用于细菌、真菌、支原体及内毒素等检测。同时取样进行细胞计数。

(7)以1.5×10

(8)取一定量的上述得到的0.8％的透明质酸溶液作为母液，加入8％的胎盘多肽及20％的上述自体血清，配制得到5mL的胶体状溶液。其中，胎盘多肽为国药准字号药品，可直接购买。

(9)用上述配制的胶体状溶液重悬上述收集的细胞，充分混匀，混合过程中注意避免气泡产生，即可得到B组分，其可用于皮肤深层注射。

实施例2

该实施例提供了一种用于美容抗衰的干细胞制剂，其包括A组分和B组分，具体的，该干细胞制剂的制备方法包括以下步骤：

S1、称取一定量的注射用中分子量透明质酸，用生理盐水配置成0.6％的透明质酸溶液，4℃冰箱避光保存并使其自然溶解，直至完全溶解大约需要72小时左右，备用。

S2、血小板浓缩生长因子(PCGF)及血清的获得：

(1)抽取自体血液10mL于未添加抗凝剂的采血管中，将采血管放入离心机中并配平。

(2)设置离心程序，离心设备通过：加速30sec，2700r/min 2min，2400r/min 4min，2700r/min 4min，3000r/min 3min，减速33sec的差速离心步骤获得分层样本。

(3)离心后分三层：上层淡黄色液体为血清，约3mL；中间黄色凝胶即血小板浓缩生长因子，约3mL；下层红色为红细胞与碎片，4mL。吸取上层血清并保存备用；将凝胶部分和少量分界层的红细胞分离出来，得到血小板浓缩生长因子，备用。

S3、脐带间充质干细胞的分离与培养：

(1)取新鲜健康脐带，用PBS缓冲液冲洗干净后，用剪刀镊子剔去脐动脉及脐静脉，剥离出华通氏胶组织。

(2)将所得的华通氏胶组织充分剪碎成1mm

(3)培养第5天进行半量换液，第7天进行全量换液，培养7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形。

(4)待细胞生长至融合率达90％时，使用胰酶替代物消化并传代。

(5)取第5代的脐带间充质干细胞，备用。

S4、A组分的制备：取上述得到的血小板浓缩生长因子，并剪碎至1mm

S5、B组分的制备：

(1)选用培养至第5代的脐带间充质干细胞，镜下观察细胞状态是否良好，融合率是否达到90％。

(2)取合格品，吸弃培养皿中培养基，用生理盐水洗涤残留的培养基两遍。

(3)加入胰酶替代物消化细胞，将培养皿置于CO

(4)待细胞变圆，终止消化，得到细胞悬液；接着，用移液管反复吹打皿底，将细胞悬液转入离心管，用生理盐水洗涤培养皿两遍，将皿内的细胞悬液转移至离心管。

(5)配平，离心，1100r/min，5min。离心结束倒掉上清，加生理盐水至45mL重悬细胞，再次离心。

(6)弃上清，加生理盐水重悬细胞，取样用于细菌、真菌、支原体及内毒素等检测。同时取样进行细胞计数。

(7)以2×10

(8)取一定量的上述得到的0.6％的透明质酸溶液作为母液，加入10％的胎盘多肽及35％的上述自体血清，配制得到5mL的胶体状溶液。其中，胎盘多肽为国药准字号药品，可直接购买。

(9)用上述配制的胶体状溶液重悬上述收集的细胞，充分混匀，混合过程中注意避免气泡产生，即可得到B组分，其可用于皮肤深层注射。

实施例3

该实施例提供了一种用于美容抗衰的干细胞制剂，其包括A组分和B组分，具体的，该干细胞制剂的制备方法包括以下步骤：

S1、称取一定量的注射用中分子量透明质酸，用生理盐水配置成0.5％的透明质酸溶液，4℃冰箱避光保存并使其自然溶解，直至完全溶解大约需要72小时左右，备用。

S2、血小板浓缩生长因子(PCGF)及血清的获得：

(1)抽取自体血液9mL于未添加抗凝剂的采血管中，将采血管放入离心机中并配平。

(2)设置离心程序，离心设备通过：加速30sec，2700r/min 2min，2400r/min 4min，2700r/min 4min，3000r/min 3min，减速33sec的差速离心步骤获得分层样本。

(3)离心后分三层：上层淡黄色液体为血清，约3mL；中间黄色凝胶即血小板浓缩生长因子，约2mL；下层红色为红细胞与碎片，5mL，如附图1所示。吸取上层血清并保存备用；将凝胶部分和少量分界层的红细胞分离出来，得到血小板浓缩生长因子，如附图2所示，备用。

S3、脐带间充质干细胞的分离与培养：

(1)取新鲜健康脐带，用PBS缓冲液冲洗干净后，用剪刀镊子剔去脐动脉及脐静脉，剥离出华通氏胶组织。

(2)将所得的华通氏胶组织充分剪碎成1mm

(3)培养第5天进行半量换液，第7天进行全量换液，培养7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形。

(4)待细胞生长至融合率达90％时，使用胰酶替代物消化并传代。

(5)取第3代的脐带间充质干细胞，备用。

S4、A组分的制备：取上述得到的血小板浓缩生长因子，并剪碎至1mm

S5、B组分的制备：

(1)选用培养至第3代的脐带间充质干细胞，镜下观察细胞状态是否良好，融合率是否达到90％。

(2)取合格品，吸弃培养皿中培养基，用生理盐水洗涤残留的培养基两遍。

(3)加入胰酶替代物消化细胞，将培养皿置于CO

(4)待细胞变圆，终止消化，得到细胞悬液；接着，用移液管反复吹打皿底，将细胞悬液转入离心管，用生理盐水洗涤培养皿两遍，将皿内的细胞悬液转移至离心管。

(5)配平，离心，1100r/min，5min。离心结束倒掉上清，加生理盐水至45mL重悬细胞，再次离心。

(6)弃上清，加生理盐水重悬细胞，取样用于细菌、真菌、支原体及内毒素等检测。同时取样进行细胞计数。

(7)以1.8×10

(8)取一定量的上述得到的0.5％的透明质酸溶液作为母液，加入9％的胎盘多肽及28％的上述自体血清，配制得到5mL的胶体状溶液。其中，胎盘多肽为国药准字号药品，可直接购买。

(9)用上述配制的胶体状溶液重悬上述收集的细胞，充分混匀，混合过程中注意避免气泡产生，即可得到B组分，其可用于皮肤深层注射。

实验例：

一、脐带间充质干细胞的鉴定

1、在细胞生长过程中，根据细胞生长的形态、生长周期等对细胞各方面的指标进行判断，结果显示培养中的脐带来源的间充质干细胞与国内外文献报道的细胞特征相符：镜下观察脐带间充质干细胞的特征，在形态上呈现相对均一的成纤维细胞样形态，细胞呈长梭形，平行或漩涡状排列，具体如附图3所示。

2、利用流式细胞术对间充质干细胞表面特异性标记进行检测，操作方法如下：

(1)取P3单细胞悬液于流式检测管中，1000rpm，离心5min；

(2)弃上清，用PBS重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1.0×10

(3)加抗体CD105、CD166、CD90、CD45、HLA-DR、CD34，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30min，同时设置同型对照；

(4)加1mL PBS，1000rpm，离心5min，弃上清；

(5)加100μL PBS，轻轻吹打混匀，上机检测。

上述检测结果如附图4～10所示，结果显示抗原CD90、CD105、CD166呈阳性表达，抗原CD45、HLA-DR、CD34呈阴性表达，且纯度较高，符合国际细胞治疗协会(ISCT)定义的间充质干细胞表面标记标准。

二、干细胞制剂效果验证：

将实施例3提供的干细胞制剂中的A、B组分分层进行求美者面部注射，注射前使用VISIA皮肤检测仪检测，可见较多纹理(如图11的a所示)，全脸进行7mL实施例3提供的干细胞制剂注射，5天后，面部纹理减少明显(如图11的b所示)。另外，注射前面部红区严重者(如图12的a所示)，注射13天后，红区改善显著(如图12的b所示)；注射前后面部毛孔(如图13的a所示)也出现明显改变，粗大毛孔减少(如图13的b所示)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。