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单链DNA在基因转染中的应用

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本发明提供了一种单链DNA在基因转染中的应用，具体包括基于传统噬菌体载体生成的环状单链DNA以及通过不对称PCR方法得到的线性单链DNA在基因转染中得以应用，与传统的环状双链质粒的转染不同，环状单链DNA的转染效率和转染试剂的浓度成正比，同等浓度的环状单链DNA更易被转染试剂递送进较难转染的细胞且表达量更高，引起的细胞毒性更低，因此，环状单链DNA能够明显降低聚合物引起的细胞毒性，使得转染效率得到有效提高，且不明显引起细胞的毒性；另外，线性单链DNA也证明了用于基因转染的可行性，因此，使用单链DNA进行基因转染，可以看到相关基因的表达，故说明单链DNA可以作为基因转染的一种载体进行基因转染。

著录项

公开/公告号CN112195193A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-01-08

原文格式PDF
申请/专利权人上海交通大学;
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申请/专利号CN202011058515.9
发明设计人宋杰;程进;唐林林;
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申请日2020-09-30
分类号C12N15/85(20060101);C12N15/66(20060101);C12N15/64(20060101);C12N15/10(20060101);
代理机构31227 上海伯瑞杰知识产权代理有限公司;
代理人范艳静
地址 200240 上海市闵行区东川路800号
入库时间 2023-06-19 09:29:07

说明书

技术领域

本发明属于基因递送技术领域，具体涉及一种单链DNA在基因转染中的应用。

背景技术

传统基因递送是指利用递送载体或者特定技术，将质粒DNA(plDNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)、反义寡核苷酸(ASO)等导入到细胞或者机体的过程。plDNA一般由于载体序列的引入，会引起不必要的基因或者蛋白的表达，RNA获取不易，不稳定，容易降解，而ASO也需要进行特定修饰才能稳定，目前常用来进行基因递送的核酸都有一定不足。而针对单链的基因递送尚未有报道，单链具有易被压缩，获取简单，且不会引入过多无意义序列等优点。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种单链DNA(ssDNA)在基因转染中的应用，具体地，基于pScaf载体的环状单链DNA将目的基因插入到pScaf载体中，通过控制培养时间获得条带单一的环状单链DNA(cssDNA)。线性单链DNA(lssDNA)通过传统的不对称PCR的方法产生。产生的lssDNA和cssDNA包含CMV增强子和启动子、目的基因、SV40 polyA等序列，减少了其他无关序列的引入，因此可以最大程度缩短DNA片段长度。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种单链DNA在基因转染中的应用。

作为本发明的优选实施例，单链DNA包括基于噬菌体载体产生的环状单链DNA和不对称PCR产生的线性单链DNA，单链DNA和转染试剂孵育后放入细胞培养皿中培养24-48h，即可看到目的蛋白的明显表达。

作为本发明的优选实施例，单链DNA的核酸数可以合成的长度在1000-50000nt之间。

作为本发明的优选实施例，转染试剂选自阳离子聚合物，更优选为Lipofectamine2000(lip 2000)或聚醚酰亚胺(PEI)。

作为本发明的优选实施例，基于pScaf载体产生的cssDNA的制备方法包括如下步骤：

(1)、将目的基因通过酶切位点连接插入pScaf载体中，得到pScaf-目的基因载体；

(2)、将10-20ng pScaf-目的基因载体和20-40ng基于M13的辅助噬菌体载体(辅助质粒pSB4423)共转染到100μL XL1-Blue感受态细胞中，培养温度为30℃；

(3)、挑取单克隆在1mL培养基中活化1h，再转移至5mL液体培养基中，30℃扩大培养4-5h；

(4)、将步骤(3)中获得的菌液在200mL 2×YT培养基中培养8-24h，根据目的基因长度，控制培养时间以获得条带单一、无杂带的目的产物；

(5)、利用nanodrop测目的产物的浓度，根据分子量计算目的产物的摩尔浓度；

(6)、使用步骤(5)中获得的cssDNA进行基因转染。

作为本发明的优选实施例，步骤(1)中，目的基因包括EGFP基因和EGFP-mCherry基因。

作为本发明的优选实施例，EGFP基因序列如SEQ ID NO.1所示；EGFP-mCherry基因序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的优选实施例，步骤(1)中，酶切位点为KpnⅠ(GGTACC)和BamHⅠ(GGATCC)。

作为本发明的优选实施例，步骤(2)中，用pScaf-目的基因载体将M13复制子与单链DNA的起始位点和终止位点整合在一起，可以减少副产物的生成。

作为本发明的优选实施例，步骤(4)中，通过S1核酸酶验证，通过控制培养时间得到的DNA确定为环状单链DNA。

作为本发明的优选实施例，基于传统的不对称PCR产生的lssDNA的制备方法包括如下步骤：

(a)、以pEGFP-N1质粒为模板，使用Takara公司的PrimerSTAR(R045A，TAKARA)酶，设计的上游引物和下游引物进行PCR反应；

(b)、将所获PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

(c)、根据DNA marker位置切下目标条带；

(d)、回收目标DNA；

(e)、利用nanodrop检测lssDNA的浓度；

(f)、使用获得的lssDNA进行基因转染。

作为本发明的优选实施例，步骤(a)中，EGFP基因序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的优选实施例，步骤(a)中，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。上游引物和上游引物的摩尔比为50:1。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明将ssDNA在基因转染中应用，与传统的环状双链质粒的转染不同，cssDNA的转染效率和DNA浓度以及转染试剂的浓度成正比，同等浓度的cssDNA更易被转染试剂递送进较难转染的细胞且表达量更高，引起的细胞毒性更低，且在使用商业化阳离子聚合物转染试剂进行转染时，cssDNA能够明显降低聚合物引起的细胞毒性，使得转染效率得到有效提高，并且不明显引起细胞的毒性；另外，lssDNA也证明了用于基因转染的可行性，因此，证明ssDNA可以作为一种基因转染以及基因递送的潜在载体。

附图说明

图1为本发明的实施例1中EGFP cssDNA在不同细胞系中的转染效果图。

图2为本发明的实施例1中EGFP-mCherry cssDNA在293T细胞中的转染效果图((a)为EGFP的表达情况，(b)为mCherry的表达情况，(c)为两种荧光蛋白合并的转染效果图)。

图3为本发明的实施例1中pScaf-EGFP载体和pScaf-EGFP-mCherry载体的基因图谱。

图4为本发明的实施例1中EGFP cssDNA和EGFP-mCherry cssDNA的基因图谱。

图5为本发明的实施例1中相同浓度的EGFP cssDNA与plDNA在不同细胞系转染的效果图。

图6为本发明的实施例1中EGFP cssDNA降低lip 2000引起的细胞毒性图。

图7为本发明的实施例1中EGFP cssDNA的单链DNA酶(S1酶)验证结果图。

图8为本发明的实例2中不对称PCR获得的EGFP lssDNA电泳结果图(1kb：1kb DNAmarker，1：双链EGFP，2：反向产物扩增结果，3：正向产物扩增结果)。

图9为本发明的实例2中EGFP lssDNA在不同细胞系中转染的效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种单链DNA在基因转染中的应用。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本实施例的基于pScaf载体产生的EGFP cssDNA以及EGFP-mCherry cssDNA用于293T细胞、Hela细胞、A549细胞的转染：

步骤一、cssDNA的构建以及提取

(1)、将EGFP基因以及EGFP-mCherry基因通过酶切位点(酶切位点KpnⅠ为GGTACC，酶切位点BamHⅠ为GGATCC)连接插入到pScaf载体中构建pScaf-EGFP载体和pScaf-EGFP-mCherry载体(如图3所示)；

(2)、将10ng pScaf-EGFP载体、10ng pScaf-EGFP-mCherry载体和15ng基于M13的pSB4423质粒共转化到XL1-Blue感受态细胞中，涂板，30℃培养16h；

(3)、挑取单克隆在1mL 2×YT(5mM MgCl

(4)、将上述培养基在5mL 2×YT(5mM MgCl

(5)、将上述菌液在200mL 2×YT培养基中30℃，220rpm培养，其中pScaf-EGFP培养8h，pScaf-EGFP-mCherry培养12h；

(6)、将上述菌液离心，8000×rcf，4℃离心10min，收集上清；

(7)、将步骤(6)所得上清加入3.2g PEG-8000以及2.4g NaCl，混匀，并置于冰水浴中冰浴30min；

(8)、将上述混合液10,000×rcf，4℃离心30min得到白色沉淀；

(9)、用1.5mL 10mM Tris(pH＝8.5)重悬沉淀，10,000g×rcf，4℃离心15min；

(10)、重复步骤(9)三次以去除残留的细菌；

(11)、向上述溶液中加入3mL裂解液(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，上下颠倒混匀，室温裂解5min；

(12)、向上述溶液中加入2.5mL终止液(3mol/L醋酸钾，pH＝5.5)，上下颠倒混匀，冰水浴15min；

(13)、10,000×rcf，4℃离心30min去除沉淀，收集上清液；

(14)、向上述上清液中加入2倍体积的无水乙醇，将混合液置于-20℃沉淀过夜；

(15)、将步骤(14)中溶液在10,000×rcf，4℃离心30min，得到EGFP cssDNA(如SEQID NO.5所示)和EGFP-mCherry cssDNA(如SEQ ID NO.6所示)；

(16)、用3mL 75％乙醇清洗EGFP cssDNA和EGFP-mCherry cssDNA(如图4所示)；

(17)、使用nanodrop对EGFP cssDNA和EGFP-mCherry cssDNA进行定量；

(18)、对得到的EGFP cssDNA加入单链DNA酶降解并进行琼脂糖凝胶电泳验证(如图7)，分别取2μg EGFP cssDNA、2μg P7560(Scaffold DNA,公司：IDT，货号：1081309)、2μgEGFP plDNA，37℃与S1核酸酶孵育30分钟，当加入特异性降解单链DNA的酶(S1核酸酶从米曲霉(aspergill suoryzae)中提取，S1核酸酶是一种特异性单链核苷酸内切酶，能降解单链DNA和单链RNA，产生5'-单链核苷酸或寡核苷酸。双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交分子对S1核酸酶具有较大的抵抗力)后，可以看到，上述步骤中得到的EGFP cssDNA以及阳性对照噬菌体环状单链DNA可以被快速降解，而plDNA无法被降解，故说明由上述步骤制备的确定为环状单链DNA。

步骤二、cssDNA用于基因转染

(19)、先将1.5μg阳离子聚合物(lip2000)与MEM培养基室温混匀5min，之后将1.3nM EGFP cssDNA与1.5μg阳离子聚合物(lip2000)进行混合，混匀在100μL MEM培养基中，室温放置15min；

(20)、将上述混合溶液滴加到事先铺好在24孔板的A549细胞、293T细胞、Hela细胞中，培养24小时；

(21)、使用荧光显微镜观察细胞的转染效率。

使用本实施例的EGFP cssDNA可以在不同的细胞系(293T细胞、Hela细胞、A549细胞)中进行表达(如图1)，且不同蛋白(如本实施例EGFP-mCherry cssDNA中EGFP和mCherry可以整合在一根cssDNA链(如图2所示，EGFP-mCherry cssDNA用于293T细胞转染，其中2a表示EGFP-mCherry cssDNA用于转染后EGFP的表达情况，2b表示EGFP-mCherry cssDNA用于转染后mCherry的表达情况，2c表示EGFP和mCherry叠加的情况，结果说明不同的基因可以整合在一条cssDNA上用于基因转染))可以构建到一根cssDNA上得到表达，说明cssDNA可以用作基因转染以及基因递送的潜在载体。

使用EGFP cssDNA进行细胞转染时(如图5)，对于较难转染的细胞，如A549细胞，EGFP cssDNA的效果比传统使用的plDNA效果好，而对于较容易转染的细胞，如Hela细胞、293T细胞，EGFP cssDNA的转染效率比plDNA低或者相差不大。可见，EGFP cssDNA的转染效果在较容易转染的细胞中没有得到很好的提高，而在较难转染的细胞中可以有很好的体现。

同等DNA浓度下，通过提高加入转染试剂lip 2000的量，可以显著提高A549的转染效率(如图6)，此外，随着转染试剂的量的提高，可以看到，plDNA组已经有明显的细胞毒性(4×lip)，而EGFP cssDNA没有引起细胞毒性，由此说明，EGFP cssDNA可以降低转染试剂lip 2000引起的细胞毒性，并提高转染效率。

因此，与传统的环状双链质粒的转染不同，cssDNA的转染效率和转染试剂的浓度成正比，同等浓度的cssDNA更易被转染试剂递送进细胞且表达量更高，引起的细胞毒性更低，且在使用商业化阳离子聚合物转染试剂进行转染时，cssDNA能够明显降低聚合物引起的细胞毒性，使得转染效率得到有效提高，并且不明显引起细胞的毒性。

实施例2：

本实施例的基于不对称PCR产生的线性单链DNA：EGFP lssDNA用于293T细胞和MGC803细胞的转染：

步骤一、lssDNA的构建以及提取

(a)、按照如下配方配制PCR反应体系：

反向产物扩增：pEGFP-N1质粒：2μL(10ng/μL)、上游引物：2μL(0.2μM)、下游引物：2μL(10μM)、PrimeSTAR Max Premix(25μL，R045A，Takara)；ddH

正向产物扩增：pEGFP-N1质粒：2μL(10ng/μL)、上游引物：2μL(10μM)、下游引物：2μL(0.2μM)、PrimeSTAR Max Premix(25μL，R045A，Takara)；ddH

其中，正向产物扩增和反向产物扩增中的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

(b)、按照如下反应进行扩增：

95℃反应10min，95℃反应30s，60℃反应30s，72℃反应1min(其中，95℃反应30s，60℃反应30s，72℃反应1min分别进行35个循环)，72℃反应10min。

(c)、反应结束后，将上述反应产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，100V，40min；

(d)、电泳结束后，切下目的条带(如图8所示)，使用切胶回收试剂盒进行DNA的回收；

(e)、使用nanodrop对EGFP lssDNA进行定量；

步骤二、lssDNA用于基因转染

(f)、先将1.5μg阳离子聚合物(lip2000)与MEM培养基室温混匀5min，之后将0.5μgEGFP lssDNA与1.5μg lip2000进行混合，混匀在100μL MEM培养基中，室温放置15min；

(g)、将上述混合溶液滴加到事先铺好在24孔板的293T细胞和MGC803细胞中，培养24小时；

(h)、使用荧光显微镜观察EGFP lssDNA的表达情况(如图9所示)。

本实施例证明了lssDNA用于基因转染的可行性。

综上可知，实施例1和实施例2成功实现了ssDNA在细胞中的表达，因此证明ssDNA可以作为一种新型的基因转染以及基因递送的潜在载体。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 单链DNA在基因转染中的应用

<141> 2020-09-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1610

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ccatgcatta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 60

gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 120

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<210> 2

<211> 3712

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2