一种高灵敏度信号稳定的化学发光底物检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种高灵敏度信号稳定的化学发光底物检测试剂盒，涉及生物医药试剂盒技术领域。本发明包含试剂A和试剂B；试剂A为氧化物包括：采用过氧化氢或者过硼酸钠或者过氧化脲中任意一种的氧化物、缓冲物质、稳定剂；试剂B为化学发光底物，包括：采用鲁米诺或者鲁米诺钠盐或鲁米诺异构体中任意一种的发光剂、增强剂：采用n‑烷基吩噻嗪或其钠盐中任意一种的增强剂、第二增强子。本发明能提高化学发光强度，维持信号稳定性；检测出飞克级别蛋白，具有灵敏度高，化学信号持续时间长，既适用于荧光CCD相机的荧光扫描，也可感光X光胶片，化学信号稳定实验重复性好的优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药试剂盒技术领域，特别是涉及一种高灵敏度信号稳定的化学发光底物检测试剂盒。

背景技术

化学发光免疫分析法(CLIA)是将化学发光技术与免疫化学反应相结合的一种检测方法，可用于抗原、抗体、核酸等的检测和分析，在免疫印记中例如蛋白印迹(WesternBlot)、DNA印迹(Southern Blot)和RNA印迹(Northern Blot)中得到广泛应用。

辣根过氧化物酶(HRP)常用于标记抗原或者抗体，免疫反应后，鲁米诺作为发光底物，在酶标免疫反应物和发光试剂的作用下通过氧化还原反应发光，然后根据发光强度确定抗原或抗体。但是鲁米诺作为发光底物，稳定性差、信号持续时间短、发光强度偏低。

近年来，人们陆续发现某些可以增强HRP催化鲁米诺化学发光体系发光强度和信号持续时间的化学试剂，这类化学试剂称为增强剂。例如4-(咪唑-1-基)苯酚；4‘-(1H-1,2,4-三唑基)苯酚；对香豆酸，4-碘苯硼酸等。专利U.S.Pat.No.5,171,668首次描述了用吩噻嗪-N-烷基磺酸衍生物作为鲁米诺化学发光的增强剂。但这些发光强度仍不够，灵敏度不高。利US.Pat.No.20080241868描述添加酰化催化剂可以显著增加化学发光的强度。这些物质是一些4-氨基吡啶类物质。与增强剂结合使用可以进一步增强发光强度。因此也叫第二增强子或者共增强子。然而4-氨基吡啶催化的反应难以调控，即使非常少的化合物也会产生大量的光信号，信号强度强，但是衰减的速度也快。

进口试剂盒有信号强，信号持续时间长的产品，但是价格十分昂贵。因此发明灵敏度高，信号衰减速度慢的国产化学发光底物试剂盒具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种高灵敏度信号稳定的化学发光底物检测试剂盒，解决了以上问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的一种高灵敏度信号稳定的化学发光底物检测试剂盒，包括用于提供高灵敏度的、信号衰减慢的、稳定性好的HRP酶促化学发光底物检测，包含试剂A和试剂B；

所述试剂A包括：

氧化物：采用过氧化氢或者过硼酸钠或者过氧化脲中任意一种，其浓度在1-10mM之间；

缓冲物质：采用乙酸缓冲液或者柠檬酸缓冲液或者其他本技术常用的缓冲液中任意一种，浓度为0.01-0.1M，pH为5.0-5.2；

稳定剂：采用EDTA，浓度为0.001M；

所述试剂B为化学发光底物，包括：

发光剂：采用鲁米诺或者鲁米诺钠盐或鲁米诺异构体中任意一种，浓度在0.1mM到10.0mM之间：

增强剂：采用n-烷基吩噻嗪或其钠盐中任意一种，浓度在1mM至20.0mM之间；

第二增强子：采用至少含有两个N原子的稠环化合物嘌呤或其衍生物，浓度在1mM至30.0mM之间；

使用方法：使用前取等量的试剂A和试剂B混合均匀，滴加在有HRP标记抗原或者核酸的转印膜上。

进一步地，所述试剂A是经过如下配置方法配置而成的(以1升为例)：

S01、称取0.86g柠檬酸和1.74g柠檬酸钠溶于900ml超纯水中；

S02、加入0.3gEDTA二钠，搅拌均匀；

S03、加入12g四水合过硼酸钠盐，搅拌均匀；

S04、超纯水定容至1L,2-8℃保存至少一年。

进一步地，所述试剂B是经过如下配置方法配置而成的(以1升为例)：

P1、称20.7gN-环己基-2-氨基乙磺酸溶解于900ml超纯水中；

P2、用浓盐酸调pH值至9.0；

P3、加入0.4g鲁米诺钠盐，搅拌溶解；

P4、取1.7g 3-(吩噻嗪-10-基)丙1-磺酸钠溶于10ml乙二醇中；

P5、加入溶解后的3-(吩噻嗪-10-基)丙1-磺酸钠，搅拌均匀；

P6、取1.1g腺嘌呤溶于10ML 0.5M氢氧化钠溶液中；

P7、加入溶解后的腺嘌呤，搅拌均匀；

P8、超纯水定容至1L，2-8℃避光保存至少一年。

本发明相对于现有技术包括有以下有益效果：

1、本发明通过添加嘌呤或者嘌呤衍生物作为共增强剂，不仅能提高化学发光强度，还能维持信号稳定性；

2、本发明采用化学发光底物试剂A和试剂B的配方，可以检测出飞克级别蛋白，灵敏度高。

3、本发明的化学发光试剂盒，化学信号持续时间长，既适用于荧光CCD相机的荧光扫描，也可感光X光胶片，化学信号稳定实验重复性好。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中嘌呤类共增强剂与4-氨基吡啶类共增强剂对鲁米诺化学发光反应的发光强度和时间的影响图；

图2为本发明实施例2中化学发光底物以及市售进口化学发光底物，灵敏度测试的蛋白质印迹图(Western Blot)；

图3为本发明示例2的化学发光底物以及市售进口化学发光底物，发光信号持续时间比较的蛋白质印迹图(Western Blot)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一种高灵敏度信号稳定的化学发光底物检测试剂盒，包括用于提供高灵敏度的、信号衰减慢的、稳定性好的HRP酶促化学发光底物检测，其特征在于，包含试剂A和试剂B；

所述试剂A包括：

氧化物：采用过氧化氢或者过硼酸钠或者过氧化脲中任意一种，其浓度在1-10mM之间；

缓冲物质：采用乙酸缓冲液或者柠檬酸缓冲液或者其他本技术常用的缓冲液中任意一种，浓度为0.01-0.1M，pH为5.0-5.2；

稳定剂：采用EDTA，浓度为0.001M；

所述试剂B为化学发光底物，包括：

发光剂：采用鲁米诺或者鲁米诺钠盐或鲁米诺异构体中任意一种，浓度在0.1mM到10.0mM之间：

增强剂：采用n-烷基吩噻嗪或其钠盐中任意一种，浓度在1mM至20.0mM之间；

第二增强子：采用至少含有两个N原子的稠环化合物嘌呤或其衍生物，浓度在1mM至30.0mM之间；

使用方法：使用前取等量的试剂A和试剂B混合均匀，滴加在有HRP标记抗原或者核酸的转印膜上。

其中，试剂A是经过如下配置方法配置而成的(以1升为例)：

S01、称取0.86g柠檬酸和1.74g柠檬酸钠溶于900ml超纯水中；

S02、加入0.3gEDTA二钠，搅拌均匀；

S03、加入12g四水合过硼酸钠盐，搅拌均匀；

S04、超纯水定容至1L,2-8℃保存至少一年。

其中，试剂B是经过如下配置方法配置而成的(以1升为例)：

P1、称20.7gN-环己基-2-氨基乙磺酸溶解于900ml超纯水中；

P2、用浓盐酸调pH值至9.0；

P3、加入0.4g鲁米诺钠盐，搅拌溶解；

P4、取1.7g 3-(吩噻嗪-10-基)丙1-磺酸钠溶于10ml乙二醇中；

P5、加入溶解后的3-(吩噻嗪-10-基)丙1-磺酸钠，搅拌均匀；

P6、取1.1g腺嘌呤溶于10ML 0.5M氢氧化钠溶液中；

P7、加入溶解后的腺嘌呤，搅拌均匀；

P8、超纯水定容至1L，2-8℃避光保存至少一年。

实施例1：嘌呤类增强剂对鲁米诺化学发光的影响；

步骤一：配置试剂A和试剂B；

试剂A：四水合过硼酸钠盐 10mM

柠檬酸缓冲液ph 5.0 0.01M

试剂B： 鲁米诺钠盐 5mM

3-(吩噻嗪-10-基)丙1-磺酸钠 5mM

共增强剂：

(一)无共增强剂-

(二)4-N’N’.二甲基氨基吡啶(DMAP) 10mM

(三)腺嘌呤： 10mM

(四)嘌呤： 10mM

N-环己基-2-氨基乙磺酸ph9.0 100mM

步骤二：将制备的试剂A和试剂B置于4℃冰箱中保存。使用时试剂A和试剂B等比例混合；

步骤三：一次性聚苯乙烯黑色96孔微板。微板每孔分别加入上述示例工作液200ul，然后每孔加入100ng/mL辣根过氧化物酶溶液(HRP type VIa)2ul，混匀。利用Synergy-H1全功能微孔板检测仪连续测定在不同时间，每组化学发光底物的发光强度绘制曲线，如图1所示；

从图1中可以看到,相比不含增强剂,使用本专利披露至少含有两个N原子的稠环化合物嘌呤或其衍生物作为共增强剂，鲁米诺化学发光反应的发光强度可以有效地增强10-50倍。此外,与4-氨基吡啶类增强剂(DMAP)相比,本专利披露试剂可以使鲁米诺化学发光反应的发光强度保持超过1个小时，而4-氨基吡啶类增强剂则随着时间推移信号显著降低。由此可见，本发明的试剂可以有效提高鲁米诺化学发光反应发光强度的稳定性。

实施例2：Western Blot检测；

本发明的试剂盒应用于HRP标记的免疫检测分析。

试剂A：四水合过硼酸钠盐 8mM

柠檬酸缓冲液ph 5.0 10mM

试剂B鲁米诺钠盐 2mM

3-(吩噻嗪-10-基)丙1-磺酸钠 5mM

腺嘌呤 8mM

N-环己基-2-氨基乙磺酸ph9.1 100mM

具体实验过程如下：

1.用RIPA裂解液提取小鼠肌肉组织样本的总蛋白；

2.用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白浓度测定；

3.SDS-PAGE电泳，电泳时将蛋白进行梯度稀释，使得每个孔中自左至右总蛋白量分别为0.75ug 0.375ug 0.188ug 0.094ug 0.047ug 0.023ug；

4.转膜：用0.22um孔径PVDF膜；

5.封闭：用5％的脱脂牛奶(TBST配)，脱色摇床上封闭1小时；

6.一抗孵育：兔源多克隆CA3抗体用TBST按照1；20000稀释，室温脱色摇床孵育2小时；

7.用TBST在室温下脱色摇床上洗5次，每次5分钟；

8.二抗孵育：HRP标记山羊抗兔IgG二抗TBST按照1：100000稀释，室温脱色摇床孵育1.5小时；

9.用TBST在室温下脱色摇床上洗5次，每次5分钟；

10.化学发光：本发明示例2的化学发光底物试剂盒同进口品牌一(clarity max

结果如图2，相同的曝光时间的情况下，本发明化学发光底物试剂盒同进口品牌飞克级别发光底物相比较，信号强度及灵敏度相当，甚至略优。

11.本发明化学发光底物用于Western Blot检测，其信号持续时间与进口品牌对比。加入化学发光底物后，分别在0h 1h 2h 3h 4h这几个时间点曝光。曝光时间为120s。结果如图3所示：本发明化学发光底物试剂盒同进口品牌信号持续时间相当，甚至略优。

有益效果：

1、本发明通过添加嘌呤或者嘌呤衍生物作为共增强剂，不仅能提高化学发光强度，还能维持信号稳定性；

2、本发明采用化学发光底物试剂A和试剂B的配方，可以检测出飞克级别蛋白，灵敏度高。

3、本发明的化学发光试剂盒，化学信号持续时间长，既适用于荧光CCD相机的荧光扫描，也可感光X光胶片，化学信号稳定实验重复性好。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。