一种实心和空心病毒颗粒的表征量化方法

摘要

本发明公开了一种实心和空心病毒颗粒的表征量化方法，对病毒进行冷冻水合态的成像；对病毒样品冷冻水合态投影图像的预处理，实现了冷冻水合态成像病毒的自动挑选和空实心表征；对病毒颗粒进行分类；对病毒空实心比例进行统计，并对统计结果二次校正与可信度强化分析，为高实心比基因药物是否准许进行下一步生产提供质量控制标准；对分析结果进行可视化展示；基于冷冻水合态成像对近生理状态下的病毒空实心进行表征，并实现了病毒颗粒智能分选、定量分析的框架系统，不用任何人为标注，避免人为注释的重复劳动和误差，实现准确的、高通量、可视化的病毒样品空实心定量分析，为基因药物的质量控制和活性评估与提供了可靠的全新指标。

说明书

技术领域

本发明涉及实心和空心病毒颗粒分类技术领域，特别涉及一种实心和空心病毒颗粒的表征量化方法。

背景技术

病毒样颗粒(Virus-LikeParticles，VLP)和复制缺陷的病毒如腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)，不能增殖，在制药工业领域被广泛作为基因传递载体。尤其是AAV宿主细胞范围广，体内表达时间长，具有快速的响应时间和高效的表达效率，不会导致人类疾病，是最有前景的病毒基因治疗载体。基因载体的遗传物质含量与治疗效率密切相关，需要对基因药物的空实心比例予以准确的评估，从而为进入下一步生产流程提供可靠的质量控制标准。此外，建立可视化的、高通量的病毒颗粒空实心量化方法，对生产工艺的开发、优化和提速至关重要。特别地，对病毒近生理状态下的检测，可以为生产工艺的优化提供直观参考。

已经有文献报道了几类可以量化空心和实心病毒的分析方法，都是基于通过核酸定量和衣壳定量来区分空心病毒和实心病毒，不过这些方法得到的都是群体分析的统计平均结果。1)ELISA/q-PCR法可以粗略估计病毒实心比。酶联免疫吸附分析(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)用于测定总的AAV衣壳含量，定量聚合酶链反应(quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR)用于测量AAV基因组含量。然而两种检测方法的测量精度变化均会对病毒实心比产生很大的不确定性，并且ELISA分析衣壳蛋白量并不适用于所有AAV血清型。2)紫外(ultraviolet，UV)光密度测量被用来定量AAV的实心比。该方法利用260nm和280nm处的紫外线吸收率测定来分析病毒实心比，然而该方法依赖于衣壳消光系数(extinction coefficient)的精确测定以及相当均匀的衣壳组成，并且UV吸收测定容易受到其他在该UV范围具有吸收能力的蛋白质和DNA污染物的干扰，因此该方法误差较大，并未广泛应用。3)分析型超速离心(AnalyticalUltracentifugation，AUC)被广泛用于表征AAV。它可以分析AAV实心比和其他AAV亚群的定量信息，然而AUC的低通量限制了其在工艺开发中的应用。

负染电镜成像技术(negativestainelectronmicroscopy)可以通过染色后在高放大倍率下观察，从而实现对空心和实心病毒进行直接观测并计数，被认为是分析病毒颗粒成分的好方法。负染制样之后，重金属离子与蛋白中密度较小的原子相比具有更大的散射电子的能力，并且重金属包埋使蛋白能够耐受更高的电子剂量从而提供高衬度的图像。在病毒负染制样过程中，重金属染料(比如磷钨酸染液)覆盖病毒颗粒，勾勒出病毒颗粒表面结构，可提供较高分辨率的结构信息，可以用于病毒颗粒的成像，实现空心和实心病毒的区分。但是在制样过程中，重金属可能会渗透到病毒内部的空腔中，这有助于观察病毒颗粒内部遗传物质含量，但是金属染料的渗入会破坏病毒粒子的结构，对病毒空实心的检测产生了难以预料的假阳性和假阴性结果。此外，染料的厚度难以控制，会对观测结果造成无法预测的影响。

发明内容

发明的目的在于提供一种实心和空心病毒颗粒的表征量化方法，解决了背景技术中的问题。

本发明是这样实现的，一种实心和空心病毒颗粒的表征量化方法，包括以下步骤：

步骤1)，对病毒进行冷冻水合态的成像，例如冷冻电镜cryo-EM，实现单个基因药物载体病毒的近生理状态成像。具体来说，包括如下步骤：

1.1)提供病毒样颗粒或病毒颗粒的样本，保证样品结构在溶液中的稳定，没有解聚或者聚集。

1.2)制备样品以使样品保持天然的未染色水合状态，具体过程如下：a)选择合适的载网型号；b)对载网进行亲水化处理，使载网表面容易吸附蛋白质溶液；c)使用半自动化快速投入式冷冻制样机，将吸附有蛋白质溶液的载网在乙烷溶液中快速冷冻，在载网孔或支持膜上形成厚度约几十到几百纳米的玻璃态薄冰，病毒颗粒则被分散包埋在冰层中形成冷冻样品；d)将载网转移至载网盒中并储存在液氮中。

1.3)在冷冻电镜成像设备中观察冷冻水合态样品中每个病毒颗粒的形态，在对样品成像过程中，确保电镜按照制造商的说明进行调试和校准，并且相机的背底是均匀的。找到合适的区域，选取要拍摄照片的载网孔，重复图像采集的步骤，直到获取所需数量的图像为止，以合适的格式(例如16位tiff格式)保存。

步骤2)，对病毒样品冷冻水合态投影图像的预处理：先通过低通滤波与归一化处理，再实现病毒颗粒挑选与对齐，最后进行降维表示和中心区域信号强化，实现了冷冻水合态成像病毒的自动挑选和空实心表征。病毒颗粒含量的测量值即为图像的灰度值，衡量病毒粒子内部明亮或暗淡的差异，对应于病毒颗粒空腔内核酸的充满程度，在冷冻水合态成像中，由于空颗粒的内部密度较低，空颗粒显示为内部密度很小的圆盘。实心颗粒内部包含遗传物质，显示为深色均质圆盘。为了有效表征空实心病毒的内部密度差异，本发明采取如下步骤：

2.1)对图像进行帧与帧之间的漂移校正，并将多帧合并，采用低通滤波的方式(例如均值滤波、中值滤波、频域低通滤波)提升图像信噪比。对图像进行归一化处理(例如每张图像除以所有像素均值)，实现图像电子剂量曝光矫正。

2.2)将病毒颗粒挑选出来，本发明采取基于Laplacian-of-Gaussianfilter的自动挑颗粒算法(例如Relion自动挑颗粒方法)。也可以采取模版搜索的方法、基于神经网络的目标检测的颗粒挑选方法(例如Gautomatch，SPHIRE-crYOLO，cryoSPARC等挑颗粒方法)。利用Cross-Correlation互相关函数，将病毒图像中心对齐。

2.3)对病毒图像进行降维表示与中心强化。以病毒中心建立球坐标系，则半径为r，极角为θ处的强度记为f(r,θ)。沿着极径方向进行圆环积分，得到距离中心不同半径处的信号强度：

采取以上降维方法，N*N维的病毒图像变成为N维，

例如，幂函数

步骤3)，对病毒颗粒进行分类。对F(r)进行离散化处理，得到病毒图像的N维表示后，对病毒内部成分的分析，提取空实心的差异，给予颗粒含量一个度量，包括主成分分析、中心区域强度、内部总强度(或者加权内部总强度)或内部亮暗面积的比重，刻画病毒颗粒空实心差异。本发明采取了两种独立的方法表征空、实心病毒：主成分分析和中心区域强度。

优选地，所述主成分分析，M个N维样本集X＝(x

优选地，所述中心区域强度分析，用中心区域的强度

步骤4)，对病毒空实心比例进行统计，并对统计结果二次校正与可信度强化分析。为了减少高实心比例样品的分析偏差，避免因为数据比例不对等产生的拟合误差，当待测病毒样品实心比超过2/3时，采取纯空心病毒和待测病毒样品图像等比例混合的策略，对高实心比的结论进行可信度强化。

步骤5)，对分类结果进行可视化展示。以各成分混合高斯分布的概率密度函数的交点坐标作为阈值，对样本进行分类并对每个病毒进行空实心注释。实际操作中，可以通过改变阈值调整分类结果的置信度。

本发明的有益效果：

1、本发明提出一种基于冷冻水合态成像进行空实心病毒表征量化的方法，并实现了对病毒进行智能分选和定量分析的框架系统，为基因药物的质量控制和活性评估提供了全新的指标。

2、制样过程中的快速冷冻保持了病毒天然状态下的结构，冷冻水合状态下的电镜成像可以看到颗粒的内部成分。对内部成分的分析，我们给予颗粒含量一个度量，例如主成分分析、中心区域强度、内部总强度(或者加权内部总强度)或内部亮暗面积的比重，非常有效地刻画出病毒颗粒的空实心差异。

3、与核酸定量和衣壳定量的群体测量方法相比，本发明对每个病毒进行表征检测，不会有群体分析误差大、易受干扰的缺点。并且本发明的软件分析框架与水合状态的病毒成像无缝衔接，实现了高通量的检测和快速的智能分析，可以广泛用于生产工艺的开发和优化。

4、本发明开发出的病毒空实心特征提取和定量分析的软件框架，无需人为标注，实现了准确直观的病毒样品空实心量化，和负染电镜成像技术相比，冷冻水合态成像因为未使用任何染料，不会受到染色不均匀的影响，更加可靠的结果的优势超过了技术麻烦的弊端。

附图说明

图1为基于冷冻水合态成像的病毒空实心表征量化流程图；

图2为本发明的数据收集示意图；

图3为本发明数据处理--信号增强示意图；

图4为本发明数据处理--统计分析示意图；

图5为本发明数据处理--可视化示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例一：

如图1所示，本发明的基于冷冻水合态成像的病毒空实心表征量化流程图。对病毒进行冷冻水合态的成像，例如冷冻电镜cryo-EM，实现单个基因药物载体病毒的近生理状态成像。得到病毒样品冷冻水合态投影图像之后，用本发明开发的智能分选和定量分析的软件框架进行分析。具体来说，a)对病毒样品冷冻水合态投影图像的预处理，涉及低通滤波实现信噪比提升，病毒颗粒挑选与对齐，对病毒颗粒图像进行降维表示和中心区域信号强化；b)对病毒颗粒进行分类，涉及病毒空实心特征提取，做统计直方图和混合高斯拟合，确定分类阈值；c)对病毒空实心比例进行统计分析，并对统计结果二次校正与可信度强化分析；d)对分析结果进行可视化展示，包括单个病毒空实心的注释和分类结果的平均。图2-5对病毒冷冻水合态成像实现病毒空实心表征，与配套的智能分选和定量分析的框架系统的详细描述。

如图2所示，本发明的数据收集示意图，用冷冻电镜技术对病毒进行冷冻水合态的成像，实现单个基因药物载体病毒的近生理状态的检测。具体来说，

1)提供病毒样颗粒或病毒颗粒的样本。保证样品结构在溶液中的稳定，没有解聚或者聚集。

2)制备样品以使样品保持天然的未染色水合状态。用合适的载网(grid)，例如400目铜网进行辉光放电，做亲水化处理，使载网表面容易吸附蛋白质溶液。制备冷冻电镜样品，可以使用Vitrobot半自动制样机或其他快速冷冻制样方法。具体地，将吸附有蛋白质溶液的载网快速投入经液氮冷却的液态乙烷中，在载网孔或支持膜上形成厚度约几十到几百纳米的玻璃态薄冰，病毒颗粒则被分散包埋在冰层中形成冷冻样品，将载网转移至载网盒中并储存在液氮中。

3)在冷冻电镜成像设备中观察样品中每个病毒颗粒的形态。将低温载网箱从其存储位置转移到用液氮预冷的低温工作站中，在该低温工作站中插入了低温支架预备泵。载网被转移到冷冻支架上的插槽中。将冷冻保持器插入冷冻电镜中，并将液氮容器加满。在对样品成像过程中，确保电镜按照制造商的说明进行调试和校准，并且相机的背底是均匀的。找到合适的区域，设置离焦值(defocus value)，选取要拍摄照片的载网孔，重复图像采集的步骤，直到获取所需数量的图像为止。

4)收集二维的电镜图像，以合适的格式(例如16位tiff格式)保存。通过软件例如MotionCorr2、Relion等对图像进行帧与帧之间的漂移校正，并将多帧合并，采用低通滤波的方式提升图像信噪比，进一步地对图像归一化处理实现电子剂量曝光矫正。病毒颗粒中遗传物质的含量与病毒颗粒图像的灰度值相对应，通过测量病毒颗粒内部与外壳之间的灰度差异即可判断病毒内部遗传物质的填充程度。在病毒颗粒的cryo-EM成像中，由于空颗粒的内部密度较低，空颗粒显示为内部密度很小的圆盘。实心颗粒内部包含遗传物质，显示为深色均质圆盘。

如图3所示，数据处理过程中，可以采用Relion、Gautomatch、cryoSPARC、SPHIRE-crYOLO等软件将病毒颗粒挑选出来，如图3a所示；并利用Cross-Correlation互相关函数，将病毒图像中心对齐，如图3b所示；以病毒中心建立球坐标系，则半径为r，极角为θ处的强度记为f(r,θ)。沿着极径方向进行圆环积分，如图3c所示；得到距离中心不同半径处的信号强度：

采取以上降维方法，N*N维的病毒图像变成为N维，

例如，幂函数

如图4所示，对F(r)进行离散化处理，得到病毒图像的N维表示后，提取空实心的差异；我们采取了两种独立的方法表征空、实心病毒：主成分分析和中心区域强度。

1)主成分分析。M个N维样本集X＝(x

2)中心区域强度分析。用中心区域的强度

如图5所示，对分类结果进行可视化展示。以各成分混合高斯分布的概率密度函数的交点坐标作为阈值对样本进行分类。实际操作中，可以通过改变阈值调整分类结果的置信度。图5a、5d为分类之后典型的空心和实心病毒图像。图5b、5e为空心、实心病毒图像平均之后的结果。图5f为典型的分类之后个体病毒颗粒空实心注释结果，其中白圈为空心病毒，黑圈为实心病毒。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。