一种特异蛋白修饰的矿物生物膜促进生物电合成的方法

摘要

本发明公开了一种特异蛋白修饰的矿物生物膜促进生物电合成的方法；本发明利用特异蛋白修饰的磁性矿物与电活性微生物快速结合，并用磁铁将其吸至阴极生成矿物生物膜，从而促进生物电合成；其原料易得，操作简单，生物电合成条件易于控制，具有较高的经济、环境和社会效益，具有大规模工业化应用的技术潜力。

说明书

技术领域

本发明属于可再生能源技术领域，具体涉及一种特异蛋白修饰的矿物生物膜促进生物电合成的方法。

背景技术

生物电化学系统(BES)广泛应用于能源和环境领域，其主要由阳极和阴极组成，阳极表面能够生长和富集产电微生物进行氧化有机物产生电子，而产生的电子通过外部电路到达阴极，阴极表面的电活性微生物能够接收电子进行特定的还原反应从而产生还原产物，利用生物阴极的还原特性进行生物合成即是生物电合成系统。

生物电合成系统的最重要部分就是生物阴极，因为生物阴极的电活性微生物膜(即阴极生物膜)是生物电合成的主要功能部分。但微生物表面的负电荷与阴极的大量电子同性相斥从而造成电活性微生物无法很好地自然富集于阴极电极上，从而极大影响了生物阴极的成膜。为了克服阴极成膜的难题，许多研究人员对此进行了大量的研究，也获得了一些改善阴极成膜的方法，例如阴阳极互换、阴极表面修饰、更换阴极材料等。但是这些方法还存在成膜不稳定、周期长、效率低、操作难度大等缺点，为此急需寻找一种稳定和高效的阴极成膜方法来提高生物电合成性能。

有研究表明磁性矿物具有良好的生物相容性和导电性能，且具有极强的磁性。而特异性蛋白修饰的磁性矿物既具有磁性，又具有特异蛋白独有的特性，例如链霉亲和素与生物素之间具有极强的亲和力，一分子的链霉亲和素可以特异性地与四分子的生物素结合，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10

本发明利用特异蛋白的强生物亲和力与磁性矿物的强磁性来修饰电活性微生物，使其能够与磁性矿物进行强力的连接，从而磁化。磁化的电活性微生物能够在磁场的作用下发生定向移动，于阴极表面富集形成厚的、稳定的阴极生物膜，从而有效地解决了阴极生物膜成膜的难题，为未来大规模的生物电合成工业化提供了技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异蛋白修饰的矿物生物膜促进生物电合成的方法。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种特异蛋白修饰的矿物生物膜促进生物电合成的方法，包括如下步骤：

1)将电活性微生物离心转移到已加好无机碳培养基的三电极电池中，曝气达到完全无氧状态；

2)将特异性蛋白与磁性矿物混合后，在4℃振荡24小时获得特异蛋白修饰的矿物；

3)将预设量的特异蛋白修饰的矿物加入到步骤1)的电池中，令特异蛋白修饰的磁性矿物与电活性微生物牢固结合获得两者的杂化体；

4)将步骤2)中获得的杂化体用磁铁吸至电极阴极表面，外加电压进行生物电合成。

进一步的，步骤1)中，电活性微生物是产乙酸菌热醋穆尔氏菌、固氮菌施氏假单胞菌、产甲烷菌巴氏甲烷八叠球菌中的任意一种。

进一步的，步骤2)中，所用的特异蛋白选用链霉亲和素或亲和素。

进一步的，步骤2)中，所用的磁性矿物选用四氧化三铁或三氧化二铁。

进一步的，步骤3)中，所投加的特异蛋白修饰的矿物量为10～100mg/L。

优选的，步骤4)中，所用的电压在-0.6～-1.1V之间。

与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种无污染、可持续生产高价值化合物的生物电合成新方法。本发明利用特异蛋白修饰的磁性矿物与电活性微生物快速结合，并用磁铁将其吸至阴极生成矿物生物膜，从而促进生物电合成。其原料易得，操作简单，生物电合成条件易于控制，具有较高的经济、环境和社会效益，具有大规模工业化应用的技术潜力。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种特异蛋白修饰的矿物生物膜促进生物电合成的方法，包括如下步骤：

1)将电活性微生物离心转移到已加好无机碳培养基的三电极电池中，用CO

2)将特异性蛋白与磁性矿物混合后，在4℃振荡24小时获得特异蛋白修饰的矿物；

3)将预设量的特异蛋白修饰的矿物加入到步骤1)的电池中，放置12-48小时(优选为12小时)，使特异蛋白修饰的磁性矿物与电活性微生物牢固结合获得两者的杂化体；

4)将步骤3)中获得的杂化体用磁铁吸至电极阴极表面，外加电压进行生物电合成。

本发明特异蛋白修饰的矿物的作用为：1)利用特异蛋白(链霉亲和素、亲和素)能够与一些物质(生物素)特异性亲和性极强，可以与微生物中的生物素强力连接；2)这些特异性蛋白的稳定性强，可长期稳定保持活性；3)磁性矿物(三氧化二铁、四氧化三铁)具有很强的磁性，可在磁铁的作用下进行定向移动和聚集。

本发明生物膜的作用为：1)生物膜是由电活性微生物富集在电极表面的一层微生物，主要利用其进行特定的生物合成能力；2)在阴极表面形成的生物膜具有直接接收电极电子的能力，可以利用这些电子进行微生物胞内代谢，合成并释放有价值的化合物。

进一步的，步骤1)中，电活性微生物是产乙酸菌热醋穆尔氏菌、固氮菌施氏假单胞菌、产甲烷菌巴氏甲烷八叠球菌中任意一种。

进一步的，步骤2)中，所用的特异蛋白有链霉亲和素或亲和素。

进一步的，步骤2)中，所用的磁性矿物有四氧化三铁或三氧化二铁。

进一步的，步骤3)中，所投加的特异蛋白修饰的矿物量为10～100mg/L培养基。

进一步的，步骤4)中，所用的电压在-0.6～-1.1V之间。

下面通过具体实例对本发明进一步阐述。

以下各实施例、对比例中所用的原料来源情况如下：

亲和素、链霉亲和素、四氧化三铁、三氧化二铁均购买自Sigma公司；

产乙酸菌热醋穆尔氏菌、固氮菌施氏假单胞菌、产甲烷菌巴氏甲烷八叠球菌购买自德国DSMZ。

实施例1

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例2

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例3

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例4

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例5

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例6

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例7

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

20/80的混合气曝气5min达到完全无氧状态。将20mg/L的链霉亲和素修饰的四氧化三铁加入到电池中，放置12h使链霉亲和素修饰的四氧化三铁与产甲烷菌牢固结合获得两者的杂化体，将获得的杂化体用磁铁吸至电极阴极表面，外加-0.8V电压进行生物电产甲烷。

实施例8

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例9

将产乙酸菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实施例10

将固氮菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

对比例1、未修饰链霉亲和素的磁铁矿与产甲烷菌结合处理组

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

对比例2、单独链霉亲和素与产甲烷菌结合处理组

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

对比例3、单独产甲烷菌加电处理组

将产甲烷菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

对比例4、单独产乙酸菌加电处理

将产乙酸菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

对比例5、单独固氮菌加电处理

将固氮菌离心转移到已加好无机碳培养基的电池中，用CO

实验例1、生物电产甲烷

对实施例1～5及对比例1～3的生物电产甲烷过程进行监测，检测指标主要是电产甲烷量，电产甲烷量采用气相色谱仪进行测定，所采用的产气量用μmol表示。

表1产甲烷实验

生物电产甲烷结果如表1所示，比较实施例1～8与对比例1～3可知，有修饰特异性蛋白(链霉亲和素或亲和素)的磁铁矿能够更好与产甲烷菌结合，促进其电产甲烷性能，单纯的特异蛋白、磁铁矿与产甲烷菌结合的杂化体的生物电产甲烷量显著低于有修饰特异蛋白的磁铁矿的杂化体。进一步分析，从实施例1～3可知，添加不同量的特异蛋白修饰的磁铁矿与产甲烷菌结合能够获得不同电产甲烷性能，随着特异蛋白修饰的磁铁矿投加量从10mg/L增加到100mg/L，其产甲烷量是显著提高(p<0.05)。

进一步分析，从实施例2和4可知，不同的特异蛋白结合的矿物都具有良好的生物相容性。链霉亲和素、亲和素结合的磁铁矿与产甲烷菌形成的杂化体都具有极好的产甲烷性能，相比于对比例1，其产甲烷量分别提高了5.70倍和4.90倍。

进一步分析，从实施例2和5可知，不同的矿物所形成的矿物生物膜都具有良好的生物电合成性能。特异蛋白修饰的三氧化二铁和四氧化三铁与产甲烷菌形成的杂化体的产甲烷量显著提高，相比于对比例1，其产甲烷量分别提高了5.70倍和5.29倍。

进一步分析，从实施例2、6、7和8可知，不同的电压条件对特异蛋白修饰的矿物生物膜具有不同的生物电合成性能。随着外加电压的增加，其生物电合成性能显著提高，外加-1.1V的电产甲烷量是-0.6V的电产甲烷量的5.77倍。

实验例2、生物电产乙酸

对实施例6及对比例4的生物电产乙酸过程进行监测，检测指标主要是电产乙酸量，电产乙酸量采用高效液相色谱进行测定，所采用的乙酸产量单位为mmol/L。

表2产乙酸实验

生物电产乙酸结果如表2所示，比较实施例9与对比例4(单独产乙酸菌加电处理)可知，特异蛋白(链霉亲和素)修饰的矿物生物膜具有更强的生物电产乙酸能力，其电产乙酸量是单独产乙酸菌形成的生物膜的20倍。

实验例3、生物电固氮

对实施例7的生物电固氮过程进行监测，检测指标主要是氮气转化为铵根离子的浓度，电固氮量采用高效液相色谱进行测定，所采用的固氮量单位为mg/L表示。

表3固氮实验

生物电固氮产氨结果如表3所示，对比实施例10与对比例5(单独固氮菌加电处理)可知，特异蛋白(链霉亲和素)修饰的矿物生物膜具有更强的生物电固氮能力，其电固氮量是单独固氮菌形成的生物膜的18倍。

进一步分析，从生物电产甲烷、生物电产乙酸和生物电固氮分析可知，特异蛋白修饰的矿物生物膜具有更强的生物电合成能力，这主要体现在其可以更好地将矿物(磁铁矿)结合到微生物表面，使其具有磁性，可被磁铁吸到阴极表面，进行生物电合成。另外，磁铁矿等矿物具有优良的导电性能，能够有效提高电极表面生物膜内部的导电性，利于微生物利用电极电子。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。