一种靶向抑制SOS1基因表达的siRNA及其应用

摘要

本发明公开一种靶向抑制SOS1基因表达的siRNA及其应用。所述siRNA的序列为：正义链：5′‑GCAGAATCTTCACCATCTA‑3′；反义链：5′‑TAGATGGTGAAGATTCTGC‑3′。本发明通过检测SOS1的mRNA水平及蛋白水平的表达量变化，筛选出SOS1有效siRNA序列，SOS1‑siRNA#3，可以有效抑制CML细胞的增殖能力、克隆形成能力，并且在动物体内有效抑制移植瘤的生长，同时增加了CML细胞对imatinib的药物敏感性。因此，SOS1是慢性粒细胞白血病治疗的一个潜在的新靶点，而SOS1‑siRNA具有潜在的克服imatinib耐药性的价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别涉及一种靶向抑制SOS1基因表达的siRNA及其应用。

背景技术

慢性粒细胞白血病(CML)是一种存在特征性的遗传异常，ph染色体是其特征性细胞遗传学标志，即t(9；22)(q34；ql1)，存在特异性BCR-ABL融合基因。导致造血干细胞恶性克隆性增生的疾病。伊马替尼作为第一代靶向作用于BCR-ABL融合基因编码的P210蛋白的酪氨酸激酶抑制剂，使得慢性粒细胞的治疗方法发生了革命性的变化。然而，只有少数接受伊马替尼治疗的患者得到了完全的缓解，其余20％的病人由于药物不耐受而停止用药，还有20％的病人则产生了耐药性而限制了使用。尽管，近年来新上市的TKIs，如尼罗替尼、达沙替尼、伯舒替尼和帕纳替尼，则为CML患者提供了多种选择，且这些新的药物显示出更强的疗效，但是仍然未能解决患者出现耐药性问题。因此，克服耐药性将是治疗慢性粒细胞白血病的首要问题，识别出CML耐药机制中关键的成分将会探索出更多新的克服耐药的手段。

SOS1(son of sevenless homolog 1)蛋白是一种在细胞中广泛表达的调控蛋白，作为Ras、Rac蛋白的一类鸟嘌呤核苷酸交换因子，在细胞内Ras、Rac信号转导通路中起着重要的调控作用。在慢性粒细胞白血病的发生发展过程中，BCR-ABL通过磷酸化活化GRB2、募集SOS1，从而持续性激活Ras/MAPK信号通路，导致造血干细胞的恶性增殖。因此，SOS1蛋白是慢性粒细胞白血病治疗可能的潜在的新靶点。

RNA干扰(RNAi)技术是利用双链RNA，高效、特异性降解细胞内同源信使RNA，从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。与反义寡聚核苷酸技术相比，RNAi技术具有更高的特异性，是更有效的方法。目前，RNAi技术是肿瘤基因治疗领域的一个热点技术，研究表明，siRNA沉默肿瘤耐药相关基因的表达，可逆转肿瘤MDR(多药耐药性)，同时结合抗肿瘤药物，能有效的对多药耐药肿瘤进行治疗。因此，siRNA是一种很有前途的癌症治疗策略。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种靶向抑制SOS1基因表达的siRNA。

本发明的另一目的在于提供上述靶向抑制SOS1基因表达的siRNA的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种靶向抑制SOS1基因表达的siRNA，记为SOS1-siRNA#3，其序列为：

正义链：5′-GCAGAATCTTCACCATCTA-3′(SEQ ID NO：1)；

反义链：5′-TAGATGGTGAAGATTCTGC-3′(SEQ ID NO：2)。

上述靶向抑制SOS1基因表达的siRNA的应用：靶向抑制SOS1基因表达的siRNA可用于研究SOS1基因的功能，特别是用于进行SOS1基因与白血病细胞的增殖能力和克隆形成能力的相关性研究，还可用于提高慢性粒细胞白血病细胞对imatinib的药物敏感性；靶向抑制SOS1基因表达的siRNA可用于制备抗慢性粒细胞白血病药物。

所述的慢性粒细胞白血病尤其是慢性粒细胞白血病细胞K562，KCL-22，BV173和KU812。

所述的抗慢性粒细胞白血病药物的剂型为气雾剂、片剂、胶囊剂、滴丸、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质剂、透皮剂、口含剂、栓剂或冻干粉针剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明通过检测SOS1的mRNA水平及蛋白水平的表达量变化，筛选出SOS1有效siRNA序列，SOS1-siRNA#3，可以有效抑制CML细胞的增殖能力、克隆形成能力，并且在动物体内有效抑制移植瘤的生长，同时增加了CML细胞对imatinib的药物敏感性。因此，SOS1是慢性粒细胞白血病治疗的一个潜在的新靶点，而SOS1-siRNA具有潜在的克服imatinib耐药性的价值。

附图说明

图1是SOS1有效siRNA序列筛选；其中，A：转染了SOS1-siRNA/NC之后，K562/KCL-22/BV173细胞中SOS1-mRNA相对表达水平(***P<0.001)；B：转染SOS1-siRNA/NC之后，K562/KCL-22/BV173细胞中SOS1蛋白相对表达水平。

图2是96孔板转染不同浓度的SOS1-siRNA#3/NC到K562/KCL-22细胞后，细胞的相对活力变化(*/**P<0.05,***P<0.001)。

图3是靶向抑制SOS1对K562和KCL-22细胞克隆形成能力的影响(**P<0.05，K562-SOS1-siRNA#3组与K562-NC组相比，KCL-22-SOS1-siRNA#3组与KCL22-NC组相比；***P<0.001，K562-SOS1-siRNA#3组与K562-BK组相比，KCL-22-SOS1-siRNA#3组与KCL-22-BK组相比)。

图4是靶向抑制SOS1对K562细胞在小鼠皮下实体肿瘤形成能力的影响(*P<0.05，K562-SOS1-siRNA#3组肿瘤体积与K562-NC组相比，K562-SOS1-siRNA#3组肿瘤重量与K562-NC组相比)。

图5是靶向抑制SOS1的CML细胞在不同imatinib浓度下的细胞活力变化(*/**P<0.05，***P<0.001，K562-SOS1-siRNA#3vs K562-NC，KCL-22-SOS1-siRNA#3vs KCL-22-SOS1-NC，KU812-SOS1-siRNA#3vs KU812-NC)。

图6是靶向抑制SOS1的CML细胞在不同imatinib浓度下克隆细胞团数的变化以及组间统计学差异(左边是克隆细胞团图片，右边是统计图及差异分析结果；*/**P<0.05，***P<0.001)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一、材料与方法

1.材料

1.1细胞及动物

K562，KCL-22(人慢性粒细胞白血病系)，购于中国科学院上海细胞库，BV173(人外周血B细胞白血病系)，受赠与美国血液病研究所，也可从商业途径得到。KU812(人慢性粒细胞白血病系)，受赠与暨南大学潘景轩课题组，也可从商业途径得到。4-6周龄的Balb/cnude小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2试剂

1640培养基，opti-MEM培养基，anti-SOS1(鼠源SOS1单克隆抗体)(santa)，anti-β-actin(兔源β-actin单克隆抗体)(CST)，siRNA冻干粉(锐博生物)，CCK-8(biomake)，imatinib(STI571)(selleck)，lipo2000(thermo)，qPCR试剂(biomake)。

1.3随机序列的RNA双链和SOS1-siRNA序列

1.3.1随机序列的RNA双链

随机序列的RNA双链(NC)，由广州锐博生物科技有限公司设计并合成。

正义链(sense)：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；

反义链(antisense)：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；

1.3.2 SOS1-siRNA序列

根据GenBank基因库中SOS1已知序列(Organism：Homo sapiens(Human))，涉及靶向的SOS1的siRNA序列，SOS1-siRNA序列由广州锐博生物科技有限公司设计并合成。

2.方法

2.1细胞培养

将K562/KCL-22/BV173/KU812分别接种于含体积分数为10％的胎牛血清(FBS)，1％双抗(青霉素/链霉素)的RPMI-1640培养基中，置于37℃、体积分数为5％的CO

2.2qPCR检测转染SOS1-siRNA/NC后细胞中SOS1-mRNA相对表达量

无血清、无抗生素的1640培养基分别稀释调整K562/KCL-22/BV173细胞至合适浓度，以25*10

2.3 Western blot检测转染SOS1-siRNA/NC后细胞中SOS1蛋白水平

无血清、无抗生素1640培养基分别稀释调整K562/KCL-22/BV173细胞至合适浓度，以25*10

2.4 CCK-8检测SOS1-siRNA#3/NC转染后CML细胞的活力

无血清、无抗生素的1640培养基分别调整K562/KCL-22细胞至合适浓度，以5000cell/50μL/孔种于96孔板，每组设置五个复孔，使用opti-MEM培养基稀释SOS1-siRNA#3/NC母液(20μM)至每组设置目标浓度(依次为50nM、75nM、100nM、125nM、150nM)，并与Lipo2000混合孵育20min，以每孔50μL滴加到细胞悬液中，置于37℃，5％CO

细胞活力计算：相对细胞活性(％)＝[A(SOS1-siRNA#3/NC)-A(Blank)]/[A(Blank)]×100％。

2.5 Soft agar检测转染SOS1-siRNA#3/NC后CML细胞的克隆形成能力

无血清、无抗生素的1640培养基分别调整K562/KCL-22细胞至合适浓度，以8000cell/50μL/孔种于96孔板，每组设置三个复孔，使用opti-MEM培养基稀释SOS1-siRNA#3/NC母液(20μM)至100nM，并与Lipo2000混合孵育20min，以每孔50μL滴加到细胞悬液中，置于37℃，5％CO

2.6裸鼠荷瘤实验检测体内SOS1-siRNA#3抑制效应

无血清、无抗生素的1640培养基稀释调整K562细胞至合适浓度，以25*10

2.7 CCK-8检测转染SOS1-siRNA#3/NC后CML细胞对imatinib药物敏感性

无血清、无抗生素的1640培养基分别调整K562/KCL-22/KU812细胞至合适浓度，以5000cell/50μL/孔种于96孔板，每组设置四个复孔，使用opti-MEM培养基稀释SOS1-siRNA#3/NC母液(20μM)至100nM，并与Lipo2000混合孵育20min，以每孔50μL滴加到细胞悬液中，置于37℃，5％CO

2.8 Soft agar检测转染SOS1-siRNA#3/NC后CML细胞对imatinib药物敏感性

无血清、无抗生素的1640培养基分别调整K562/KCL-22细胞至合适浓度，以8000cell/50μL/孔种于96孔板，每组设置三个复孔，使用opti-MEM培养基稀释SOS1-siRNA#3/NC母液(20μM)至100nM，并与Lipo2000混合孵育20min，以每孔50μL滴加到细胞悬液中，置于37℃，5％CO

二、结果与讨论

1.结果

1.1随机序列SOS1-siRNA#3靶向抑制SOS1表达效果最为明显

如图1所示，在mRNA水平，SOS1三条随机siRNA序列在三株细胞中，序列SOS1-siRNA#3抑制SOS1-mRNA效果最为明显，序列SOS1-siRNA#1在BV173细胞中无抑制效果，序列SOS1-siRNA#2在三株细胞中都有明显抑制效果但没有序列SOS1-siRNA#3明显(图1A)。在蛋白水平，三条序列都有明显的抑制作用(图1B)。综合mRNA和蛋白水平变化可以得出，SOS1-siRNA#3的抑制作用最为明显，并且抑制效果稳定。

1.2 SOS1-siRNA#3有效抑制了CML细胞增殖

96孔板种植相同的细胞数，转染72h后，每孔加入20μL CCK-8溶液，37℃孵育2h，置于振荡器上振荡10min，450nm处检测吸光值，结果显示SOS1-siRNA#3组细胞活力明显低于随机对照序列NC组(图2)。并且细胞活力的抑制程度与siRNA浓度没有明显的正相关关系。细胞增殖抑制效果在K562与KCL-22两株细胞中具有一致性。

1.3 SOS1-siRNA#3在体外和体内都有效抑制了CML细胞克隆形成能力

细胞水平上，将转染SOS1-siRNA#3/NC的K562/KCL-22细胞，以相同的细胞数种植于软琼脂(Soft agar)培养基，置于细胞培养箱，培养两周后，染色，统计克隆数，NC组和SOS1-siRNA#3组少于空白对照组，同时SOS1-siRNA#3组明显少于NC随机对照组(图3)，表明SOS1-siRNA#3明显抑制了K562/KCL-22细胞的克隆形成能力。在动物实验水平，从移植瘤体积和最终瘤重都可以看出，K562-SOS1-siRNA#3组移植瘤生长明显比K562-NC组慢(图4)。以上结果显示，SOS1-siRNA#3抑制了CML细胞的克隆形成能力。

1.4 SOS1-siRNA#3有效增加了CML细胞对imatinib的药物敏感性

如图5所示，在K562/KCL-22/KU812细胞增殖实验中SOS1敲低组(SOS1-siRNA#3)，与空白(BK)和随机对照组(NC)相比，imatinib的半抑制浓度显著降低(图5)，即：SOS1-siRNA#3组在较低的imatinib作用浓度下细胞活力明显受到抑制，说明SOS1的敲低增加了细胞对imatinib药物敏感性。如图6所示，Soft agar实验结果可以看出，K562-SOS1-siRNA#3组相比于K562-BK组和K562-NC组克隆细胞团数随着imatinib药物浓度的增加显著降低，在KCL-22细胞中，结果呈现一致趋势；结果说明，SOS1-siRNA#3组在imatinib作用下显著抑制细胞的克隆形成能力，有效的提高了CML细胞对imatinib的药物敏感性(图6)。

2.讨论

研究表明通过检测mRNA水平及蛋白水平的表达量变化，筛选出SOS1有效siRNA序列，SOS1-siRNA#3，可以有效抑制CML细胞的增殖能力、克隆形成能力，并且在动物体内有效抑制移植瘤的生长，同时增加了CML细胞对imatinib的药物敏感性。因此，SOS1可能是慢性粒细胞白血病治疗的一个潜在的新靶点，而SOS1-siRNA具有潜在的克服imatinib耐药性的价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种靶向抑制SOS1基因表达的siRNA及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOS1-siRNA#3正义链

<400> 1

gccttactgt ttacgagta 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOS1-siRNA#3反义链

<400> 2

tactcgtaaa cagtaaggc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOS1-siRNA#1正义链

<400> 3

gcagaatctt caccatcta 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOS1-siRNA#1反义链

<400> 4

tagatggtga agattctgc 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOS1-siRNA#2正义链

<400> 5

gtagcagtct tagaataca 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOS1-siRNA#2反义链

<400> 6

tgtattctaa gactgctac 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NC正义链

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NC反义链

<400> 8

acgugacacg uucggagaat t 21