缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒

摘要

本发明公开了缺失型alpha‑地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.9的碱基序列。据此，发明人还研制了相应试剂和并建立相应基于Taqman探针的三重荧光PCR检测非常见缺失型alpha‑地中海贫血的方法。本发明具有灵敏度高、特异性强、结果可靠的特点，是一种理想的大规模探索广西常见和非常见的缺失型alpha‑地中海贫血基因的方法，从而弄清广西非常见的缺失型alpha‑地贫基因突变的基因谱和基因突变频率，为广西调整地贫防治策略、降低地贫患儿的出生提供科学依据。

说明书

技术领域

本发明属于地中海贫血检测技术领域，尤其涉及缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。

背景技术

广西是我国地贫发病率和基因携带率最高的地区，最新调查显示，广西地贫的基因携带率是21％(alpha-地贫15.2％，belta-地贫5.8％)。地贫治疗困难，费用昂贵，对于大多数患者来说，倾其所有财富，却最多只能活到20岁，因此，地贫是广西亟待解决的重大民生问题。然而，当前广西地中海贫血的总发病率仍然高达0.2％，地中海贫血基因携带率仍然高达21％，说明目前使用的地中海贫血筛查方法存在不足，主要是：

①不能检出静止型alpha-地中海贫血和轻型beta-地中海贫血；

②只能检出常见型的地贫类型，不能检出非常见的地中海贫血。

alpha-地贫的分子基础是位于16号染色体末端位点p13.3上的人alpha-珠蛋白基因(HBA2和HBA1)先天性遗传缺陷,从而使红细胞的主要结构蛋白(血红蛋白)生成障碍,并导致无效造血和红细胞破坏，而产生慢性溶血性贫血。alpha-地贫主要是由于alpha-珠蛋白基因缺失所致(90％以上),只有少数alpha-地贫是由于alpha-珠蛋白基因的点突变所致。据此将alpha-地贫分为两大类,即缺失型和非缺失型alpha-地贫。缺失型alpha-地贫的分子缺陷是包含alpha-珠蛋白基因在内的大片段基因缺失,其范围从几kb到100kb以上。非缺失型alpha-地贫突变的主要类型是发生在HBA2或HBA1结构基因或启动子区的点突变,导致加工异常、抑制转录或使翻译产物不稳定。正常人两条染色体上共有4个alpha-珠蛋白基因。不同类型的缺失型alpha-地贫患者,体内缺失的alpha-珠蛋白基因数目各不相同,缺失的alpha-珠蛋白基因越多,病情越严重。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：

缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，探针HBAPbR102、探针CRE Pb186R-Joe、探针HBZ PbR9413-cy5的5’端分别标记有荧光报告基团FAM、JOE、CY5，其3’端分别标记有荧光淬灭基团BHQ1、BHQ1、BHQ3。

缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、DNA聚合酶、检测引物和检测探针；检测引物和检测探针是分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：

探针HBA PbR102、探针CRE Pb186R-Joe、探针HBZ PbR9413-cy5的5’端分别标记有荧光报告基团FAM、JOE、CY5，其3’端分别标记有荧光淬灭基团BHQ1、BHQ1、BHQ3。

上述alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测试剂盒在PCR扩增反应中的应用。

PCR扩增反应的体系为：

反应体系总体积25μL，引物终浓度400nM，探针终浓度200nM；

其中，主反应液(Master Mix)组成为：

引物探针Mix(PMix)组成为：

PCR扩增反应的程序为：95℃，5min；45个循环×(95℃，10s；60℃，45s)。

针对非常见的地中海贫血缺乏有效检测手段的问题，发明人根据HBA、CRE、HBZ基因序列，设计并制备了缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.9的碱基序列。据此，发明人还研制了相应试剂和并建立相应基于Taqman探针的三重荧光PCR检测非常见缺失型alpha-地中海贫血的方法。

试验结果显示，正常样本的判定值位于0.9-1.1之间，3个α基因拷贝的判定值位于0.65-0.85之间，2个α基因拷贝的判定值位于0.4-0.6之间，1个α基因拷贝的判定值位于0.15-0.35之间。表明设计的引物和探针特异性强、体系的优化效果也较佳，能辨别出不同α基因的拷贝数，具有灵敏度高、特异性强、结果可靠的特点，是一种理想的大规模探索广西常见和非常见的缺失型alpha-地中海贫血基因的方法，从而弄清广西非常见的缺失型alpha-地贫基因突变的基因谱和基因突变频率，为广西调整地贫防治策略、降低地贫患儿的出生提供科学依据。

附图说明

图1是应用本发明进行PCR扩增HBA、CRE和HBZ基因的结果图。

具体实施方式

一、研究设计

该研究拟建立一个高通量高灵敏度的三重实时荧光定量PCR检测方法，能用于大规模探索非常见的缺失型alpha-地中海贫血基因，利用正常人和缺失型突变者alpha-珠蛋白基因(HBA2、HBA1)拷贝数不同，同步检测HBA2、HBA1和内参基因，根据2-△△Ct原理，相对定量HBA2、HBA1的基因拷贝数，从而检测HBA2、HBA1的基因缺失或基因叠加。由于HBA2和HBA1具有高度的同源性，作为一个初筛试验，同时测定HBA2和HBA1是不必要的。在本发明中，仅测定HBA2和HBA1的共同特征基因片段HBA，这种改变会减少多重PCR体系的复杂性。此外，先前一直有关于HBZ造成地贫缺失的报道，为了提高筛查试验检出非常见缺失型alpha-地贫基因突变的能力，加入了HBZ基因。这样不仅能检出常见的缺失类型，而且能检出非常见的缺失类型。研究通过设计HBA、HBZ和参比基因CREBP的引物和探针，建立三重TaqMan实时荧光定量PCR检测体系，为在广西全区大规模筛查缺失型alpha-地贫基因突变，进行流行病学调查提供有力工具。

二、引物和探针的设计和合成

通过NCBI上下载相关序列，通过BLAST功能保证引物序列的准确性，再用ABI的Primer Express 3.0软件设计引物和TaqMan探针，委托深圳优圣康生物科技有限公司设计，所有引物探针均在Life公司合成，引物和探针序列见表1。

表1荧光PCR引物和探针序列

其中，探针HBA，CRE，HBZ的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，JOE，CY5；HBA，CRE的3’端均标记有荧光淬灭基团BHQ1，HBZ的3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3。

三、三重实时荧光定量PCR检测方法

1、操作步骤：

1)对样本进行前处理：通过细胞分离液分离白细胞，尽可能去除红细胞或其碎片；

2)提取DNA：采用分离液分离白细胞以后提取DNA，提取的DNA测定浓度后稀释至2ng/μL；

3)使用针对HBA，CRE，HBZ基因的引物和探针，与实时荧光定量PCR扩增用的反应液及DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；

PCR扩增反应的体系为：

反应体系总体积25μL，引物终浓度400nM，探针终浓度200nM；

其中，主反应液(Master Mix)组成为：

引物探针Mix(PMix)组成为：

4)将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应(程序为95℃，5min；45个循环×(95℃，10s；60℃，45s)，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数(Ct)；

5)根据各样品的Ct值，按照建立的判定值2-△△ct来判定基因的缺失，实现缺失型α-地贫的快速筛查。

2、结果判定标准

判定值是2-△△Ct，如果2-△△Ct＝1±0.1，为正常样本；2-△△Ct＝0.75±0.1，为3个α基因拷贝；2-△△Ct＝0.5±0.1，为2个α基因拷贝；2-△△Ct＝0.25±0.1，为1个α基因拷贝。

四、实施例

先将600μL白细胞分离液加到2ml离心管底部，缓慢加入200μL临床人血液样本：EDTA抗凝，4℃保存不超过7天，加到分离液面上层，离心8000rpm，10min，通过白细胞分离液分离白细胞。

从上到下吸取直至中间透明的白细胞层。避免吸到下层分离液层。

加600μL红细胞裂解液裂解红细胞。放冰上5min。离心机8000rpm，10min。

加蛋白酶K20μL，裂解液180μL。震荡混匀。让白细胞充分重悬，消化。

56℃孵育大于15min，95℃孵育1h。实验结果显示，DNA提取过程中，95℃处理1h的步骤不可或缺，无论哪种前处理，缺少这一步，结果大受影响。震荡混匀，瞬时离心机离心。

加结合液200μL，震荡混匀。再加200μL无水乙醇。震荡混匀，瞬时离心机离心。

加到离心柱中，8000rpm离心，1min。倒掉底部废液，加500μL洗液1，8000rpm离心，1min。加500μL洗脱液2，离心8000rpm，1min。倒掉底部废液。8000rpm离心，3min。开盖烘干2min左右，挥发乙醇，换新的离心柱底座，加洗脱液100μL，静置2min。8000rpm离心，1min。这样就提取出所需DNA，用于荧光PCR扩增。

实时荧光扩增体系：反应体系25μL，模板DNA5μL、PCR反应液16.5μL、引物探针混合液3μL(包括HBA，CRE，HBZ的探针3条，HBA，CRE，HBZ的引物各2条)、DNA聚合酶0.5μL。实时荧光PCR反应参数为：95℃，5min；45个循环×(95℃，10s；60℃，45s)。

结果与分析

1、取正常临床样本检测，采用分离液分离白细胞后提取DNA，提取的DNA测定浓度后稀释至2ng/μL。结果如表2和表3所示，表2是HBA拷贝数测定，表3是HBZ拷贝数测定，可以看出，经本实施例的实时荧光PCR扩增ct值，判定值得结果偏差可以满足检测要求：0.9±0.1，具有较好的分辨性。

表2 HBA拷贝数测定

表3 HBZ拷贝数测定

2、取地贫临床样本检测，采用分离液分离白细胞后提取DNA，提取的DNA测定浓度后稀释至2ng/μL。样本信息如表4所示：

表4样本信息

检测结果如表5所示。

表5检测结果

表6结果分析

如表5和表6所示，使用HBZ作为HBA的内控时，阴性样本的判定值标准偏差较以CRE为内控时稍小些。结果与标准分子检测结果相符。

3、方法验证

13份全血样本全部做了分子检测(gapPCR)，HBA的拷贝数如表7：

表7样本拷贝数

HBZ基因只有点突变样本，无基因缺失样本，不适用此检测。

样本提取：取200ul全血白细胞分离液分离白细胞，红细胞裂解液洗涤一次后提取DNA。qPCR检测2平行/样本。检测结果如表8：

表8检测结果

结果显示，在已分离白细胞提取DNA的前提下，以CRE和HBZ作为内控，3拷贝HBA样本结果差异较大。以HBZ为内控，能够较好的分辨3拷贝和4拷贝HBA样本(判定值均值<0.85为阳性)。阴性样本的参考值均值均落在0.9至1.1之间，符合检测结果的质控要求。

综上，当以HBZ为内控时，阳性预期值为0～0.89(2平行结果均值)，阴性预期值为0.9～1.1。阳性符合率(灵敏度)为100％，阴性符合率(特异性)为100％。当以CRE为内控时，阳性预期值为0～0.89(2平行结果均值)，阴性预期值为0.9～1.1。阳性符合率(灵敏度)为75％(6/8)，阴性符合率(特异性)为100％(5/5)。

结论与讨论

血液中含有血红蛋白，免疫球蛋白等大量的PCR抑制物，纯化过程中抑制物去除不彻底，可能会影响PCR的结果，如Ct值，荧光信号强度等。实际测试中发现简易的提取方法得到的DNA会影响靶标的Ct值。有趣的是，不同的靶标，这种影响存在较大的差异，而且这种差异是独立存在的。比如，HBA，HBZ和CRE三个基因的扩增子中，CRE扩增子受到的影响较小，而HBA和HBZ扩增子(特别是前者)影响非常显著。而且无论单重还是多重体系，结果是一致的，与靶标之间的相互干扰无关。DNA纯度越高，抑制性越小，Ct值越接近对照，而荧光增量没有显著变化。值得注意的是，这种抑制和酶活似乎没有关系，影响仅仅表现为Ct值的退后。推测某种DNA调控因子会与HB基因结合而影响其扩增。

为了减小抑制物对靶标扩增的影响，首先采取将白细胞(或细胞核)从血液中分离出来再进行提取的方式，最大限度的去除血液中的干扰物。其次，在裂解过程中加入95℃孵育1h的步骤，也大大降低了扩增干扰。具体的，采用细胞分离液(密度梯度离心法)加细胞裂解液洗涤白细胞沉淀，HBA扩增受到的影响明显降低。

系统误差的影响：由于Ct值的判定与多种因素相关，存在一定的系统误差，选择合适的仪器和质控品也至关重要。目前测试的仪器为ABI7500，不同通道的荧光相对强弱及孔位差异都可能或影响结果，目前我们在试剂中加入了ROX染料做矫正，并选择多个正常样本的Ct值平均值作为参考值，在一定程度上可以减小系统偏差的影响，而每个样本的检测需至少做两个平行，减小系统误差的影响。在实际检测中，需要对仪器的全孔位(或代表孔)做重复性测试，比如将阴性参考品(正常样本)的检测管放置在96孔板的四周及中间的孔位中，以了解仪器不同孔位的偏差有多大。

内控的选择：由于干扰物对HBA和HBZ的扩增影响显著高于对CRE的扩增，用HBZ作为内控，其对结果的影响会减小。实际检测中，以HBZ作为内控时，检测效果明显优于以CRE为内控。

序列表

<110> 右江民族医学院

<120> 缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctcctgccg acaagaccaa 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agggcctccg caccatact 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgaccttac cccaggcggc c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgggccagt atatccccag t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccatcaactc agccttccaa agt 23

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaccgcgc ccggcc 16

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcctgagg tcggtgtca 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaggagcag ggcccagta 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcctggga ccaagcccca cg 22