一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用

摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(HA‑PG)及其合成方法和其在药物制剂中的应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。所述的透明质酸基团由D‑葡萄糖醛酸和N‑乙酰葡糖胺组成双糖单位并通过β‑1,4‑糖苷键连接，透明质酸分子上的羧基通过酯键与聚甘油脂肪酸酯上的羟基连接，结构式为：其中HA表示透明质酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在HA分子中PG片段的数目，Y为HA分子中唾液酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤2960，1≤Y≤3700，X/Y为0.027％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用，尤其是用于微粒制剂的制备和修饰。

背景技术

癌症是危害人类健康、破坏家庭与社会和谐最严重的疾病之一。进入21世纪后，癌症已经成为除心血管疾病以外人类的头号杀手。2018年2月，国家癌症中心发布的最新一期的全国癌症统计数据显示(陈万青,孙可欣,郑荣寿,等. 中国肿瘤,2018,27(1):1-14.)：(1)全国癌症的发病率以惊人的速度增长，2014 年全国恶性肿瘤估计新发病率数380.4万例(男性211.4万例，女性169.0万例)，平均每分钟就有7人被确诊为癌症；(2)国内不同地区恶性肿瘤发病率有所不同，随恶性肿瘤发病率由高到低排列依次为东部、中部、西部，其中各地区男性发病率均高于女性；(3)全国各地区肿瘤发病情况与患者年龄息息相关，0～30岁恶性肿瘤发病率较低，30岁以上人群发病率快速增长，80岁以后达到高峰； (4)在全国范围内，肺癌位居全国肿瘤发病率首位，每年发病约78.1万，其后依次是胃癌、结直肠癌、肝癌和乳腺癌。肺癌和乳腺癌分别位居男女性发病率的第1位。随着全球人口的不断增长与老龄化，加上越来越多的人群沾染上不健康的生活习惯，肿瘤的发病率与死亡率已呈逐年上升的趋势，如何有效地治疗肿瘤已成为人类必须面对的世界性难题。

化疗是利用化学药物抑制肿瘤细胞的生长、繁殖、浸润与转移等最终杀灭肿瘤细胞的一种治疗方式，是一种全身治疗的手段，无论采用何种给药途径，化疗药物都会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官与组织。化疗应用范围最广，是目前治疗癌症最有效的手段之一(DAI W,WANG X,GE S,et al.Advanced Drug Delivery Reviews,2017,115:23-45.)。化疗以杀死肿瘤细胞为目的，但由于化疗药物的体内选择性不强，体内分布较广泛，导致在抑制肿瘤细胞生长的同时，也不可避免地抑制了机体的正常细胞与免疫细胞，因此，常规治疗剂量的化疗药物就会对正常组织器官造成严重的毒副作用，对肿瘤患者造成极大的痛苦，使得其治疗的顺应性较差。因此，科研人员试图赋予药物靶向性，降低药物对非靶部位的毒副作用，同时提高药物的治疗指数。

透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。D-葡萄糖醛酸及N- 乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸(Hyaluronan)，又称糖醛酸、透明质酸，基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。透明质酸分子能携带500倍以上的水分，为当今所公认的最佳保湿成分，广泛的应用在保养品跟化妆品中。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合，保水作用等。透明质酸作为一种天然多聚糖，具有较高稳定性、安全、低毒性、亲水性、易于化学修饰和可生物降解等特性， HA受体CD44和HA介导能动性的受体(Receptor for hyaluronic acid-mediated motility,RHAMM)在多种正常组织细胞(骨髓充间质干细胞，软骨细胞，破骨细胞等)和肿瘤细胞中表面均有不同程度的表达，可以与HA发生特异性结合，利用这一特性，以透明质酸为基础的给药系统可以实现治疗药物在细胞水平上的特异型靶向作用。因此，基于透明质酸共聚物和其作为药物传递系统的研究是。 Jae Hyung Park等制备了一种新型基于透明质酸衍生物胶束给药系统，通过将胆酸通过化学反应连接到透明质酸骨架上，从而形成一种两亲性的透明质酸衍生物，其在水溶液中可以自聚集形成胶束，文章中使用这一载体包裹药物，实现了结肠癌的治疗(Choi KY,Chung H,Min KH,et al.Biomaterials,2010,31(1):106-114.)。此外，还有Dae-Duk Kim等人使用其构建的透明质酸衍生物给药系统实现肿瘤靶向治疗的报道(ChoHJ,Yoon HY,Koo H,et al.Biomaterials,2011, 32(29):7181-7190.)。然而，由于HA的亲水性较强，并且游离的HA在血浆中极易被降解清除。因此，我们需要对HA进行衍生化，制备两亲性具有长循环能力的HA衍生物。

聚甘油脂肪酸酯(PG)是一种多元醇酯类的非离子表面活性剂，它属于单甘酯的衍生物，但又不同于有机酸单甘酯。(蔡云升,卜永士.食品工业科技,2003(07):54-56.)聚甘油脂肪酸酯是由甘油在一定条件下聚合生成一系列不同聚合度的聚甘油，再进一步同脂肪酸酯化而得的产品。正是由于其聚合度、脂肪酸种类以及酯化度的不同，使得聚甘油脂肪酸酯具有较宽范围的HLB值，亲水亲油性差异跨度大，因而可广泛应用到多个不同领域。聚甘油脂肪酸酯应用最广泛的领域是食品工业，其不仅具有较强的乳化、粘度调节、结晶调整、品质改良、抗菌、分散、渗透及溶化力，且具有比其他多羟基类脂肪酸酯更强的耐酸和耐热能力，早已被联合国粮农组织、世界卫生组织和欧共体确认为无毒无害的高安全性食品添加剂。Amr等人研究证明(BASALA,AKN,ATS,et al.Int J Pharm,2013, 456(1):235-242.)，聚甘油或聚乙二醇(PEG)修饰的纳米脂质体均具有体内长循环特性，但是重复注射PEG修饰的脂质体会诱导机体产生抗PEG-IgM，并诱发强烈的免疫反应——加速血液清除现象(Accelerated blood clearance,ABC phenomenon)，而重复注射PG修饰的脂质体，不会诱导ABC现象，也不会产生抗PG-IgM。因此，聚甘油衍生物具有较低的免疫原性和较高的生物安全性，并且具备替代PEG的潜力。

综上所述，我们期望通过将HA与PG进行共价偶联，并将其稳定修饰于胶束、脂质体、囊泡、乳剂和纳米粒等微粒给药制剂表面，制备成一系列具有低免疫原性，肿瘤特异性靶向能力，长循环能力的靶向化疗药物递送系统。

发明内容

本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提出一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用。基于HA能够高效靶向肿瘤细胞表面高表达的CD44受体，通过PG对HA进行衍生化，将 HA-PG稳定修饰于微粒制剂表面，制备一种HA修饰的具有低免疫原性，肿瘤特异性靶向能力，长循环能力的靶向化疗药物递送系统。该药物递送系统通过长循环作用，有效利用高渗透长滞留效应(Enhancedpermeability and retention，EPR effect)蓄积于肿瘤部位，进一步通过HA主动靶向高表达CD44受体的肿瘤细胞，对肿瘤进行靶向化疗。

本发明是通过如下技术方案实现的：

提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(HA-PG)，所述透明质酸基团由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成双糖单位通过β-1,4-糖苷键连接，所述透明质酸上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：

其中，HA表示透明质酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在 HA分子中PG片段的数目，Y为HA片段中透明质酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤2960，1≤Y≤3700， X/Y为0.027％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。

优选的，1≤X≤500，10≤Y≤1000，X/Y为1％～50％，1≤n≤12，8≤m≤20。

在一些实施例中，所述HA聚合度是1-3700，平均分子量为396-1400000道尔顿；优选HA聚合度为10-1000；平均分子量为3800-380000道尔顿。

在一些实施例中，所述PG的聚甘油部分具有1-100甘油重复单元，平均分子量为92-7400道尔顿；优选PG的聚甘油部分具有1-40甘油重复单元，平均分子量为92-3000道尔顿；更优选PG的聚甘油部分具有1-12甘油重复单元，平均分子量为92-1500道尔顿。

在一些实施例中，所述PG的非极性碳氢链数量为1～3，分别为1条碳氢链 (聚甘油单脂肪酸酯)，2条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)，3条碳氢链(聚甘油三脂肪酸酯)，优选一条碳氢链(聚甘油单脂肪酸酯)和两条碳氢链(聚甘油二脂肪酸酯)。

在一些实施例中，所述PG的碳氢链长度包含4～32个碳原子的烷基和烯基；优选地，所述PG的碳氢链选自辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，花生四烯酸，油酸中一种或多种；更优选是，所述PG的碳氢链选自是棕榈酸和硬脂酸中的至少其中之一。

本发明还提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物的合成方法，所述合成方法包括：反应投料比例为，HA/PG/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)/1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/三乙胺(TEA)＝1:1:2:4:4(摩尔比)；首先，将HA溶在5mL的FA中，加入EDC/NHS，活化1.5h，此时体系澄清，HA浓度为1～500mg/mL，EDC浓度为1～400mg/mL，NHS浓度为1～200 mg/mL；再将溶解在2mL的甲酰胺(FA)中的PG加入反应体系中，PG浓度为 1～500mg/mL；然后，加入TEA，TEA浓度为0.1～200mg/mL。氮气保护下，室温搅拌反应48h后，将反应液转移至透析袋中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1/100) 体系，透析介质体积为1000mL，每隔4h换透析介质，累计透析24h；采用旋转蒸发除去80％水，冷冻干燥剩余溶液，得到白色絮状物质，即为合成物质HA-PG。

将反应液转移至透析袋(MWCO 8～14kDa，美国光谱)中，透析介质为浓盐酸-水(V/V，1/100)体系，透析介质体积为1000mL，每隔4h换透析介质，累计透析24h；随后，采用旋转蒸发除去80％水，冷冻干燥剩余溶液，得到白色絮状物质，即为合成物质HA-PG。

本发明还提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物在药物制剂中的应用，尤其是所述的HA-PG在微粒给药制剂的制备和修饰中的应用，所述的微粒给药制剂可以为胶束、脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。HA-PG与药物可以直接组装制备成纳米胶束，也可以选择磷脂、泊洛沙姆、吐温、司盘等表面活性剂混合组装制备成脂质体、囊泡、乳剂或纳米粒。药物与HA-PG的质量比为 1:1～1:100；优选地，药物与HA-PG的质量比为1:3～1:20。

综上所述，本发明提供了一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物及其合成方法和其在药物制剂中的应用，该衍生物制备的微粒制剂能够主动靶向肿瘤细胞表面高表达的CD44受体，进行靶向化疗；同时，HA-PG具有极好的保湿和防腐功能，可应用于皮肤保护功能的化妆品等。本发明的HA-PG采用低免疫原性的HA和PG通过共价偶联获得，其生物相容性和生物可降解性较好，并且HA-PG具有两亲性，能够稳定修饰在纳米制剂表面，具备良好的临床转化和产业化开发前景。

附图说明

图1为透明质酸-十聚甘油二硬脂酸酯的

图2为透明质酸-十二聚甘油二棕榈酸酯的

图3为透明质酸-六聚甘油月桂酸酯的

图4为透明质酸-三聚甘油辛酸酯的

图5为重复注射大鼠体内药动学行为(A)和组织分布(B)；

图6为DOX-HL荷瘤小鼠体内药动学行为；

图7为S180荷瘤小鼠肿瘤生长曲线；

图8为S180荷瘤小鼠肿瘤生存曲线；

图9为CD44阳性S180细胞对HA97-PG10-2C18修饰多柔比星脂质体的摄取。

具体实施方式

下面结合实例对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明提供一种含有透明质酸基团的聚甘油脂肪酸酯衍生物(HA-PG)，所述透明质酸基团由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成双糖单位通过β-1,4-糖苷键连接，所述透明质酸上的羧基与聚甘油脂肪酸酯上的羟基通过酯键连接，其结构式为：

其中，HA表示透明质酸基团，PG表示聚甘油脂肪酸酯片段，X为接枝在 HA分子中PG片段的数目，Y为HA片段中透明质酸单元的数目，n表示PG片段中聚甘油的聚合度，m表示PG片段中碳氢链的碳原子数，1≤X≤2960，1≤Y≤3700， X/Y为0.027％～80％，1≤n≤100，4≤m≤32。

材料来源：

本发明中，所用HA的聚合度分别为2～10、14、27、53、97、350～400、800～1000、2400～2600、3500～3700，对应分子量分别为774，1152，1530，1908，2286，2664， 3042，3420，3798及平均分子量为5000，1万，2万，3.9万，13～15万，90～100 万及130～140万道尔顿。聚合度2～10、14、97、2400～2600、3500～3700的HA 购买自山东华熙生物科技股份有限公司；其余分子量的HA通过水解聚合度为 3500～3700的HA制得。

实施例1十聚甘油二硬脂酸酯与HA

本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA

在IR光谱中，HA

请参考图1，HA

接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％

DS可通过

通过

DS＝6.37×3/(1.00×60)×100％＝31.4％(此公式中，X为30，Y为97)

实施例2十二聚甘油二棕榈酸酯与HA

本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA

在IR光谱中，HA

如图2所示，HA的特征峰(–COCH

接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％

DS可通过

通过

δ1.31ppm＝5.27δ2.03ppm＝1.00

DS＝5.27×3/(1.00×52)×100％＝30.4％(此公式中，X为4，Y为13。)

实施例3六聚甘油月桂酸酯与HA

本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA

在IR光谱中，HA

如图3所示，HA的特征峰(–COCH

接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％

DS可通过

通过

δ1.22ppm＝1.04δ2.05ppm＝1.00

DS＝1.04×3/(1.00×18)×100％＝17.3％(此公式中，X为16.8，Y为97。)

实施例4三聚甘油辛酸酯与HA

本发明所述的HA-PG制备过程：首先，投料比例为透明质酸(HA

在IR光谱中，HA

如图4所示，HA的特征峰(–COCH

接枝率(degrees of substitution，DS)＝X/Y*100％

DS可通过

通过

δ1.26ppm＝1.07δ1.99ppm＝1.00

DS＝1.07×3/(1.00×10)×100％＝32.1％(此公式中，X为4.2，Y为13)

实施例5 HA衍生物临界胶束浓度(CMC)的测定

根据实施例1～4中合成的HA

精密移取0.1mL浓度为1×10

表1 HA-PG衍生物的临界胶束浓度

实施例6紫杉醇HA-PG

称取一定量的紫杉醇(PTX)、HA

实施例7 HA

制备工艺如下：根据表2处方称取脂质体膜材置于西林瓶中，加入500μL 无水乙醇并于65℃水浴中搅拌溶解。待膜材及药物溶解后，敞开体系，继续搅拌挥除80％无水乙醇。以1mL·S

表2 DOX脂质体处方

DiR脂质体制备处方如表3所示，制备工艺与DOX脂质体相同，只需将DiR 替换DOX。

表3 DiR脂质体处方

实施例8 HA

制备工艺：根据表4处方参数，将处方量水相55℃预热备用。将处方量油相(CAR、MCT、S90G、HA

表4 HA

实施例9 HA

制备方法：根据表5处方参数，适量乙醇溶解处方量的Q10、EPCs、GMS、 HA

表5 HA-PG10-2C18修饰纳米粒处方

实施例10 HA

制备方法：60℃下将处方量Tween80、S80、CH、HA

表6 HA

实施例11 HA-PG急性毒性初步实验

HA-PG衍生物溶液的制备：取HA-PG衍生物适量，加入50.0mg蛋黄卵磷脂E80，500μL无水乙醇溶解，加灭菌注射用水稀释至5mL，过0.22μm微孔滤膜即得。

HA-PG衍生物急性毒性考察方案：81只小鼠随机分为27组，每组3只，即 HA

表7 HA-PG衍生物的药动学实验结果

*ND代表小鼠存活时间超过24h.

由上表可知，材料HA

实施例12 HA

为了考察重复注射在大鼠体内的药动学及组织分布，给药方案如表8。根据实施例7中的处方工艺制备脂质体。首次注射，DiR-HL和DiR-PL以磷脂剂量为0.01μmol/kg尾静脉注射，间隔7天以5μmol磷脂/kg的剂量二次注射DiR-PL 脂质体。对照组首次注射5％的葡萄糖注射液。二次给药后分别于0.083、0.25、 0.5、1、2、4h经眼眶静脉丛取血，4500rpm离心10min获取血浆。4h后处死动物，取出肝脾，生理盐水洗净，滤纸吸干，所得血浆及组织样品于-20℃冷冻保存待用。

结果：如图5所示，重复注射DiR-PL后其DiR的血浆浓度迅速降低(P<0.01)，肝脾聚集量显著增加，即DiR-PL会引起严重的ABC现象。然而，DiR-HL的药动曲线首次和二次基本相似。肝脾聚集量没有差异，结果表明，SL重复注射不会诱导ABC现象。

表8重复注射HA

注：ABC index用来评价ABC现象强弱。ABC index＝AUC二次注射/AUC首次注射。

ABC index越大，表明诱导ABC现象越弱，本研究中，HA修饰脂质体的 ABC index(0–30min)为0.97±0.02，而PEG修饰脂质体为0.15±0.04，两者具有显著性差异(P<0.01)。结果表明HA修饰脂质体会避免ABC现象的发生。

实施例13 HA

药动学实验：取12只健康雄性S180荷瘤昆明小鼠，瘤体积为300～400mm

由图6的药动学行为可知，令人振奋的是，DOX-HL和DOX-PL均具有长循环特性，能够有效利用实体瘤高渗透长滞留效应(EPR效应)，为DOX-HL 的抗肿瘤药效学奠定了良好的基础。

实施例14 HA

如图7和图8所示，S180抗肿瘤实验：将24只荷瘤小鼠随机分为4组，即对照组(Control，0.9％NaCl注射液，10mL·kg

抗肿瘤实验表明，如图8所示，HA

实施例15 HA

为了进一步研究载体在细胞内转运行为，取对数生长期的CD44阳性S180细胞，小心吸走培养皿中的培养基，PBS清洗一遍后加入新鲜的培养基，轻轻吹打细胞使其成为细胞悬液。取洁净细胞爬片在75％乙醇中浸泡5min，用无菌的PBS 洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于十二孔板内，接种细胞并置于5％CO2，37℃的培养箱中培养过夜，使其约为50％～80％满。更换培养基为含 HA

如图9所示，DOX-PL由于PEG层的阻隔作用，S180细胞对DOX-PL摄取受阻，细胞中DOX摄取量较少，阳性率较低；令人惊喜的是，DOX-HL能够被CD44阳性S180细胞快速大量摄取，并且加入HA97进行抑制实验时，CD44阳性S180细胞对DOX-HL的摄取能力急剧降低。证明S180肿瘤细胞能够通过HA介导高效靶向摄取DiR-HL。因此，这也可以充分解释实施例14中，DOX-HL能通过靶向肿瘤部位，释放DOX，杀伤肿瘤。

实施例16长期稳定性实验

为了进一步研究HA-PG制备的微粒制剂的长期稳定性，我们采用实施例1～4 中合成的HA

如表9所示，HA

表9长期稳定性实验。