使用磁性微粒将分析物从大体积浓缩至较小体积中的DMF方法和系统

摘要

本文公开了在使用虚拟通道的数字微流体装置上使用磁性微粒的组合从大样品溶液中浓缩分析物的方法和系统。通过将电压施加到将正好位于DMF装置之外的溶液储库与流体出口位置连接的DMF的一系列驱动电极来产生虚拟通道。首先将磁性微粒暴露于含有分析物的液体样品，由此分析物被微粒上的分析物特异性受体结合。通过使这些磁性颗粒的溶液流过DMF装置中的虚拟通道，无论DMF的总容量如何，都可以处理大量溶液。当磁性微粒的悬浮液流过虚拟通道时在DMF装置下面接合磁体导致微粒被固定以及上清液被移除。然后可将分离的磁性微粒重悬浮于小得多的体积中，并在DMF装置上进行进一步处理以用于任何应用，从而与原始液体溶液相比显著增加了小液滴中的分析物浓度。

说明书

技术领域

本公开涉及基于数字微流体(DMF)的方法和系统，其用于使用具有与其结合的分析物特异性受体的磁性-微米颗粒和纳米颗粒将分析物从大体积浓缩到较小体积中。

背景技术

磁性微米颗粒和纳米颗粒是直径在微米或纳米长度尺度上的颗粒(下文称为“微粒”)，其具有磁性或顺磁性核心，使得它们易受磁场操纵。这些颗粒的表面可用特异性结合元件(例如核酸、抗原、抗体)(也称为分析物特异性受体)功能化。功能化微粒用于多种应用，包括免疫测定、样品净化(sample cleanup)和核酸测定。将磁性颗粒暂时固定在磁场中使用户能够改变其中悬浮颗粒的溶液以及其中悬浮颗粒的体积。磁性微粒的浓度在以下情况下特别有用：(a)在微粒上捕获的目标分析物是以低浓度存在的溶质或以低密度存在的悬浮颗粒(例如，循环的肿瘤细胞)，和/或(b)检测方法没有足够的灵敏度来检测捕获的靶标¹。

DMF是其中在电极阵列的表面上操纵离散的液滴的新兴技术。DMF与常规基于封闭微通道的流体相比具有许多互补性差异，包括可重新配置性(通用设备形式可用于任何应用)和对所有试剂的绝对控制。DMF通常以“双板”形式实现，其中将液滴夹在底板(带有涂覆有绝缘体的电极阵列)与顶板(带有未涂覆绝缘体的接地电极)之间。²

最近，DMF已被证明是处理小体积的磁性微粒的有用工具。^3-8其开放式平台消除了颗粒堵塞装置的可能性(与微通道不同)，并且其可重新配置性意味着单个芯片可以与适当功能化的颗粒结合用于各种应用。

迄今为止，DMF芯片的一个限制是无法使用大体积，这限制了浓缩稀溶质或悬浮颗粒的能力。底层电极的面积决定了DMF芯片上的流体体积，并且芯片的总体积容量是所有电极的面积总和乘以底板与顶板之间的间隙距离。因此，任何芯片上可能的理论浓缩系数都受到DMF装置的总面积和最小电极的面积的限制。

在实践中，由于围绕装置的几何形状和磁体定位的限制，浓缩系数将小于该理论系数。为了在DMF装置上将磁性微粒有效地浓缩几个数量级的倍数，该装置必须能够处理远大于装置容量的体积。

发明内容

本文公开了用于将分析物从一定体积的液体样品隔离并浓缩至具有较小体积的试剂液滴的方法。该方法包括将涂覆有分析物特异性受体的磁性微粒暴露于一定体积(所述体积可以是任意大的)的含有分析物的液体样品的体积中并孵育，使得分析物与颗粒上的受体结合。将一定体积的含有磁性微粒的液体放置于数字微流体装置上的电极上或其附近。通过用从储库到要从中移除液体的出口位置跨数字微流体装置的电压的预选模式激活驱动电极的预选模式来产生跨数字微流体装置的虚拟流体流动通道。同时，沿着虚拟流体流动通道在预选的保持位置处施加磁场，使得在激活驱动电极的预选模式时，使来自储库中的液体体积的液体沿着虚拟流动路径从储库移动。随来自储库的液体一起移动的具有与分析物特异性受体结合的分析物的磁性微粒在到达保持位置时，被磁场保持在保持位置，并且剩余的液体通过泵机构流到出口位置。

一旦磁性颗粒被固定或保持在保持位置，就将所选试剂的液滴分配在保持在保持位置的磁性微粒上。与从其提取分析物的液体的原始体积相比，该试剂液滴具有小得多的体积。可在添加试剂液滴之前，或在添加液滴期间，或在添加试剂液滴之后去除磁场。通过DMF进一步处理含有磁性微粒的试剂液滴，以确保磁性颗粒与试剂液滴均匀混合，例如通过激活各种驱动电极以使液滴移动而引起混合。含有具有与其结合的分析物的磁性微粒的试剂液滴含有比液体体积中的分析物浓度更高的分析物浓度。

在一个实施方案中，泵送机构可以是位于出口位置的吸收性芯吸介质(例如纸巾或滤纸片)，并且一旦通过向连接储库与出口位置的一系列电极施加电压来产生虚拟通道时，吸收性芯吸介质就可通过毛细管力芯吸流体而充当泵。

通过参考以下详细描述和附图，可实现对本公开的功能和有利方面的进一步理解。

附图说明

现在将参考附图仅通过示例的方式描述实施方案，在附图中：

图1说明通过涂覆有分析物特异性受体的磁性微粒从一定体积的液体样品中捕获目标分析物。

图2i、2ii、2iii、2iv和2v显示DMF装置的横截面侧视图(未按比例)，展示了本方法的步骤。

图3i、3ii、3iii、3iv和3v显示DMF装置的俯视图，展示了本方法的五个步骤。

图4显示探测从50μL、75μL和100μL体积的磷酸盐缓冲盐水中回收2.8μm、5μm和10μm磁性颗粒的回收率的测试结果，所述结果显示了针对每个条件的3个测试的平均百分比回收率和标准偏差。

图5是显示本文公开的标准DMF-ELISA法和预浓缩DMF-ELISA法的校准曲线的图。

图6显示具有亲水性条带的DMF装置，所述亲水性条带通向磁性微粒隔离位置。

具体实施方式

将参考下面论述的细节描述本公开的各种实施方案和方面。以下描述和附图是对本公开的说明，而不应被解释为限制本公开。附图未按比例绘制。许多具体细节被描述来提供对本公开的各种实施方案的透彻理解。然而，在某些情况下，没有描述公知的或常规细节以便提供对本公开的实施方案的简明论述。

如本文中所用，术语“包括”和“含有”应被解释为包含性和开放性的，而不是排他性的。具体而言，当在说明书和权利要求中使用时，术语“包含”和“含有”及其变形意指包括指定的特征、步骤或组件。这些术语不应被解释为排除其它特征、步骤或组件的存在。

如本文中所使用的，术语“示例性”意指“用作示例、实例或说明”，并且不应被解释为比本文公开的其它配置更优选或更具有优势。

如本文中所用，术语“约”和“大致”旨在涵盖可存在于值范围的上限和下限中的变化，诸如性质、参数和尺寸的变化。在一个非限制性实例中，术语“约”和“大致”表示加或减10％或更少。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

如本文中所用，短语“磁性-微米颗粒和纳米颗粒”是指包含用聚合物壳(诸如聚苯乙烯)包封的顺磁性氧化铁核心的颗粒，其直径范围为1-10微米并用捕获部分进行了功能化。该定义还描述了直径约为10-50纳米并用捕获部分进行了功能化的磁性纳米颗粒。

如下鉴定所示方法的组成部分：

标题和标记

1.液体样品的体积(含有具有结合的分析物的磁性颗粒)

2.体积较小的试剂液滴

3.涂覆有分析物特异性受体(和结合分析物)的磁性微粒

4.数字微流体装置

5.虚拟流体流动通道

6.驱动电极

7.出口位置

8.磁铁/磁场

9.保持位置

10.泵送机构

(与DMF设备相关)

11.顶板基底(玻璃)

12.顶板电极(氧化铟锡)

13.疏水涂层(Teflon，FluoroPel)

14.绝缘电介质(Parylene C)

15.储库(电极)

16.底板基底(玻璃)

(其它)

17.磁透镜

18.“顶板”

19.试剂的体积

20.分析物特异性受体

21.分析物

22.从储库延伸的亲水性条带

23.从出口延伸的亲水性条带

图1说明通过涂覆有分析物特异性受体20的磁性微粒3从一定体积的液体样品1中捕获目标分析物21。如可看到的，该方法包括在容器中提供磁性微粒3并向容器中添加大量液体样品1，由此样品中存在的任何分析物21与其与磁性颗粒结合的互补分析物特异性受体20结合。

如可从图2i至2v(包括两者)看到的，DMF装置4包括驱动电极6的模式，当以预选的模式激活时，其可用于界定从储库15(其具有其自己的一组电极)至出口位置7跨DMF装置4的虚拟流体流动通道5(图3ii)。具有透镜或场引导结构17的磁体8位于一个或多个预选的驱动电极6下方，以在预选的驱动电极6上方产生磁场。磁场的预选位置在一个或多个预选的驱动电极6上方沿着虚拟流体流动通道5界定了保持位置9，使得在磁场接合时，沿着流动通道5通过的任何磁性微粒3被磁场固定，同时样品的液体继续流动。

DMF装置4包括位于远离电极6的一个或多个预选位置7中的泵送机构10，使得沿着虚拟流动通道5流动的液体从DMF装置4被抽出到废物容器中。泵送机构10可以是有源泵诸如但不限于注射器、蠕动泵或真空泵或无源泵诸如，但不限于吸收性芯吸材料(滤纸或纸巾，作为两个非限制性实例)。

DMF装置4包括底板16和顶板18，其中底板16包含驱动电极6的模式和涂覆有绝缘介电层14的储库15的电极，绝缘介电层14被一层疏水材料13覆盖，并且其中顶板18包括具有对电极12的基底11，所述对电极12覆盖有一层疏水材料13。其它可能的实施方案(未示出)包括反转板的取向(底部具有“顶”板，反之亦然)，和/或两个板都覆盖有绝缘介电层，和/或两个板上具有多个模式化的驱动电极和对电极，和/或呈其中所有驱动电极和对电极都在单个底板上的“单板”模式。

图2i、2ii、2iii、2iv和2v显示DMF装置4的横截面侧视图(未按比例)，展示了该方法的五个步骤。在图2i中，将一定体积的含有具有与其结合的分析物21(图1)的磁性微粒3的液体样品1置于DMF装置4上的加载储库15处。

在图2ii中，通过激励(actuating)将一定体积的液体样品1与位于出口位置7处的泵送机构10连接的一系列驱动电极6以从DMF装置4中移除液体来形成虚拟流体流动通道5。同时被预先放置成在预选的驱动电极6下方对保持位置9施加磁场并且由此接合的磁体8，将涂覆有分析物特异性受体20的磁性颗粒3和结合的分析物21固定在保持位置9中。

在图2iii中，一定体积的液体1已被泵送机构10移除，在保持区9中留下涂覆有分析物特异性受体20的磁性颗粒3和结合的分析物21。

在图2iv中，将磁体8从DMF装置4移开，从而移除磁场，并且将较小体积的试剂2的液滴分配到保持位置9中的磁性微粒3上。

在图2v中，较小体积的试剂2的液滴与涂覆有分析物特异性受体20的磁性微粒3和结合的分析物21混合。

图3i、3ii、3iii、3iv和3v显示DMF装置4的俯视图，展示了该方法的五个步骤。

在图3i中，将一定体积的液体样品1置于顶板18外部的一个或多个储库15上，并且一部分体积的液体样品1被抽到顶板18下面。泵送机构10被置于顶板18下面并且与出口位置7相邻。

在图3ii中，通过激活将一定体积的液体样品1与位于出口位置7的泵送机构10连接的驱动电极6以从DMF装置4中移除液体来形成虚拟流体流动通道5。同时，被预先放置成在预选的驱动电极6下方对保持位置9施加磁场并且由此接合的磁体8，将涂覆有分析物特异性受体20的磁性颗粒3和结合的分析物21固定在保持位置9中。

在图3iii中，泵送机构10已经移除了一定体积的液体样品1，在保持位置9中留下了涂覆有分析物特异性受体20的磁性微粒3和结合的分析物21。

在图3iv中，试剂19(与试剂2相同但以较大体积存在于储库15中)被加载到储库15之一中，并且通过激励一系列预选的驱动电极6来分配较小的试剂液滴2。

在图3v中，通过激励预选的驱动电极6，将较小的试剂液滴2与涂覆有分析物特异性受体20的磁性微粒3和结合的分析物21混合，从而引起混合。

结果

在初步测试中，使用所述方法处理100μL以1.04x>7个颗粒/mL的密度含有磁性微粒的溶液。将固定的磁性颗粒重悬于约1.8μL的缓冲溶液中。所得密度经测量为4.75±0.37x>8个颗粒/mL，浓缩系数约为45倍。理论上，通过该所述方法应当可获得100倍或更高的浓缩系数，这仅取决于可以添加到储库中的液体体积。

可选择吸收性芯吸材料以控制虚拟通道的流速。芯吸的材料和几何形状都会影响流速。在使用虚拟通道和吸收性芯吸在DMF装置上处理75μL溶液的测试中，材料(诸如10mmx 10mm Whatman No.1滤纸的双重堆叠)在60秒内吸收75μL，而更具吸收性的材料(例如双层10mm x 10mm SureWick G028玻璃纤维的双重堆叠)在7秒内吸收相同的体积。

在本方法的替代实施方案中，可使用其中驱动电极和对电极共面的单板DMF装置。单板装置与双板装置的不同之处在于如何施加电压。不是将驱动电压施加到底板并将接地电压施加到顶板，而是将驱动电压和接地电压都施加到底板上的相邻电极。在该实施方案中，预浓缩程序保持与如上所述的浓缩程序相同。

本方法的另一个实施方案依赖于在顶板上使用具有亲水模式的双板DMF装置。这在图6中进行了说明。在该实施方案中，一个亲水条带22从储库朝向在DMF装置上磁性微粒将被隔离的预先指定的位置延伸。第二亲水性条带23从出口朝向相同的预先指定的位置延伸，使得在两条亲水性条带之间存在间隙，该间隙小于在发生隔离的位置处底板上的底层驱动电极的长度。在装载液体体积样品后，其被第一亲水性条带一路芯吸至预先指定的位置。通过在预先指定的位置向驱动电极施加电压，液体样品被桥接到第二亲水条带并被无源泵吸收。

将在DMF上预浓缩磁性颗粒的方法应用于不同的样品液体，包括磷酸盐缓冲盐水、唾液和尿液。在所有情况下，该方法能够移除上清液并浓缩颗粒。图4中显示了探测从50μL、75μL和100μL体积的磷酸盐缓冲盐水中回收2.8μm、5μm和10μm磁性颗粒的回收率的进一步测试的结果。在该测试中，将2μL体积的密度为9.00x>7个至1.84x>8个磁性颗粒添加到一定体积的磷酸盐缓冲盐水中。然后使用本文所述的预浓缩方法浓缩颗粒，并计数回收的颗粒。图4提供针对每个条件的3次测试的平均百分比回收率和标准偏差。

颗粒的预浓缩可用于改善捕获测定诸如免疫测定或核酸杂交测定的灵敏度。使用常规DMF-ELISA方案和通过添加预浓缩法改进的方案在芯片上进行恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)乳酸脱氢酶(LDH)的DMF酶联免疫吸附测定(ELISA)。将常规DMF-ELISA作为比较来运行，其中将2.4μL体积的用抗PfLDH抗体功能化的磁性颗粒(6.7x>8个颗粒/mL)分配在DMF装置上。固定颗粒并移除上清液。然后将颗粒与2.4μL磷酸盐缓冲盐水和抗原PfLDH一起孵育。在由DMF电极混合下将混合物孵育5分钟。然后将颗粒进行标准DMF-ELISA方案：洗涤，与缀合有酶的抗体标记一起孵育，进一步洗涤，与化学发光酶底物(鲁米诺和H₂O₂)一起孵育，以及用光电倍增管测量化学发光。对于预浓缩方法，将2.4μL体积的用抗PfLDH抗体功能化的磁性颗粒添加到含有75μL磷酸盐缓冲盐水和抗原PfLDH的微量离心管中。将混合物在室温下旋转孵育3小时，然后使用此处所述的预浓缩方法在DMF装置上进行处理。由于颗粒浓度要降低至1/30，因此预浓缩方法需要更长的孵育时间。然后将颗粒经历标准DMF-ELISA方案。将针对浓度为7ng/mL和70ng/mL的PfLDH的预浓缩DMF-ELISA的信号与常规DMF-ELISA的信号比较的结果示于图5中。观察到高达30倍的信号增加。

讨论

通过DMF进行基于磁性颗粒的捕获生物测定的方法涉及将涂覆有捕获剂的磁性微粒与样品在DMF装置上混合。该常规方法包括分配一定体积的磁性颗粒，移除上清液，分配相似大小体积的样品并将样品液滴与磁性微粒混合。可捕获的靶分析物的量限于一定体积的样品中存在的量，并且这些体积通常为约50nL至5μL。这可足以检测样品中的一定范围的目标分析物浓度，但不足以检测低于分析检测器的检测限的分析物浓度。

为了克服样品中分析物不足的挑战，可以使用更大的体积，从而捕获更多的分析物。这证明难以使用上述常规DMF方法处理，因为一次可处理的最大体积受DMF装置的尺寸限制。这可以通过将磁性颗粒与样品液滴重复混合，通过磁体从颗粒中移除样品并与另一个液滴重复孵育来避免。该重复过程非常耗时，效率低并且需要多个步骤。

在DMF设备上处理大量样品的另一种方法是产生由一系列驱动电极界定的并由泵驱动的虚拟通道，并使用该通道使更大量的样品流过已被磁场固定在装置上的磁性颗粒。虽然该方法允许处理更大量的样品，但固定的颗粒簇聚在磁场内，并且颗粒的有限表面暴露于样品，从而减少了结合的分析物的量。这是低效的，因为磁性颗粒上的许多可用结合位点埋藏在凝块内并且不暴露于样品。

本文公开的本方法通过将磁性微粒与片外(off-chip)样品一起孵育，然后使用DMF装置上的虚拟通道和磁体的组合浓缩从较大的液体样品中捕获的分析物，克服了利用磁性微粒处理大量样品以进行生物测定的问题。可通过该方法处理的样品的体积约为通常通过DMF处理的体积的50倍至1000倍，并且将分析物浓缩成适于通过DMF装置进一步处理的较小体积。

另外，当驱动装置上的虚拟通道的泵送机构是无源泵，诸如吸收性芯吸材料如滤纸或纸巾时，消除了对复杂的有源泵和管道的需求。这种简化甚至允许将无源泵预先加载在DMF装置上。

虽然已经关于增加可能以难以检测的低浓度存在的目标分析物的浓度描述了上文示例的本方法，但是应当理解，本方法也可用于筛选出或移除被认为是干扰物的分析物，所述分析物，当以高浓度存在时，掩盖了需要检测的分析物的存在。在该实施方案中，将从涂覆有分析物特异性受体的磁性微粒和结合的分析物中移除的液体样品的体积保留在容器中，并可将其重新引入至DMF装置以进行进一步处理和分析，或递送至另一个系统以进行分析。

参考文献

1.K.Aguilar-Arteaga，J.A.Rodriguez and E.Barrado，Analytica ChimicaActa，2010，674，157-165.

2.K.Choi，A.H.C.Ng，R.Fobel and A.R.Wheeler，in Annual Review ofAnalytical Chemistry，Vol.5，eds.R.G.Cooks and E.S.Yeung，Annual Reviews，PaloAlto，2012，vol.5，pp.413-440.

3.K.Choi，A.H.C.Ng，R.Fobel，D.A.Chang-Yen，L.E.Yarnell，E.L.Pearson，C.M.Oleksak，A.T.Fischer，R.P.Luoma，J.M.Robinson，J.Audet and A.R.Wheeler，Analytical Chemistry，2013，85，9638-9646.

4.N.M.Lafreniere，J.M.Mudrik，A.H.C.Ng，B.Seale，N.Spooner andA.R.Wheeler，Analytical Chemistry，2015，87，3902-3910.

5.N.S.Mei，B.Seale，A.H.C.Ng，A.R.Wheeler and R.Oleschuk，AnalyticalChemistry，2014，86，8466-8472.

6.A.H.C.Ng，K.Choi，R.P.Luoma，J.M.Robinson and A.R.Wheeler，AnalyticalChemistry，2012，84，8805-8812.

7.A.H.C.Ng，M.Lee，K.Choi，A.T.Fischer，J.M.Robinson and A.R.Wheeler，Clinical Chemistry，2015，61，420-429.

8.M.H.Shamsi，K.Choi，A.H.C.Ng and A.R.Wheeler，Lab on a Chip，2014，14，547-554.