黏附素蛋白Apd及其在制备副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒中的应用

摘要

本发明公开了一种黏附素蛋白Apd及其在制备副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒中的应用。本发明证实黏附素蛋白Apd位于副猪嗜血杆菌的外膜，在已知的15个血清型中都有表达，但在猪的其他细菌性病原没有该蛋白，用其作为诊断抗原具有高的敏感性和特异性。优化重组黏附素蛋白的表达和纯化的方法，获得了免疫原性和反应原性良好的重组蛋白。优化以重组黏附素蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的组份与用量、反应条件、结果判定标准，制备了副猪嗜血杆菌的间接ELISA抗体检测试剂盒。动物试验证实了该试剂盒可用于副猪嗜血杆菌疫苗免疫和细菌感染后的抗体检测。在副猪嗜血杆菌病的综合防控和血清流行病学调查中，该试剂盒将具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和动物传染病领域，具体涉及一种黏附素蛋 白Apd及其在制备副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒中的应 用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的常 在菌，属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，为细小的球状、球杆状到长丝状 革兰氏阴性菌。在猪免疫力低下或受到应激时HPS可引起猪发生副 猪嗜血杆菌病(又称格拉瑟氏病)。HPS的急性感染可导致多发性浆膜 炎、关节炎和脑膜炎，败血症和死亡；慢性感染可引起化脓性鼻气管 炎和肺炎。HPS通常会与大肠杆菌、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌混合 感染，使疾病复杂化。该病在世界上养猪的国家和地区都有发生和流 行，在断奶仔猪中可导致30％的死亡率。由于我国猪的免疫抑制性疾 病多发，副猪嗜血杆菌病的发生和流行尤其严重。在副猪嗜血杆菌病 的血清学诊断、疫苗免疫后的抗体监测以及血清流行病学调查中，一 种特异、敏感的抗体检测方法必不可少。

细菌性病原的抗体检测方法通常难以建立，尤其是HPS有15个 血清型和27％的不能分型的菌株(Oliveira et al.,2003)。平板凝集试 验虽简单易行，可以用菌体悬液作为凝集抗原，但该方法特异性和敏 感性低，而且受凝集抗原血清型的限制，即特定血清型的抗原只能对 相应血清型的抗体做出检测。以菌体作为包被抗原进行间接ELISA， 又因为细菌的结构和组成复杂、抗原种类和数量多，包被抗原通常会 与被检血清中其他细菌类似成份的抗体发生交叉反应，导致假阳性。

早期的HPS抗体检测方法有补体结合试验、间接血凝试验和 ELISA(Oliveira etal.,2004)。补体结合试验需要绵羊红细胞和豚鼠 补体，因这些材料不易即时获得和制备，而且实验操作繁琐，现在很 少使用。间接血凝的致敏抗原和ELISA的包被抗原有两种，细菌超 声波破碎后的上清(多糖和蛋白)，或者热酚水法提取的LPS。以这 两种抗原成分建立的间接血凝和ELISA抗体检测方法非但不稳定， 还容易出现假阴性，对获得免疫保护的猪血清进行检测也会如此 (Oliveira et al.,2004)。

近年来国内有使用HPS的寡肽通透酶(OppA)(车勇良等，2015)、 细胞膨胀致死毒素(CDT)(刘双红，2016)和外膜蛋白(OMP2， OMP5)(贾爱卿等，2011)等大肠杆菌表达的蛋白作为诊断抗原建立 HPS间接ELISA的抗体检测方法。国内市场也已有荷兰BioChek公 司的副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其以寡肽通透酶 (OppA)作为诊断抗原。但因为寡肽通透酶基因在HPS、大肠杆菌、 伤寒沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中高度保守(98％核苷酸一致性)， 细胞膨胀致死毒素在大肠杆菌中有结构和功能相似的同源蛋白(44％ 氨基酸一致性)，而外膜蛋白OMP2，OMP5在胸膜肺炎放线杆菌中 也有同源的蛋白(42％和71％氨基酸一致性)。所以此类抗体检测方 法或试剂盒会不可避免地与具有相似抗原成分的病原发生交叉反应， 导致假阳性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种黏附素蛋白 (Aida passengerdomain，Apd)及其在制备副猪嗜血杆菌ELISA抗 体检测试剂盒中的应用。由于黏附素蛋白Apd是副猪嗜血杆菌所特 有的一种蛋白，在猪的其他相关细菌性病原中都不存在。小鼠的免疫 试验和免疫印迹证实了重组Apd蛋白具有良好的免疫原性和反应原 性。而且重组Apd蛋白可以与13个血清型菌株的抗血清反应，其抗 血清可以与15个血清型细菌反应，表明以Apd作为诊断抗原不会受 血清型不同的限制。以重组Apd蛋白作为包被抗原的副猪嗜血杆菌 ELISA抗体检测试剂盒，从副猪嗜血杆菌灭活疫苗免疫和活菌感染的 猪血清中都可检测出其抗体，而且抗体的阳性率与猪的攻毒保护率相 关。该试剂盒在副猪嗜血杆菌的血清学诊断、疫苗免疫效果的评价以 及血清流行病学调查中将具有广阔的应用前景。

为实现上述目的，本发明设计了一种黏附素蛋白Apd，其氨基酸 序列的特征为：

(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在90～100％ 编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个 或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白；

编码上述黏附素的基因apd，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种用于获得上述黏附素基因apd的引物对，所 述引物对为:

P1，5’-CGGAATTC(EcoRI)GGAAACTTATATTGTTACTGGTGAA-3’，

P2，5’-CCCTCGAG(XhoI)GGTGATTGTGATTTTATTGTGGT-3’。

本发明还提供了一种重组质粒pET-Apd，所述重组表达载体为含 有权利要求3所述黏附素基因apd的表达载体，其中，所述表达载体 为pET-25b。

本发明还提供了一种上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细 胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种重组黏附素蛋白Apd的制备方法：包括以 下步骤：

(1)将含有重组质粒pET-Apd的大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)，培养过夜，培养菌液离心，沉淀用缓冲液重悬，得到悬浮 菌液；

(2)在低温条件下对悬浮菌液进行菌体破碎，离心收集上清， 对上清进行纯化，得到重组黏附素蛋白rApd。

本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒， 包括黏附素包被的酶标板、样品稀释液、阴阳性对照血清、20倍浓 缩洗涤液、酶标二抗、显色液A、显色液B、终止液；

所述制备黏附素蛋白包被的酶标板：其制备方法如下：以纯化的 rApd蛋白作为包被抗原，以碳酸盐缓冲液将rApd稀释至0.5μg/mL， 4℃包被过夜，以含0.05g/mL脱脂乳的PBS缓冲液(pH7.4)在37℃ 封闭2h。

所述样品稀释液：PBS缓冲液(pH7.4)50mL，牛血清白蛋白0.25g， Tween-20 25μL；

所述阳性对照血清：制备方法如下：1月龄健康仔猪用副猪嗜血 杆菌免疫两次，二免后两周采血收集血清，检测其OD₆₃₀值在1.00->

所述阴性对照血清：在阳性对照血清制备时同等条件下饲养的健 康猪血清，检测其OD₆₃₀值在0.15-0.25之间的血清，取4份混合，>

所述20倍浓缩洗涤液：NaCl 160.00g，KCl 4.00g， Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄4.80g，溶于900mL去离子水中，>

所述酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗，购于武汉安 特捷生物技术有限公司(进口分装)，用样品稀释液做1:15000稀释；

所述显色液A：Na₂HPO₄·12H₂O>

所述显色液B：四甲基联苯胺(TMB)0.02g、无水乙醇10.00ml， 加去离子水溶解并定容至1000ml；所述终止液：10mL的去离子水 中加入25μL氢氟酸。

上述试剂盒检测副猪嗜血杆菌抗体的方法，包括以下步骤：

(1)用样品稀释液将待检血清做1:200稀释，每份样品取100μL 加入酶标板，同时取阴阳性对照血清100μL也加入酶标板；37℃温箱 作用45min后弃掉，用去离子水将20倍浓缩洗涤液做1:19稀释后每 孔加入200μL，静置5min，弃掉拍干，洗涤3次；

(2)每孔加入酶标二抗100μL，于37℃作用30min后弃掉，每 孔加入200μL洗涤液，静置5min，弃掉拍干，洗涤3次；

(3)每孔加入50μL底物液A，再加入50μL底物液B，混匀后 室温避光15min显色，最后加入50μL终止液，10min内在酶标仪上 测定波长630nm的OD值；

(4)结果判定：待检血清S/N≥2.60时，判定为阳性；S/N<2.6， 判定为阴性。S代表待检血清OD₆₃₀值，N代表阴性对照血清OD₆₃₀值，试验成立的条件是阴阳性对照血清OD₆₃₀差值大于或等于0.5，>

本发明的有益效果：

本发明所公开的黏附素蛋白为副猪嗜血杆菌所特有，所公开的抗 体检测试剂盒可以对副猪嗜血杆菌疫苗免疫或病原感染后的抗体做 出检测，不存在与其他相关细菌性病原的交叉反应，也不会受到副猪 嗜血杆菌不同血清型的限制。

附图说明

图1为三种重组蛋白的大肠杆菌表达检测图；

图2为三种重组蛋白的纯化图；

图3为三种重组蛋白检测副猪嗜血杆菌阴阳性血清结果图；

图4为重组黏附素蛋白的反应原性检测图；

图5为黏附素蛋白在副猪嗜血杆菌中的定位检测图；

图6为重组黏附素蛋白免疫小鼠的血清效价图；

图7为用重组粘附素蛋白抗血清通过Western blot检测15个血清 型副猪嗜血杆菌结果图；

图8为用15个血清型副猪嗜血杆菌抗血清通过Western blot检测 重组黏附素蛋白结果图；

图9为ELISA反应条件优化后检测阴阳性血清结果图；

图10为副猪嗜血杆菌破碎后上清检测阴阳性血清结果图；

图11为副猪嗜血杆菌菌体检测阴阳性血清结果图；

图12为试剂盒检测疫苗免疫和细菌感染后猪血清结果图；

图13为试剂盒检测疫苗免疫和细菌感染后抗体消长规律结果 图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便 本领域技术人员理解。

实施例1黏附素基因apd的合成或克隆

(1)黏附素基因apd的合成

按照核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，合成得到基因apd。

(2)黏附素基因apd的克隆

以副猪嗜血杆菌分离株CF7066(由华中农业大学徐晓娟老师保 藏)基因组设计引物对：

P1，5’-CGGAATTC(EcoRI)GGAAACTTATATTGTTACTGGTGAA-3’，

P2，5’-CCCTCGAG(Xho>

以副猪嗜血杆菌分离株CF7066基因组为模板，进行PCR扩增， PCR体系如下：31.5μL去离子水，5μL 10×Pyrobest BufferⅡ，4μL dNTP Mixture(2.5mM)，2μL P1(10μM/L)，2μL P2(10μM/L)， 0.5μL Pyrobest DNA Polymerase(Takara)，5μL副猪嗜血杆菌基因组 DNA(150ng/μL)；PCR反应程序：94℃预变性5min，进入循环， 94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃ 延伸10min，4℃保存，得到PCR产物；PCR产物测序，其苷酸序列 如SEQ ID No.1所示，将其命名为“基因apd”。

实施例2黏附素蛋白的制备

(1)黏附素基因的获得

本发明通过DNA合成获得1577个核苷酸的DNA片段；或者通 过实施例1所述的PCR引物、体系和反应程序，从副猪嗜血杆菌分 离株CF7066中扩增获得1577bp的DNA片段。该DNA片段命名为 apd，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

(2)黏附素表达质粒的构建

用去离子水溶解合成的DNA片段；或回收PCR扩增片段。将 DNA片段和载体pET-25b(Novagen)用EcoR I、Xho I双酶切，回 收酶切产物和载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃培养 过夜至长出单菌落。挑取单个克隆提取质粒，将测序正确的pET-Apd 质粒保存于-20℃备用。

(3)黏附素蛋白的表达

将质粒pET-Apd转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，37℃培 养过夜。挑取单菌落于5mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养过 夜。按1:100比例转接于1000mL的LB液体培养基中，37℃震荡培 养至OD₆₀₀约0.6，然后加入IPTG至终浓度为0.8mM，在37℃中震>

所述IPTG(0.8M)：在8mL蒸馏水中溶解2g IPTG，定容至10mL， 用0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存。

(4)黏附素蛋白的纯化

收获破碎后的菌体上清，用GE Healthcare公司的Ni Sepharose 6 Fast Flow填料(该填料保存于20％无水乙醇中)对破碎后的菌体上 清进行纯化，得到重组粘附素蛋白rApd，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，

所述的纯化流程如下：

装柱：盖上纯化柱下端的盖子，取2mL填料沿着层析柱壁缓慢 加入，避免产生气泡并尽量保持填料均匀分布，4℃正立静置过夜；

平衡：打开纯化柱下端的盖子，使柱内液体自然流出。加入 10～20mL的蒸馏水洗去填料保存时的乙醇，待液体流出后加入20mL 500mM咪唑缓冲液洗涤镍离子填充柱(新填充料可省去此操作)，再 待液体流出后加入10～20mL结合缓冲液平衡已填装好的镍离子填充 柱；

上样：待液体完全流出后，将冰上放置的破碎后的菌体上清 80～100mL分次缓慢加至纯化柱中。

洗涤：蛋白样品完成装柱后，加入10～20mL结合缓冲液平衡， 再用20mL洗涤缓冲液洗去杂蛋白。

洗脱：分次缓慢加入10mL洗脱缓冲液洗下目的蛋白样，用 1.5mL EP管收集，用BCA试剂盒(Biosharp公司)测定蛋白浓度 后置于-80℃保存。该纯化蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。

所述结合缓冲液：NaCl 29.22g，Tris-base 2.42g，咪唑0.34g， 溶于800mL去离子水中，用浓盐酸调pH至7.4，定溶至1L，0.22μm 滤器过滤，4℃保存备用。

所述洗涤缓冲液：NaCl 29.22g，Tris-base 2.42g，咪唑1.36g， 溶于800mL去离子水中，用浓盐酸调pH至7.4，定溶至1L，0.22μm 滤器过滤，4℃保存备用。

所述洗脱缓冲液：NaCl 29.22g，Tris-base 2.42g，咪唑6.8g，溶 于800mL去离子水中，用浓盐酸调pH至7.4，定溶至1L，0.22μm 滤器过滤，4℃保存备用。

所述500mM咪唑缓冲液：称取NaCl 29.22g，Tris-base 2.42g， 咪唑34.04g，溶于800mL去离子水中，用浓盐酸调pH至7.4，定溶 至1L，0.22μm滤器过滤，4℃保存备用

所述20％乙醇：200mL无水乙醇溶于800mL去离子水中，0.22μm 滤器过滤，4℃保存备用。

实施例3重组黏附素蛋白作为副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体 检测试剂盒包被抗原的评价

(1)副猪嗜血杆菌三种重组蛋白的表达

选择副猪嗜血杆菌的3个外膜蛋白的胞外区并构建其原核表达 质粒pET-Ag2、pET-Ag3和pET-Apd。用3个质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，在不同温度和不同浓度IPTG条件下诱导不同时间，确定目 的蛋白发生可溶性表达的最适条件。结果表明，rAg2(recombinant Ag2)蛋白的最适表达条件为16℃，0.2mM的IPTG诱导12h；rAg3(recombinant Ag3)蛋白为16℃，0.2mM的IPTG诱导12h；rApd (recombinant Apd)蛋白的最适表达条件为37℃，0.8mM的IPTG诱 导4h(图1)。

(2)副猪嗜血杆菌三种重组蛋白的纯化

用低温超高压细胞破碎仪破碎诱导后的大肠杆菌，离心取上清， 通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白，分别以5mM～300mM的咪唑浓度 对蛋白进行洗脱。最终确定rAg2洗涤缓冲液含50mM咪唑，洗脱缓 冲液含150mM咪唑；r Ag3洗涤缓冲液含20mM咪唑，洗脱缓冲液 含150mM咪唑；rApd洗涤缓冲液含20mM咪唑，洗脱缓冲液含 100mM咪唑。得到纯化蛋白后，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得 rAg2蛋白浓度为706μg/mL，rAg3蛋白浓度为325μg/mL，rApd蛋白 浓度为450μg/mL，对纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳(图2)。

(3)三种重组蛋白检测副猪嗜血杆菌阴阳性血清

将表达纯化的三种重组蛋白稀释至1μg/mL包被酶标板，副猪嗜 血杆菌的阴阳性猪血清各4份做1:100稀释，按照常规程序进行间接 ELISA。结果表明，rApd蛋白包被时，阴性血清OD₆₃₀平均值是0.297，>630平均值是2.201(P<0.001)，两者差异极显著；而rAg2>630值都分散在1.0～2.0的>

(4)重组黏附素蛋白的反应原性

将pET-Apd转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，诱导并纯化 后获得的重组粘附素蛋白，用鼠源的His单抗、副猪嗜血杆菌阴阳性 猪血清进行Western blot。由于rApd在大肠杆菌中表达时融合了His 标签，使用His单抗检测时在85kDa处出现反应带，副猪嗜血杆菌的 阳性血清也在85kDa大小处出现检测带，而阴性血清没有，以空载 体转化BL21(DE3)后的提取物中也未检测到反应带(图4)。该结 果表明表达纯化的rApd可以与副猪嗜血杆菌的猪源抗体发生反应， 证实其具有良好的反应原性。

(5)黏附素蛋白在副猪嗜血杆菌中的定位

副猪嗜血杆菌对数后期培养菌液1000mL，于4℃3200g离心 15min，弃上清。用60mL50mM Tis-HCl(pH7.2)重悬细菌沉淀，加 入300μl蛋白酶抑制剂PMSF(10mg/mL)，超声波破碎，每次25s， 间隔1min。直至菌液变清亮。于3200g离心15min，取上清与冰上预 冷的0.1MNa₂CO₃(pH11)按照1:100的比例混匀，4℃搅拌1h。溶>4)₂SO₄于>

(6)重组粘附素蛋白的抗血清Western blot检测15个血清型副 猪嗜血杆菌

用纯化rApd蛋白免疫4只BALB/c小鼠制备抗血清。免疫三次 后采血分离血清，以rApd包被的酶标板检测其效价，所有小鼠的血 清效价都达到1:204800(图6)。将15个血清型标准菌株和分离株 CF7066的培养物经SDS-PAGE电泳后转膜，用rApd蛋白的小鼠血 抗清进行免疫印记，结果所有菌株都出现了约85kDa反应带，而阴 性对照血清没有检测到反应带(图7)。可见，在HPS的15个血清型 标准菌株中，都存在可以与rApd抗血清发生反应的抗原成份，说明 rApd作为诊断抗原可用于检测副猪嗜血杆菌的15个血清型的抗体。

(7)15个血清型副猪嗜血杆菌抗血清Western blot检测重组 黏附素蛋白

制备副猪嗜血杆菌15种血清型标准菌株和分离株CF7066、以及 猪致病性大肠杆菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪 链球菌、猪支气管败血波氏杆菌的BALB/c小鼠抗血清。制备方法如 下：将细均匀涂布于TSA平板上培养过夜，用PBS(pH7.4)洗下， 将菌量调至10¹⁰CFU/mL，然后用同体积的弗氏佐剂乳化；每只小鼠>9CFU/mL)，免疫方式为颈背部皮下多点注射；>

实施例4副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒组份和用 量的选择以及反应条件的确定

(1)抗原包被浓度和酶标二抗工作浓度的确定

将rApd用包被液稀释至2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、 0.125μg/mL，酶标二抗用样品稀释液稀释至1:5000、1:10000、1:15000、 1:20000倍稀释。副猪嗜血杆菌的阳性和阴性血清用样品稀释液做 1:100稀释。结果显示，当抗原包被浓度为0.5μg/mL、二抗稀释度为 1:15000时，阳性和阴性血清OD₆₃₀的比值(P/N)最大，因此以0.5μg/mL>

表1.最佳抗原包被浓度和酶标二抗工作浓度的确定

(2)抗原包被条件的确定

以0.5μg/mL的抗原浓度包被酶标板，包被条件分别为：4℃包被 过夜、37℃包被1h后4℃包被过夜、37℃包被2h后4℃包被过夜、 37℃包被2h。结果表明，4℃包被过夜P/N值为12.097，比其它包被 条件的都高，故抗原最佳包被条件为4℃过夜(表2)。

表2.抗原最佳包被条件的确定

(3)血清稀释倍数和反应时间的确定

将阴阳性血清以1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，取100μL 加入到包被的酶标板，分别在37℃温箱中作用30min、45min、60min、 75min进行间接ELISA。结果显示，当血清以1:200倍稀释、反应时 间为45min时，P/N值最大，故待检血清最佳稀释倍数为1:200，最佳反应时间为45min(表3)。

表3.血清最佳稀释倍数和反应时间的确定

(4)封闭液的选择

蛋白包被后，采用不同的封闭液封闭。封闭液分别为：PBS缓冲 液含有0.1g/L脱脂乳，0.5g/L脱脂乳，0.05g/L BSA，0.2g/L BSA。 结果显示，当封闭液含有5g/L脱脂乳，P/N值最大，故最佳封闭液 为含有5g/L脱脂乳的PBS缓冲液(pH7.4)(表4)。

表4.最佳封闭液的确定

(5)封闭时间的确定

设置3个不同的封闭时间：37℃封闭1h、37℃封闭2h、37℃封 闭3h。每个封闭时间检测OD₆₃₀值，结果显示，当封闭时间为2h时，>

表5.最佳封闭时间的确定

(6)酶标二抗作用时间的确定

采用上述优化的ELISA反应条件，每孔加入100μL羊抗猪二抗， 在37℃温箱中分别作用30min、45min、60min、75min。结果显示， 二抗作用30min时，P/N值最大，故二抗最佳作用时间为30min(表 6)。

表6.酶标二抗最佳作用时间的确定

(7)底物显色时间的确定

采用上述优化的ELISA反应条件，加入底物液A和底物液B后， 分别于室温避光显色5min，10min，15min，20min。结果显示，当显 色15min时，P/N值最大，故底物最佳显色时间为15min(表7)。

表7.底物最佳显色时间的确定

(8)ELISA反应条件优化后检测阴阳性猪血清

用上述优化的rApd包被浓度、封闭液和封闭时间、待检血清的 稀释倍数、酶标二抗稀释浓度和作用时间以及底物显色时间，对副猪 嗜血杆菌阴阳性猪血清各15份进行检测。结果表明，条件优化后

ELISA检测结果的背景显著降低。阳性血清的从2.514下降为

1.438，阴性血清从1.400降为0.452，标准差也下降了0.14(图 9)，说明ELISA组份用量和反应条件的优化有效提高了试剂盒的检 测效果

实施例5副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒阳性临界 值判定

(1)临界值判定公式

间接ELISA阳性判定标准一般采用大量阴性样品的平均OD值 加上一倍或数倍阴性样品OD值的标准差，即所以，在间接ELISA操作的各项试验条件固定 后，阳性临界值的确定分三个步骤:①临界值计算公式中的n值； ②多份阴性样品的标准差，血清数量愈多则值更可靠；③实际检测 中的阴性对照值(吴保成，1994)。

(2)临界值中的n值测定

参照吴保成等(1994)使用的方法，n值的测定方法如下。取副 猪嗜血杆菌阳性和阴性血清各一份，从1:100开始进行倍比稀释至 1:204800，依次加入rApd包被的酶标板，每个稀释度各加8孔测定 每孔的OD₆₃₀值，并计算出每个稀释度阳性和阴性血清OD₆₃₀的平均值和对应的t值(表8)。对其进行统计分析可知，当稀释度为1:12800>(0.05,14)}，阴阳性血清样品的差异显著； 当稀释度继续增大时，阳小于阴，说明该方法已经不能区 分阴阳性血清。可见，稀释度为1:12800时，t值2.571即临界值中的 n值。该结果也表明待检血清做1:12800稀释时，该方法可以对阴阳 性血清做出检测，表明其敏感性很高。

表8.临界值中标准差倍数的确定

(3)副猪嗜血杆菌阴性血清筛选方法

将培养的副猪嗜血杆菌和菌体破碎离心后的上清，测定菌量和蛋 白浓度后倍比稀释包被酶标板，检测副猪嗜血杆菌阴阳性性猪血清各 一份。结果显示，当用破碎后的上清作为包被抗原时，阴性与阳性血>630值都偏高，P/N值在1～2之间(图9)；而用完整菌体作为包>630值的差值明显增大，P/N值大于2。尤>8CFU/mL时，P/N值为2.47，阳性血清>630值为1.153，阴性血清OD₆₃₀值为0.467(图10)。

(4)临界值中阴性血清标准差的测定

用0.5×10⁸CFU/mL副猪嗜血杆菌菌体悬液包被酶标板，通过间>630值小于0.467的判定为阴性血清。>

了检测，OD₆₃₀的平均值为0.189，标准差(SD)为0.118。

表9.检测40份副猪嗜血杆菌阴性血清的结果

(5)阳性临界值的判定

根据n值为2.571，40份阴性血清样品OD₆₃₀为0.189，标 准差(SD)为0.118，以及可得临界值＝0.492，即当OD₆₃₀≥0.492时，血清样品为阳性；当>630<0.492时，血清样品为阴性。

考虑到ELISA试剂盒制备过程中的批间差异和使用过程中的个 人操作的误差，本发明在严格制备和控制阴阳性对照血清的前提下， 阳性临界值判定依据S/N值(0.492/0.189＝2.60)，即待检血清S/N≥ 2.60时，判定为阳性；S/N<2.6，判定为阴性。S代表待检血清OD₆₃₀值，N代表阴性对照血清OD₆₃₀值，试验成立的条件是阴阳性对照血>630差值大于或等于0.5。

实施例6副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的组成和 制备

(1)重组黏附素蛋白Apd包被酶标板制备

将纯化的rApd蛋白用包被液稀释至浓度为0.5μg/mL，每孔 100μL加入酶标板中，4℃冰箱过夜；弃掉包被液，每孔加入200μL 洗涤液，静置5min，弃上清拍干，洗3次；

然后每孔加入200μL的封闭液，37℃温箱作用2h；弃掉封闭液， 每孔加入200μL洗涤液，静置5min，弃上清拍干，洗3次；冷冻干 燥，真空低温保存。

所述包被液：碳酸盐缓冲液(pH9.6)，Na₂CO₃>3>

所述洗涤液：100mL PBS缓冲液(pH7.4)中加入50μL Tween-20；

所述封闭液：含有5g/L脱脂乳的PBS缓冲液(pH7.4)。

(2)黏附素蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒组成

试剂盒含黏附素包被的96孔ELISA检测板2块，样品稀释液1 瓶(50mL/瓶)，阴阳性对照血清各1管(1.5mL/管)、20倍浓缩洗涤 液1瓶(30mL/瓶)，酶标二抗1瓶(20mL/瓶)，显色液A、显色液B、 终止液各1瓶(10mL/瓶)。

所述样品稀释液：PBS缓冲液(pH7.4)50mL，牛血清白蛋白0.25g， Tween-20 25μL；

所述阳性对照血清：制备方法如下：1月龄健康仔猪用副猪嗜血 杆菌免疫两次，二免后两周采血收集血清，检测其OD₆₃₀值在1.00->

所述阴性对照血清：在阳性对照血清制备时同等条件下饲养的健 康猪血清，检测其OD₆₃₀值在0.15-0.25之间的血清，取4份混合，>

所述20倍浓缩洗涤液：NaCl 160.00g，KCl 4.00g， Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄4.80g，溶于900mL去离子水中，>

所述酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗，购于武汉安 特捷生物技术有限公司(进口分装)，用样品稀释液做1:15000稀释；

所述显色液A：Na₂HPO₄·12H₂O>

所述显色液B：四甲基联苯胺(TMB)20.00mg、无水乙醇10ml， 加去离子水溶解并定容至1000ml；

所述终止液：10mL的去离子水中加入25μL氢氟酸。

(3)试剂盒的使用方法

用样品稀释液将待检血清样品做1:200稀释，每份样品取100μL 加入酶标板，同时取阴阳性对照血清100μL也加入酶标板；37℃温箱 作用45min后弃掉，用去离子水将20倍浓缩洗涤液做1:19稀释后每 孔加入200μL，静置5min，弃掉拍干，洗涤3次；

每孔加入酶标二抗100μL，于37℃作用30min后弃掉，每孔加 入200μL洗涤液，静置5min，弃掉拍干，洗涤3次；

每孔加入50μL底物液A，再加入50μL底物液B，混匀后室温 避光15min显色，最后加入50μL终止液，10min内在酶标仪上测定 波长630nm的OD值；

结果判定：待检血清S/N≥2.60时，判定为阳性；S/N<2.6， 判定为阴性。S代表待检血清OD₆₃₀值，N代表阴性对照血清OD₆₃₀值，试验成立的条件是阴阳性对照血清OD₆₃₀差值大于或等于0.5。

所述待检猪血清：猪静脉血分离血清。

实施例7副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的重复性

用同一批次包被的酶标板分别对副猪嗜血杆菌4份阳性血清和4 份阴性血清进行批内重复性实验。重复检测4次，其变异系数在 1.9％～9.5％之间；用不同批次包被的酶标板对同样的8份血清进行批 间重复性实验，其变异系数在1.4％～9.4％之间(表10)，表明本发明 的ELISA检测试剂盒有良好的重复性。

表10.批内重复和批间重复试验

实施例8副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的应用

(1)疫苗免疫和弱毒感染猪血清的检测

用该ELISA试剂盒检测了副猪嗜血杆菌疫苗免疫和弱毒株感染 的猪血清，其中疫苗免疫血清15份、弱毒株感染血清4份和PBS对 照血清20份，以S/N≥2.60作为阳性判定标准。结果表明，疫苗免 疫组的有93％(14/15)检测为阳性，弱毒株A感染组有100％(4/4) 为阳性，PBS对照组有75％(15/20)阴性(图12)。值得注意的是， PBS对照组有5份血清检测为抗体阳性，这可能缘于试验过程中猪发 生了内源性感染或交叉感染，因为副嗜血杆菌为常在菌，动物试验持 续了6周。然而，攻毒试验的结果有表明，PBS对照组的有8头未出 现临床症状，预示PBS猪可能存在事实上的感染和抗体的产生。总 之，上述结果表明该试剂盒可以检测出副猪嗜血杆菌疫苗免疫和活菌 感染后的血清抗体，可应用于副猪嗜血杆菌疫苗免疫保护效果的评价 和病原感染后的抗体检测。

(2)疫苗免疫和弱毒感染后抗体消长规律的评价

用该ELISA抗体检测试剂盒对实验感染猪进行了持续的抗体检 测。一月龄仔猪16头，分4组，每组4头，间隔两周免疫/感染两次， 分别进行灭活疫苗A免疫，基因缺失株B和C感染，以S/N≥2.60作 为阳性判定标准。结果表明，弱毒株B和C在感染后一周ELISA抗 体出现转为阳性，两周后持续上升；疫苗免疫组在二免后一周抗体显 著上升转为阳性。免疫后两周疫苗免疫和弱毒株感染组的抗体水平相 同，而PBS对照组的抗体检测持续为阴性(图13)。可见，该试剂盒 检测还可以对疫苗免疫和病原感染后的抗体产生规律进行评价。

(3)临床猪血清的检测

用该ELISA抗体试剂盒检测了3个猪场收集的222份血清，包 括哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪血清。结果表明，阳性检出率依 次为哺乳仔猪12％、保育猪16％、育肥猪36％、母猪68％，总阳性 检出率35％。用0.5×10⁸CFU/mL副猪嗜血杆菌包被的酶标板进行检>

表11.试剂盒和菌体ELISA检测临床血清

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明 做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实 施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施 例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 黏附素蛋白Apd及其在制备副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1577

<212> DNA

<213> 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)

<400> 1

cggaattcgg aaacttatat tgttactggt gaaaataaca atgtgcgcgg cgaacaattc 60

caacgtttac ttaaccaagc caaagatggc gatacaattc gcttagacgg agatactcaa 120

ttattgcgtg gaagtggttt tttcaatgtt gataaacaag taacaattga tggacaagga 180

aatcgcttac accttgaagg ttataatttg tccttaggac aagatgttac tttttcgaat 240

gtaaatttat ccttaaaacc tagtcgagat ttaaacaata tttttggttc tggatttaat 300

aatttaaaag cagcatctac ctatattgtg accaatggaa ataaattgat cttggataat 360

gttagaacga atgttaatgg tgaacctgca gatactcgcc caatgatttt acttggaaat 420

attgatccaa caaaaaataa taatggacac gatgctcttg tagtgacaaa tgctcaccca 480

acagaaacaa tattatcttc agtggttgtt ataggcaata acaattcaaa tactgacacc 540

ccagtaacga ttagtttagg ggaaaatgtc agctttgtta atcaggtaat atttgagaga 600

gaaggagaag aggatatata tagtggtgcg gtgtatctag ctggaatgaa taatgatcaa 660

gaacataaca gagctattaa tttctctagt tcatcaaatg ctatcactaa aatttatacg 720

ggagaagcta caaatgtttc tgttacgtta aataacatca atcctgaaac tgctatcact 780

ttacaagatg ttaaagattt aacattaaat aatagccgta ttactttgga taagaattta 840

tctgtttcag aaaccttaac tctgaataat caatccgcaa tcactacagt ggcgagtaaa 900

gatgcttttg gtgacatcgc taagactagt ttgatgttaa ataatatcca taccaatggt 960

aataatagta atatcactat cgttcgggac aatgctcttt tgattaatgg taatattact 1020

ggtgaattga ctattaatac agaagataaa gataataacg ttagtcttcc taatggcagc 1080

actttagtag gagaaaatgg cagctatgtt gtgaagctaa aaacagaagt aactcaacct 1140

gtatcagaaa atacaactac tgacagcagt aatactgatg taacccctgc taaacctacg 1200

gatagcacac cagcaacaac aggcgaacaa actggttcgt cagatacaac atcaccaaca 1260

aatacagctg caactagcaa tgaaactaca ccgcctgcta caacgggaga tacagcgact 1320

aacagcagta atactgatgt accccctgct acacctacgg atagcacacc agcaacaaca 1380

ggcgaacaaa ctggttcgtc agatataaca tcgccaacag atacagctca aacagacgat 1440

caagcggagg cttctagctc tgacactgca acatctacac cagcacaacc aacgggcgat 1500

gtagcttcaa caagtgaaca agcgacaacg tcgagtacat ctacaaacca caataaaatc 1560

acaatcaccc tcgaggg 1577

<210> 2

<211> 557

<212> PRT

<213> 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)

<400> 2

Met Asp Ile Gly Ile Asn Ser Asp Pro Asn Ser Glu Thr Tyr Ile Val

1 5 1015

Thr Gly Glu Asn Asn Asn Val Arg Gly Glu Gln Phe Gln Arg Leu Leu

202530

Asn Gln Ala Lys Asp Gly Asp Thr Ile Arg Leu Asp Gly Asp Thr Gln

354045

Leu Leu Arg Gly Ser Gly Phe Phe Asn Val Asp Lys Gln Val Thr Ile

505560

Asp Gly Gln Gly Asn Arg Leu His Leu Glu Gly Tyr Asn Leu Ser Leu

65707580

Gly Gln Asp Val Thr Phe Ser Asn Val Asn Leu Ser Leu Lys Pro Ser

859095

Arg Asp Leu Asn Asn Ile Phe Gly Ser Gly Phe Asn Asn Leu Lys Ala

100 105 110

Ala Ser Thr Tyr Ile Val Thr Asn Gly Asn Lys Leu Ile Leu Asp Asn

115 120 125

Val Arg Thr Asn Val Asn Gly Glu Pro Ala Asp Thr Arg Pro Met Ile

130 135 140

Leu Leu Gly Asn Ile Asp Pro Thr Lys Asn Asn Asn Gly His Asp Ala

145 150 155 160

Leu Val Val Thr Asn Ala His Pro Thr Glu Thr Ile Leu Ser Ser Val

165 170 175

Val Val Ile Gly Asn Asn Asn Ser Asn Thr Asp Thr Pro Val Thr Ile

180 185 190

Ser Leu Gly Glu Asn Val Ser Phe Val Asn Gln Val Ile Phe Glu Arg

195 200 205

Glu Gly Glu Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Ala Val Tyr Leu Ala Gly Met

210 215 220

Asn Asn Asp Gln Glu His Asn Arg Ala Ile Asn Phe Ser Ser Ser Ser

225 230 235 240

Asn Ala Ile Thr Lys Ile Tyr Thr Gly Glu Ala Thr Asn Val Ser Val

245 250 255

Thr Leu Asn Asn Ile Asn Pro Glu Thr Ala Ile Thr Leu Gln Asp Val

260 265 270

Lys Asp Leu Thr Leu Asn Asn Ser Arg Ile Thr Leu Asp Lys Asn Leu

275 280 285

Ser Val Ser Glu Thr Leu Thr Leu Asn Asn Gln Ser Ala Ile Thr Thr

290 295 300

Val Ala Ser Lys Asp Ala Phe Gly Asp Ile Ala Lys Thr Ser Leu Met

305 310 315 320

Leu Asn Asn Ile His Thr Asn Gly Asn Asn Ser Asn Ile Thr Ile Val

325 330 335

Arg Asp Asn Ala Leu Leu Ile Asn Gly Asn Ile Thr Gly Glu Leu Thr

340 345 350

Ile Asn Thr Glu Asp Lys Asp Asn Asn Val Ser Leu Pro Asn Gly Ser

355 360 365

Thr Leu Val Gly Glu Asn Gly Ser Tyr Val Val Lys Leu Lys Thr Glu

370 375 380

Val Thr Gln Pro Val Ser Glu Asn Thr Thr Thr Asp Ser Ser Asn Thr

385 390 395 400

Asp Val Thr Pro Ala Lys Pro Thr Asp Ser Thr Pro Ala Thr Thr Gly

405 410 415

Glu Gln Thr Gly Ser Ser Asp Thr Thr Ser Pro Thr Asn Thr Ala Ala

420 425 430

Thr Ser Asn Glu Thr Thr Pro Pro Ala Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr

435 440 445

Asn Ser Ser Asn Thr Asp Val Pro Pro Ala Thr Pro Thr Asp Ser Thr

450 455 460

Pro Ala Thr Thr Gly Glu Gln Thr Gly Ser Ser Asp Ile Thr Ser Pro

465 470 475 480

Thr Asp Thr Ala Gln Thr Asp Asp Gln Ala Glu Ala Ser Ser Ser Asp

485 490 495

Thr Ala Thr Ser Thr Pro Ala Gln Pro Thr Gly Asp Val Ala Ser Thr

500 505 510

Ser Glu Gln Ala Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Asn His Asn Lys Ile

515 520 525

Thr Ile Thr Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ser Gln Pro Glu Leu Ala Pro

530 535 540

Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu His His His His His His

545 550 555