蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44

摘要

本发明公开了蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，以及扩增它的专用引物和检测该基因在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达方法及其特异引物。该基因在蔗茅野生种受低温胁迫下表达量持久上升，在甘蔗栽培品种(系)均无明显表达，表明该基因直接参与了低温胁迫响应。本发明为认识该基因的抗逆机制，以及利用蔗茅野生种作为甘蔗耐寒新品种开发的重要资源提供了技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及低温胁迫下蔗茅野生种的基因EfNAC44，以及该基因的专用引物，通过RT-qPCR对该基因在强弱蔗茅野生种、栽培种差异表达的方法。

背景技术

蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)源于热带、亚热带和温带区域，是甘蔗属内的野生种之一，在中国境内分布极广，拥有较强的抗旱、抗寒和耐瘠能力。蔗茅在气候寒冷的高海拔地区也能正常生长，在其他恶劣的环境下也可发现有蔗茅的生长。蔗茅还拥有其余甘蔗近缘野生种所不具备的特性，成熟早，种子成熟率高，优良的花粉发育，体细胞染色体数目最少，不单单适合常规育种，也在分子育种方面占有优势，蔗茅茎秆中糖分含量也较高，在甘蔗育种中具有重大的价值。蔗茅中富含丰富的抗逆基因，能为甘蔗品种改良和耐逆境育种提供优良的基因源。(徐超华，李纯佳，陆鑫等.甘蔗近缘种蔗茅光合气体交换特性的差异分析[J].中国农业科学，2016,49(15):2909-2920.李富生，林位夫，何顺长.开发利用蔗茅野生种质资源的思考[J].生物资源,2004,20(4):266-270.田春艳，王先宏，李富生等.甘蔗野生种蔗茅的形态多样性分析[J].中国农学通报，2015,31(15):97-102.陆鑫，苏火生，林秀琴等.甘蔗野生种滇蔗茅种质创新利用研究[J].湖南农业大学学报，2012,38(2):121-124.)因此，在甘蔗耐寒育种中，挖掘蔗茅野生种中新的耐寒基因具有重要意义。

NAC转录因子是近年来发现的新转录因子，成员众多，组建了巨大的转录因子家族。NAC有着典型和非典型之分，典型是N端含有151-159个氨基酸残基并且高度保守，C端转录调控区的模体在亚组内保守性较高，非典型NAC转录因子仅仅是一个或者两个串联的结构域。研究表明NAC基因除了在抗旱、耐盐胁迫反应起作用外，在低温胁迫反应中同样可以起到调控作用：NAC基因通过调节耐寒相关基因的表达，通过调控耐寒相关基因的表达量来进一步调控植物耐寒性。(韩雅彭，程琳，杨凌霄等.茶树NAC转录因子家族的鉴定及生物信息学分析[J].河南大学学报，2017,47(3):301-309.周鸿慧，黄红，徐彬磊等.NAC转录因子在植物对生物和非生物胁迫响应中的功能[J].植物生理学报2017,53(8):1372-1382.段俊枝，李莹，赵明忠等.NAC转录因子在植物非生物胁迫基因工程中的应用进展[J].作物杂志，2017,(2):14-22.)

前人对于甘蔗研究较为深入，但主要局限于生理生化上的研究，对于甘蔗基因组的研究较少，NCBI数据库中甘蔗的遗传信息数据也十分有限，尤其关于蔗茅野生种耐寒有关的NAC基因更是未见报道。

发明内容

本发明目的是从分子育种角度为解决近年来甘蔗受冻害等严重技术问题，提高甘蔗栽培种的耐寒性提供一个受低温诱导后能够快速表达的蔗茅类基因EfNAC44，并且提供该基因的扩增引物，以及检测该基因在蔗茅野生种的差异表达的方法，进一步为甘蔗耐寒育种奠定基础并提供候选基因。

本研究从低温胁迫条件下的蔗茅野生种利用电子克隆技术获得一个NAC基因，通过NCBI数据库比对分析，发现该基因序列与已知基因序列相似比达96％，推测该基因编码蛋白为NAC转录因子，故将该基因命名为蔗茅类基因EfNAC44。

本发明的技术方案如下：

1.蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，其全长核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

2.扩增技术方案1所述的蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44的专用引物，所述专用引物由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种检测技术方案1所述的蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达方法，包括低温胁迫处理，总RNA的提取，cDNA第一链的合成，相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况，其特征在于：

在相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况中，使用特异引物分别检测蔗茅类基因EfNAC44在对照样品和处理样品中差异表达，所述特异引物由上游引物QF和下游引物QR组成，所述上游引物QF的碱基序列如SEQID NO:4所示，所述下游引物QR的碱基序列如SEQ ID NO:5所示。

4.根据技术方案3所述的差异表达方法，其特征在于，在所述的相对定量RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达情况中，RT-qPCR反应体系：总体积25μl，其中，2×SuperReal PreMix Plus 10μl，10μM上游引物QF 0.6μl，10μM下游引物QR 0.6μl，cDNA模板1μl，50×ROX Reference Dye 0.6μl，RNase-free ddH₂O>

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次提出了蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，以及扩增它的专用引物、检测该基因在不同材料中受低温胁迫下的差异表达的特异引物、检测方法。在RT-qPCR检测中该基因在没有低温胁迫的情况下在蔗茅中均少量表达，在甘蔗栽培品种(系)几乎不表达，低温处理后在蔗茅野生种中的表达量大幅度上升，说明该基因在蔗茅野生种受到低温胁迫后表达量上升，且耐寒性强的蔗茅野生种表达量处理前后均高于耐寒性较弱的蔗茅野生种，而甘蔗栽培品种(系)中处理前后均无明显表达，表明所述蔗茅类基因EfNAC44属于受低温胁迫表达的诱导型表达基因，该蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种受到低温胁迫后能迅速的参与低温胁迫响应过程，通过表达量的上调从而调控蔗茅野生种的耐寒机制，为认识蔗茅类NAC基因的抗逆机制，利用蔗茅野生种进行分子育种提供了技术支撑。

本发明检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种受低温胁迫的差异表达的方法，所设计的特异引物在RT-qPCR特异性强，无杂带产生，熔解曲线显示无引物二聚体产生。在内参基因的选择上，5种候选内参基因，分别为25SrRNA，GAPDH，β-actin，β-tubulin，PPO，本试验选择最合适甘蔗的内参25SrRNA，其稳定性更高。本RT-qPCR采用SYBR Green I嵌合荧光法进行，具有特异性强，灵敏度高，重复性好等特点。

序列表中SEQ ID NO:1所示的是蔗茅类基因EfNAC44的全长核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:2所示的扩增蔗茅类基因EfNAC44的专用引物的上游引物GP-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO:3所示的扩增蔗茅类基因EfNAC44的专用引物的下游引物GP-R的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO:4所示的是特异引物的上游引物QF的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO:5所示的是特异引物的下游引物QR的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO:6所示的是内参基因25SrRNA的上游引物25S-F的碱基序列。

序列表中SEQ ID NO:7所示的是内参基因25SrRNA的下游引物25S-R的碱基序列。

附图说明

图1：蔗茅类基因EfNAC44的扩增结果。图1中，M：maker；泳道1、泳道2、泳道3分别为退火温度55℃、57℃、60℃下的扩增产物。

图2：相同时间内低温胁迫处理下不同材料中蔗茅类基因EfNAC44的RT-qPCR差异表达图。图2中，纵坐标表示基因的相对表达量，横坐标表示不同温度处理下不同材料的名称。99-3-CK表示常温处理下的蔗茅99-3(耐寒性强)，99-3-LT表示低温胁迫处理下的蔗茅99-3，I91-8-CK表示常温处理下的蔗茅I91-8(耐寒性较弱)，I91-8-LT表示低温胁迫处理下的蔗茅I91-8，04-14-CK表示常温处理下的滇蔗04-14(蔗茅99-3的子代)，04-14-LT表示低温胁迫处理下的滇蔗04-14，Xin-CK表示常温处理下的新台糖10(滇蔗04-14的母本)，Xin-LT表示低温胁迫处理下的新台糖10。

图3：RT-PCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44中所用的特异引物为上游引物QF和下游引物QR在不同退火温度下的检测结果。M：maker；泳道1、泳道2、泳道3分别是以3℃低温处理72h的蔗茅99-3的cDNA为模板，退火温度依次为55℃、57℃、60℃下的扩增产物。

具体实施方式

以下实施例用于对本发明作进一步说明，各实施例中无特殊说明的为常规方法，以下各实验(包括对照)样品均三次重复。

前期通过生理指标的测定，筛选出耐寒强的蔗茅野生种蔗茅99-3，耐寒性较弱的蔗茅I91-8，蔗茅野生种子代较耐寒的栽培品种(系)滇蔗04-14，以及滇蔗04-14的母本新台糖10材料([1]曹哲群，肖芙荣，李富生等.7个蔗茅野生种及其后代材料苗期耐寒性鉴定[J].作物杂志，2017(5):43-48.[2]石景雨，何丽莲，王先宏，李福生.不同甘蔗品种叶片中总黄酮含量与提取工艺的优化研究，作物杂志，2016(5)：19-24)。这些材料可以通过采集或购买或通过本申请人获得，本申请人云南农业大学地址：云南省昆明市盘龙区沣源路452号，邮编650201。

实验材料：试验材料有不同无性系蔗茅野生种：蔗茅99-3，蔗茅I91-8，甘蔗栽培品种(系)：滇蔗04-14，新台糖10，共4份材料，4份材料种植于云南农业大学甘蔗研究所的甘蔗资源圃内(云南昆明，海拔1950m)。

实施例1蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44的获得：

一、设计扩增蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类NAC基因EfNAC44全长序列的专用引物

根据前期试验获得的蔗茅野生种等甘蔗材料的高通量转录组测序数据，进行生物信息学分析筛选，利用生物软件Primer5.0、Oligo 7设计扩增蔗茅类基因EfNAC44的专用引物，该专用引物由上游引物GP-F和下游引物GP-R组成，所述上游引物GP-F的碱基序列如SEQID NO：2所示，所述下游引物GP-R的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，该专用引物送上海生工公司合成。

二、低温胁迫处理的蔗茅野生种总RNA提取。

(1)低温胁迫处理：将盆栽的苗期生长状态基本一致的蔗茅99-3，蔗茅I91-8均设对照组和处理组，对照组在常温25℃按常规管理生长，处理组进行低温胁迫处理，所述低温胁迫处理是在3℃低温生长72h，然后同时分别采集对照组和处理组材料的叶片，均分别按下述方法进行：

(2)将采集的叶片置于研钵中加液氮快速磨碎，每100mg样品加入1ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s，每个样品在15～30℃放置5min；加入氯仿，氯仿的用量为每使用1mlTRIzol加入200μl氯仿，盖好管盖，涡旋振荡15s，15～30℃放置3min。

(3)4℃，12000rpm离心15min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中。

(4)向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，15～30℃放置20-30min。

(5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

(6)加入用RNase-Free ddH₂O配制的体积分数为75％的乙醇溶液洗涤沉淀，用量为每使用1ml>2O配制的体积分数为75％的乙醇溶液。

(7)4℃，5000rpm离心3min，用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀。

(8)沉淀在15～30℃晾干2-3min，加入30-100μl无RNase的双蒸水，充分溶解RNA后，2个对照样品RNA混合作为一个总对照样品于-70℃保存，2个低温胁迫处理样品的RNA分别于-70℃保存。

三.cDNA第一链的合成

(1)将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH₂O在室温(15℃-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心(转速6000rpm，30s)以收集残留在管壁的液体。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。

(2)按照以下体系进行RNA中的gDNA去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心(转速6000rpm，30s)，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

gDNA去除反应体系：

5×gDNA Buffer2μl

Total RNA 2μl

RNase-Free ddH₂O补足到10μl。

(3)按照以下体系的反转录反应体系配制混合液：

反转录反应体系：

10×Fast RT Buffer 2μl

RT Enzyme Mix1μl

FQ-RT Primer Mix 2μl

RNase-Free ddH₂O补足到10μl。

(4)将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀；42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到cDNA用于后续实验，或低温-20℃保存。

四、蔗茅野生种的蔗茅类基因EfNAC44的扩增

以步骤三(4)反转录获得的cDNA作为PCR反应的模板，以步骤一中设计的专用引物作为PCR反应引物，扩增蔗茅野生种蔗茅99-3叶片中受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44全长，PCR反应体系：Template 1μL；上游引物GP-F 1μL；下游引物GP-R 1μL；Buffer 2μL；dNTP 2μL；Pfu酶0.5μL；ddH₂O补足到20μL；总体积为20μL。PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸2min，35个循环；72℃,6min，后4℃保存。

上游引物GP-F的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物GP-R的碱基序列如SEQID NO:3所示。

五、目的基因的回收(百泰克生物公司提供的多功能DNA纯化回收试剂盒)

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，将凝胶中的目的条带进行胶回收，包括以下步骤：

(1)在紫外灯下将目的条带胶块切下，尽量将不含DNA片段的空白凝胶去掉后放入1.5ml离心管中。

(2)按每100μl胶块加入500μl溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液，置60℃溶胶约10min，期间不断摇动。

(3)胶块完全溶解后将溶胶液转移到吸附柱中，18～22℃，12000rpm离心30s，去掉废液。

(4)向吸附柱中加入500μl漂洗液，18～22℃，12000rpm离心30s，倒掉废液。

(5)重复步骤(4)，倒掉废液后的离心管12000rpm离心2min完全去掉废液，保留吸附柱。

(6)将吸附柱移至干净的1.5ml的离心管中，18～22℃放置2min使其残存于漂洗液中乙醇的挥发干。

(7)向吸附柱膜中央加入30μl-50μl的洗脱缓冲液，18～22℃放置1-2min，12000rpm离心2min洗脱DNA，离心管内收集的从吸附柱膜上洗脱的溶液即是目的片段的纯化产物回收液。

扩增结果如图1所示，无杂带产生。对扩增片段进行切胶回收后，经测序该回收片段序列与转录组获得的Unigen序列一致，即该回收产物为蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44，该回收产物的测序结果如序列表中SEQ ID NO：1所示。

另外，还设置了两个不同退火温度的实验，该两个实验除上述步骤四中PCR反应程序中的退火温度分别为55℃、57℃外，其余步骤均与上述各步骤相同。

实施例2本发明所提供的一种检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种中受低温胁迫的差异表达方法，包括以下步骤：

一、低温胁迫处理：

将盆栽的苗期生长状态基本一致的蔗茅99-3、蔗茅I91-8、滇蔗04-14，新台糖10的每份材料均设设对照组和处理组，对照组在常温(25℃)按常规管理生长，处理组进行低温胁迫处理，所述低温胁迫处理是在3℃低温生长72h，然后同时分别采集对照组和处理组材料的叶片，均分别按下述方法进行：

二、总RNA的提取

(1)将采集的叶片置于研钵中加液氮快速磨碎，每100mg样品加入1ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s，每个样品在15～30℃放置5min；加入氯仿，氯仿的用量为每使用1mlTRIzol加入200μl氯仿，盖好管带，涡旋振荡15s，15～30℃放置3min；4℃，12000rpm离心15min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中。

(2)向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，15～30℃放置20-30min；4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

(3)加入用RNase-Free ddH₂O配制的体积分数为75％的乙醇溶液洗涤沉淀，用量为每使用1ml>2O配制的体积分数为75％的乙醇溶液；4℃，5000rpm离心3min，用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀。

(4)沉淀在15～30℃晾干2-3min，加入30-100μl无RNase的双蒸水，充分溶解RNA后，将对照和低温胁迫处理的样品RNA均于-70℃保存。

三.cDNA第一链的合成

(1)将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RTBuffer、RNase-Free ddH₂O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心(转速6000rpm，30s)以收集残留在管壁的液体。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。

(2)按照以下体系进行RNA中的gDNA去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心(转速6000rpm，30s)，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

gDNA去除反应体系：

5×gDNA Buffer 2μl

Total RNA2μl

RNase-Free ddH₂O补足到10μl。

(3)按照以下体系的反转录反应体系配制混合液：

反转录反应体系：

10×Fast RT Buffer 2μl

RT Enzyme Mix1μl

FQ-RT Primer Mix 2μl

RNase-Free ddH₂O补足到10μl。

(4)将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀；42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到cDNA用于后续实验，或低温保存。

四、RT-qPCR技术检测蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种及栽培品种(系)中受低温胁迫表达的差异表达情况，实验在ABI公司7500荧光量PCR仪上进行，对低温胁迫处理前后的基因表达情况进行分析(见图2)。

(1)RT-qPCR反应体系：

蔗茅类基因EfNAC44的RT-qPCR反应体系配置：

总体积25μl

上游引物QF的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，下游引物QR的碱基序列如SEQ IDNO：5所示。

内参基因25SrRNA的RT-qPCR反应体系的配置：

总体积25μl

上游引物25S-F的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，下游引物25S-R的碱基序列如SEQID NO：7所示。

(2)RT-qPCR反应程序：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。试验数据在ABI公司7500荧光定量PCR仪上进行分析。

另设了以处理组的蔗茅99-3的cDNA模板在RT-PCR反应程序中仅退火温度分别为55℃、57℃、60℃，特异引物为上游引物QF和下游引物QR，其余操作步骤与本实施例1对应的步骤相同的实验，发现该特异引物(上游引物QF和下游引物QR)具有特异性(见图3)。

结果分析：在RT-qPCR检测中蔗茅类基因EfNAC44在没有低温胁迫的情况下蔗茅中均少量表达，在栽培品种(系)几乎不表达，在72h的3℃低温胁迫处理后在蔗茅野生种中的表达量大幅度上升，说明蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种受到低温胁迫后表达量上升，且耐寒性强的蔗茅野生种表达量处理前后均高于耐寒性较弱的蔗茅野生种，而栽培品种(系)均无明显表达，所述蔗茅类基因EfNAC44属于受低温胁迫表达的诱导型表达基因，表明蔗茅类基因EfNAC44在蔗茅野生种受到低温胁迫后能迅速的参与低温胁迫响应过程，该蔗茅类基因EfNAC44通过表达量的上调从而调控蔗茅野生种的耐寒机制。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 蔗茅野生种受低温胁迫表达的蔗茅类基因EfNAC44

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 591

<212> DNA

<213> 蔗茅(Erianthus fulvus Ness.)

<400> 1

atgtcggtgc cgccgctctc cgaccacgag ctgcaggacg agccctgcgg tggcttcgac 60

gataacccgt acgccgcgac gagcgccgcc atgctcctgc agggcgcgtc gttcccggcg 120

ctgcatgccg cgtccgccgg cgcgcagagg atgcccagga tcccgtcctt ctcggagctg 180

ttcaatgacc cctcgctgct ggcgcacttc ttcgaggagg gcggcatgca gcaggacatg 240

gcacggctcg gtaaccagca gcagcacgcc cctctcctcg gccgccccgt cacgagccaa 300

ctgctggtca acagcggcag cagcatgtcc ccggggcaga tccagcagat ggatccgcct 360

gcctcgacgt cggccgctgg agatggcgca gctggcaagc gcaagagatc atcagaggcg 420

agtactgcta gtgccagtgc gctgtcgagc cagcagcagg cgtctgcagc caagaaaccg 480

aacggctact gttttggtgc aacgacgacg ttccaaatag gcaacgggct gcaggggtcg 540

tcgctgggcc accagatgca gcttcattct tctaacatgg ggatgaactg a 591

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catcccatct tctcttccta at 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagtggaga acagcaatc 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgatgatgag atcccacact agc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagggtgca tcggtgattg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ataaccgcat caggtctcca ag 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cctcagagcc aatccttttc c 21