一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法

摘要

本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞的成骨分化状态。

说明书

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种制备可实时检测间充质干 细胞骨分化的细胞模型的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)作为一种新型基因治疗的靶细胞有着广泛床应 用前景，其优势如下：(1)来源广泛，可从自体或异体获得，属于同种移 植，不涉及伦理问题；(2)易于培养，具有增殖能力，体内外均保持多向 分化潜能；(3)具有归巢组织损伤部位、分泌大量细胞因子的能力。但目 前的研究发现，供体的个体差异、取材年龄的不同所造成的分化潜能的差异 制约了间充质干细胞作为细胞移植药物的临床应用。如何在体外传代扩增及 分化过程中及时监测MSCs的分化状态也成为干细胞工业质控中的难点和瓶 颈。

CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切， 形成DNA双链缺口(Double-strand breaks,DSBs)，通过细胞内非同源末端 链接(Non-homologousend joining,NHEJ)实现对原位基因的敲除，通过同 源重组(Homology directed repair,HDR)在外源基因模板存在的情况下，实 现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献 CN105985985A中所述，利用CRISPR/Cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的 MSCs中的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α进行敲除，从而实现降低异体 间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主 导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大， 整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在MSCs中进行大片段基 因敲入的报道。

发明内容

本公开的目的是实现对间充质干细胞骨分化的实时检测，提供可实时检 测间充质干细胞骨分化的细胞模型以进行药物筛选。

为了实现上述目的，本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨 分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因 的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述骨分化相 关基因包括SPP1、COL1A1、BMP-2、Runx2、SLP1、IBSP及BGLAP中的 至少一种；所述骨分化相关基因的敲入位点为所述骨分化相关基因的最末一 个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包 装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所 述骨分化相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源 臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报 告基因，以使得定向敲入后形成编码由骨分化相关基因、2A肽和荧光蛋白 串联而成的融合蛋白的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP 复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后 1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以 进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物 极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向 敲入的单克隆细胞株。

通过上述技术方案，本发明建立了一种可在间充质干细胞高效敲入长片 段报告基因的方法，在不影响骨分化相关基因表达的情况下，原位插入报告 基因，由此可以构造多种与间充质干细胞骨分化相关的细胞模型，并且进而 可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞成骨分化状 态，并可在动物模型中检测制备的间充质干细胞药物移植至体内不同组织， 处于疾病或骨分化的组织微环境中，组织特异性的细胞因子及有害代谢产物 是否会影响间充质干细胞在体内的骨分化而影响细胞体内存活时间与功能， 便于对间充质干细胞体内作用时间与有效性进行深入研究，促进其临床转化 及工业化生产制备中的质量监测。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的 方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA 和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述骨分化相关基因包括SPP1、 COL1A1、BMP-2、Runx2、SLP1、IBSP及BGLAP中的至少一种；所述骨分 化相关基因的敲入位点为所述骨分化相关基因的最末一个有义密码子和终 止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中， 形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述骨分化相关基因的 敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源 臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向 敲入后形成编码由骨分化相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白 的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并 进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述 电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转 染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克 隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

本发明通过RNP复合物以电转的方式将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞 中，并在电转后的合适的时间内选择AAV病毒将插入有荧光蛋白报告基因 的同源重组载体转染入细胞中，最终使得sgRNA、Cas9蛋白和插入有模板 DNA的载体共同通过CRISPR基因编辑来使得大片段的外源基因得以定向 敲入靶点位置。

其中，所述骨分化基因是以NCBI数据库中的Gene Symbol来定义的， 具体信息如表1所示，其对应的代表性sgRNA序列和左右同源臂序列也列 于表1中。优选地，所述sgRNA如SEQ ID NO.1、4、7、10、13、16或19 所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQ ID NO.2、5、8、11、14、17或 20所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQ ID NO.3、6、9、12、15、18 或21所示.

表1

其中，可选地，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优 选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对骨分化相关基因的敲入 位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。其中，可以使用在 线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)依据骨分化相关基因的敲入位点 设计sgRNA的序列并加以合成。其中，sgRNA序列的5’端和3’端末尾的可 以分别添加有甲基(-O-Me)化学修饰基团或磷硫酰(-phosphorothioate)化学修饰基团。

其中，可选地，将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋 白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

其中，可选地，步骤S3中，所述间充质干细胞的悬液与所述RNP复合 物混合时，相对于每10⁶个所述间充质干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP>7个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

其中，可选地，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm， 单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次 数为2-10次。

其中，可选地，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后 的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到 转染后的培养物。

其中，可选地，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使 得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为10⁴-10⁶。MOI值是感染时病毒与细>

其中，优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干 细胞、脐带间充质干细胞、宫血间充质干细胞及牙髓间充质干细胞。所述 AAV病毒的血清型为AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV9病毒，优选所述AAV 病毒的血清型为AAV9病毒，在该优选情况下，能够进一步增加大片段基因 敲入干细胞的效率。

其中，所述自剪切2A肽用于将骨分化相关基因的蛋白和荧光蛋白切割 开，其可以为T2A肽、F2A肽和P2A肽中的至少一种；所述荧光蛋白报告 基因的选择可以较宽，例如可以为EGFP、ECFP、EYFP、GFP、RFP、mCherry、 tdTomato和Venus中的至少一种。

其中，可选地，所述荧光蛋白报告基因的序列如SEQ ID NO.24所示； 所述载体的骨架序列如SEQ ID NO.25所示。所述载体的骨架序列是指未插 入模板DNA的载体的序列。

以下通过实施例进一步详细说明本发明：

实施例1

构建在脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)骨桥蛋白基因(SPP1)中插入 EGFP报告基因的细胞模型。采用SPP1基因原位基因启动子，在终止密码 子前插入T2A-EGFP。

1、sgRNA设计以及合成

(1)通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)针对SPP1基因 8号外显子靠近终止密码子(TAA)上游100bp以内的序列上设计靶向识别 的sgRNA，优选结果如下：SPP1sgRNA:5’- gguuguagaccccaaaaguaguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaa cuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’(SEQ ID NO.1)。其中1-20位的 序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。

(2)该sgRNA由Integrated Dna Technologies.USA公司合成并在该 sgRNA序列的5’端和3’端末尾的三个碱基的二号位和三号位上分别添加 O-Me、phosphorothioate的修饰。

2、体外法检测sgRNA的活性

(1)基因组扩增识别靶序列片段(1144bp)，引物由生工生物工程(上 海)股份有限公司合成。

SPP1-FW:5’-gtaacatgctagtattatttcagc-3’(SEQ ID NO.22)，

SPP1-REV:5’-aacaaaacatcacaccgtacc-3’(SEQ ID NO.23)。

(2)将PCR扩增产物200ng，sgRNA 100ng，SpCas9 200ng(购于 Sigma-Aldrich，货号：TGEN-CP-500UG)，10×缓冲液2μL配置成20μL 反应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。

(3)使用TAE配置1％的BioWest琼脂糖胶，在90V的电压下电泳 30min，使用凝胶成像仪观察结果。

3、AAV包装系统选择及质粒构建

(1)待编辑细胞为人脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)，根据AAV组 织亲和性对照表，优选血清型为AAV-9的包装系统。

(2)AAV-9的总包装容量为4.7Kb。在AAV包装系统的装载载体上所 插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500bp 左右)。

左同源臂序列为SEQ ID NO.2，其中第433-435位碱基为经过突变的 PAM位点。

右同源臂序列为SEQ ID NO.3。

插入片段为T2A和EGFP，共777bp，序列如SEQ ID NO.24所示。 使用无缝克隆(高保真DNA组装试剂盒，购于NEB(北京) 有限公司，货号：E2621S)的方法将Cassette插入到pAAV载体上，载体序 列为SEQ ID NO.25。为了避免SpCas9/sgRNA RNP复合物对重组位点的 二次切割从而影响基因编辑的效率，通过PrimerStar高保真DNA聚合酶(购 于宝生物工程(大连)有限公司，货号：R044A)利用PCR刻环的方法在P AM位点引入了点突变(TGG突变为TCG)，从而避免了SpCas9/sgRNA RNP复合物对识别位点的切割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限 公司合成。

SPP1-PAM-mut-FW:5’-gtagaccccaaaagtaaagaagaagataaacacct-3’(SEQ I DNO.26)。

SPP1-PAM-mut-REV:5’-aggtgtttatcttctttacttttggggtctac-3’(SEQ ID NO.27)。

4、AAV病毒包装及纯化

(1)在病毒包装前一天将HEK293T细胞按照每皿5×10⁶的数量种植>2的细胞培养箱中培养24小时。

(2)病毒包装当天检查HEK293T细胞汇合度是否达到80％。每皿按照 以下步骤单独配置转染体系：将10μg的pAAV-Cassette，10μg的pHelper， 10μg的pAAV9混合后使用无血清的DMEM调整体积到910μL后经漩涡振 荡器混匀，加入90μL的PEI(购于PolysciencesAsia Pacific,Inc.，货号： 23966-2)后再次使用漩涡振荡器混匀，静置15分钟。将CORNING培养皿 中的完全培养基替换成9mL无血清培养基，再将之前经过静置的DNA-PEI 复合物均匀滴加到培养皿中，轻柔晃匀后置于37度、5％CO₂的细胞培养箱>2的细胞培养箱中继续培养。

(3)在转染60小时之后，分别收获上清和细胞。

将收集得到的上清经4000rpm 4度离心10分钟后弃去杂质。将去除杂 质的上清加入Amicon Ultra-15超离柱中(购于默克化工技术(上海)有限 公司，货号：UFC 905096)，经过若干次4000rpm、4度离心30分钟将体积 浓缩至10到15mL。将用细胞刮刀刮下的HEK293T细胞用适量培养基吹匀 并转移至50mL离心管中，经1500rpm、4度离心10min后弃上清，所有沉 淀总共加3mL细胞裂解缓冲液(150mM NaCl,20mM tris pH8.0)使其重悬。 将重悬细胞在-80℃酒精浴和37℃水浴中反复冻融三次。将浓缩的上清和冻 融的细胞悬液混匀，添加1M MgCl₂至终浓度为1mM。添加Benzonase(购>

(4)采用碘克沙醇密度梯度离心法纯化病毒(购于Sigma-Aldrich，货 号：D1556-250mL)。配置碘克沙醇梯度17％：5mL 10×PBS,0.05mL 1M MgCl₂,0.125mL>2,0.125mL>2,0.125mL>2,0.125mL>

(5)利用qPCR对AAV9进行滴度检测。根据EGFP序列设计引物， 使qPCR产物的长度约200bp。qPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公 司合成。

AAVGFPF:5’-tcagcttcaggcaccaccac-3’(SEQ ID NO.28)。

AAVGFPR:5’-tgaacttgtggccgtttacgtcg-3’(SEQ ID NO.29)。

制备7个AAV9重组质粒标准品，以1：10的比例进行梯度稀释。从 10ng/μL以下的浓度开始稀释，分别为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、 0.001ng/μL、0.0001ng/μL和0.00001ng/μL。

根据以下公式计算稀释的DNA拷贝数：

使用DNase对病毒样本进行预处理(购于宝生物工程(大连)有限公司， 货号：2270A)。使用2×SYBR PCR mix(购于东洋纺(上海)生物科技有 限公司，货号：QPS-201)配置qPCR反应体系。使用Roche 480II 实时荧光定量PCR系统进行定量PCR。根据Ct值，绘制标准曲线，并计算 AAV9的滴度。

5、RNP复合物组装及待编辑细胞的预处理

(1)将SpCas9(终浓度300ug/ml)和SPP1sgRNA(终浓度175ug/ml) 按照1:3的摩尔比进行混合在室温孵育10min，从而形成SpCas9/sgRNA RNP 复合物。

(2)观察脂肪间充质干细胞汇合率达到80％后移除含10％FBS的 DMEM/F12培养基(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11320082)，用 PBS漂洗一次。加入0.05％胰酶(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号： 25200-072)使之完全覆盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。 即刻加入新鲜的DMEM/F12完全培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿底，使 皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，制成干细胞悬液。使用血球计数板对细胞密度进行计数。使用Opti-MEM(14.5mM的ATP、23.6mM 的氯化镁)(购于ThermoFisher Scientific,Inc.，货号：11058021)调整细胞 密度到5×10⁷/mL。

(3)将10μL经过室温孵育的SpCas9/sgRNA SNP复合物(以sgRNA 的量计，所述RNP复合物的含量为7.5μmol)和10μL经过计数并使用 Opti-MEM重悬的脂肪间充质干细胞悬液(其中细胞数量为5×10⁵个)相混>2的细>

(4)电转完第5到20分钟内开始按照1×10⁵的MOI值轻柔地滴加>

(5)电转完24小时后将旧培养基移除，更换为DMEM/F12完全培养 基。

6、单克隆细胞株的培养：

(1)电转完第48小时使用PBS漂洗一次培养皿。加入胰酶使之完全覆 盖皿底。37℃孵育3-5分钟后停止消化，吸去胰酶。即刻加入新鲜的 DMEM/F12完全培养基，用1mL枪扇形吹打培养皿/瓶底，使皿底贴附的干 细胞集落脱落，轻柔缓慢吹吸混匀，保证细胞间没有粘连，制成干细胞悬液。 使用血球计数板对细胞密度进行计数。按每个10cm培养皿15000个细胞的 比例把细胞种植到含DMEM/F12完全培养基的10cm CORNING培养皿中于 37度、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。

(2)每24小时进行观察并移除旧的培养基，更换为新的DMEM/F12 完全培养基。72小时后可以在镜下观察到克隆的形成。

(3)电转后12到14天在十倍的物镜下可以看到克隆的大小已经相当 于一个硬币。不能让克隆继续变大或者相交。在96孔板上的每个孔中加入 120μL DMEM/F12完全培养基，标记板O。在超净台中通过显微镜进行观察， 将P200移液器调节至45μL使用带有滤芯的枪头刮碎克隆，用移液器收集细 胞并转移到96孔板的小孔中。

(4)克隆挑取之后每24小时后将旧的培养基移除，更换为新的 DMEM/F12完全培养基，四天后细胞汇合率达到80％。

(5)在两块96孔板上的每个孔中加入133μL DMEM/F12完全培养基， 分别标记为板A、板B。将板O的每孔使用150μL的PBS漂洗。每孔中加 入35μL的胰酶，消化5到10分钟后每孔中添加165μL的DMEM/F12完全 培养基。从孔中分别移取66μL的细胞悬液转移到板A和板B的对应小孔中。 板A用于基因组提取，板B备用。在板O的每个孔中直接添加165μL的细 胞冻存液后至于深低温冰箱存储。

实施例2

构建在脂肪间充质干细胞(ADSC细胞)I型胶原蛋白基因(COL1A1) 中插入EGFP报告基因的细胞模型。采用COL1A1基因原位基因启动子，在 终止密码子前插入2A-EGFP。

通过在线sgRNA设计工具(http://crispr.mit.edu/)在COL1A1基因51 号外显子靠近终止密码子(TAA)上游100bp以内的序列上设计靶向识别的 sgRNA。

COL1A1sgRNA：5’-uggggcaccaacguccaaggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuuuu-3’。(S EQ IDNO.4)。

其中1-20位的序列为识别基序，其余的序列为tracrRNA。

该sgRNA由Integrated DNA Technologies.USA公司合成并在序列的 5’端和3’端末尾的三个碱基的二号位和三号位上分别添加-2-O-Me、-3-ph osphorothioate的修饰。

2、体外法检测sgRNA的活性

(1)从基因组扩增识别靶序列片段(1084bp)，引物由生工生物工程(上 海)股份有限公司合成。

COL1A1-FW:5’-ccctgcagttcgagtatgg-3’，(SEQ ID NO.30)，

COL1A1-REV:5’-gcagtctgagaaccccagg-3’，(SEQ ID NO.31)。

(2)将PCR扩增产物200ng，sgRNA 100ng，SpCas9 200ng(购于 Sigma-Aldrich，货号：TGEN-CP-500UG)，10×缓冲液2μl配置成20μl反 应体系。反应体系在37度保温一小时，在70度保温一小时。

(3)使用TAE配置1％的BioWest琼脂糖胶，在90V的电压下电泳 30min，使用凝胶成像仪观察结果。

3、AAV包装系统选择及质粒构建

(1)待编辑细胞为脂肪间充质(ADSC)干细胞株，根据AAV组织亲 和性对照表，优选血清型为AAV9的包装系统。

(2)AAV9的总包装容量为4.7Kb。在AAV包装系统的装载载体上所 插入的片段应包含左同源臂(500bp左右)，插入片段以及右同源臂(500b p左右)。左同源臂序列为SEQ IDNO.5，其中第436-438位碱基为经过 突变的PAM位点，右同源臂序列为SEQ ID NO.6。插入片段为T2A和E GFP，共777bp，序列如SEQ ID NO.24所示。使用无缝克隆(高保真DNA组装试剂盒，购于NEB(北京)有限公司,货号：E2621S) 的方法将Cassette插入到pAAV载体上，载体序列为SEQ ID NO.25。为了 避免SpCas9/sgRNA RNP复合物对重组位点的二次切割从而影响基因编辑 的效率，通过PrimerStar高保真DNA聚合酶(购于宝生物工程(大连)有 限公司，货号：R044A)利用PCR刻环的方法在PAM位点引入了点突变(T GG突变为TCG)，从而避免了SpCas9/sgRNA RNP复合物对识别位点的切 割。点突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

COL1A1-PAM-mut-FW:5’-cccatcatcgatgtggcacccttggacgttggtgc-3’(SEQ IDNO.32)。

COL1A1-PAM-mut-REV:5’-gcaccaacgtccaagggtgccacatcgatgatggg-3’ (SEQ IDNO.33)。

4、AAV病毒包装及纯化

同实施例1

5、RNP复合物组装及待编辑细胞的预处理

同实施例1

6、Lonza 4D系统电转及AAV感染

同实施例1

7、单克隆细胞株的培养

同实施例1

对比例1

按照实施例1的方法进行，不同的是电转完第35min开始按照1×10⁵的MOI轻柔地滴加AAV9，并于电转完50分钟内滴加完毕。

测试实施例1

1、荧光检测等位基因插入效率检测

检测样品：实施例1、2以及对比例1经过电转和AAV感染后第四天经 过胰酶消化后加入新鲜的DMEM/F12完全培养基使其重悬制成的干细胞悬 液。

检测方法：因为在目标基因座上插入的T2A-EGFP序列表达绿色荧光蛋 白，使用流式细胞仪检测并统计能发出绿色荧光的细胞数量以及细胞总量。 将能发出绿色荧光的细胞数量除以细胞总量可以得到总的编辑效率。

实验结果：实施例1编辑效率为79.4％，实施例2编辑效率为75.3％， 对比例1编辑效率为9.5％。

2、PCR检测等位基因插入效率

检测样品：96孔板培养的单克隆细胞株(A板和B板)

检测方法：在同源臂外设计引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限 公司合成。

实施例1、对比例1使用SPP1-FW、SPP1-REV。实施例2使用 COL1A1-FW、COL1A1-REV。

将96孔板中的克隆所获得的基因组进行PCR扩增。将PCR产物进行电 泳并分析。实施例1、对比例1只有1144bp左右条带的为非编辑细胞，只有 1921bp的为双等位基因编辑细胞，既有1144bp左右条带也有1921bp的为单 等位基因编辑细胞。分别标注并统计这三类编辑类型的比例。实施例2中只 有1084bp左右条带的为非编辑细胞，只有1861bp的为双等位基因编辑细胞， 既有1084bp左右条带也有1861bp的为单等位基因编辑细胞。

实验结果：实施例1编辑效率：等位基因双编辑62.3％、等位基因单编 辑18.1％，对比例1编辑效率：等位基因双编辑0.5％、等位基因单编辑0.8％； 实施例2编辑效率：等位基因双编辑68.5％、等位基因单编辑15.5％；可见 电转与病毒转染的时间间隔对基因敲入的效率影响较大，在优选在电转结束 后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液 以进行8-24小时的转染的情况下，基因敲入的效率最高。

3、所构建细胞模型在体外诱导下所致的细胞骨分化检测

将实施例1得到的进行了EGFP敲入的脂肪间充质干细胞铺种于6孔板， 第2天更换为成骨诱导液(10mmol/Lβ-甘油磷酸(购于Sigma-Aldrich， 货号：G9422)、1×10^-7mol/L地塞米松(购于Sigma-Aldrich，货号：D4902)、>

表2体外诱导下细胞骨分化状态检测

上述表2结果显示，实施例1中所建立的模型可在不致细胞死亡的情况 下，实时检测诱导下的细胞骨分化。SPP1基因的表达是骨细胞分化成熟的 标志之一。常规用免疫化学的方法检测SPP1基因的表达，实施例1中构建 的EGFP敲入的脂肪间充质干细胞在成骨分化过程中实时绿色荧光检测的结 果和细胞免疫化学检测的结果一致。

实施例2操作同实施例1，相应的只需要替换一抗为：Anti-Collagen I， 购于艾博抗(上海)贸易有限公司，货号：ab90395。结果如表3所示。

表3体外诱导下细胞骨分化状态检测

上述表3结果显示，实施例2中所建立的模型可在不致细胞死亡的情况 下，实时检测诱导下的细胞骨分化。COL1A1基因的表达是骨细胞分化成熟 的标志之一，常规用免疫化学的方法检测COL1A1基因的表达，实施例1中 构建的EGFP敲入的脂肪间充质干细胞在成骨分化过程中实时绿色荧光检测 的结果和细胞免疫化学检测的结果一致。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

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<130> 10970-K-HZGZ

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gguuguagac cccaaaagua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtataagat gacctaaaag ctagagagtg gaaaaggatt accatattcc catccctagc 60

cgttcatata attattcttc atttgtgccg tgattcagta ccctgatgct acagacgagg 120

acatcacctc acacatggaa agcgaggagt tgaatggtgc atacaaggcc atccccgttg 180

cccaggacct gaacgcgcct tctgattggg acagccgtgg gaaggacagt tatgaaacga 240

gtcagctgga tgaccagagt gctgaaaccc acagccacaa gcagtccaga ttatataagc 300

ggaaagccaa tgatgagagc aatgagcatt ccgatgtgat tgatagtcag gaactttcca 360

aagtcagccg tgaattccac agccatgaat ttcacagcca tgaagatatg ctggttgtag 420

accccaaaag taaagaagaa gataaacacc tgaaatttcg tatttctcat gaattagata 480

gtgcatcttc tgaggtcaat 500

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaggagaaaa aatacaattt ctcactttgc atttagtcaa aagaaaaaat gctttatagc 60

aaaatgaaag agaacatgaa atgcttcttt ctcagtttat tggttgaatg tgtatctatt 120

tgagtctgga aataactaat gtgtttgata attagtttag tttgtggctt catggaaact 180

ccctgtaaac taaaagcttc agggttatgt ctatgttcat tctatagaag aaatgcaaac 240

tatcactgta ttttaatatt tgttattctc tcatgaatag aaatttatgt agaagcaaac 300

aaaatacttt tacccactta aaaagagaat ataacatttt atgtcactat aatcttttgt 360

tttttaagtt agtgtatatt ttgttgtgat tatctttttg tggtgtgaat aaatctttta 420

tcttgaatgt aataagaatt tggtggtgtc aattgcttat ttgttttccc acggttgtcc 480

agcaattaat aaaacataac 500

<210> 4

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uggggcacca acguccaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 5

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agggctccga ccctgccgat gtggccatcc agctgacctt cctgcgcctg atgtccaccg 60

aggcctccca gaacatcacc taccactgca agaacagcgt ggcctacatg gaccagcaga 120

ctggcaacct caagaaggcc ctgctcctcc agggctccaa cgagatcgag atccgcgccg 180

agggcaacag ccgcttcacc tacagcgtca ctgtcgatgg ctgcacggtg agtgcccaga 240

atccccaggc agggccccac ctctccggcc ttgggctttt tggccaggcc atagtgccct 300

ctctccatca ctcccacgtg gtaatgcccc ctcccgttgt ctccgcccca ccccagagtc 360

acaccggagc ctggggcaag acagtgattg aatacaaaac caccaagacc tcccgcctgc 420

ccatcatcga tgtggcaccc ttggacgttg gtgccccaga ccaggaattc ggcttcgacg 480

ttggccctgt ctgcttcctg 500

<210> 6

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actccctcca tcccaacctg gctccctccc acccaaccaa ctttcccccc aacccggaaa 60

cagacaagca acccaaactg aaccccctca aaagccaaaa aatgggagac aatttcacat 120

ggactttgga aaatattttt ttcctttgca ttcatctctc aaacttagtt tttatctttg 180

accaaccgaa catgaccaaa aaccaaaagt gcattcaacc ttaccaaaaa aaaaaaaaaa 240

aaaagaataa ataaataact ttttaaaaaa ggaagcttgg tccacttgct tgaagaccca 300

tgcgggggta agtccctttc tgcccgttgg gcttatgaaa ccccaatgct gccctttctg 360

ctcctttctc cacacccccc ttggggcctc ccctccactc cttcccaaat ctgtctcccc 420

agaagacaca ggaaacaatg tattgtctgc ccagcaatca aaggcaatgc tcaaacaccc 480

aagtggcccc caccctcagc 500

<210> 7

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagauagcac ugaguucugu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 8

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggcccactt ggaggagaaa caaggtgtct ccaagagaca tgttaggata agcaggtctt 60

tgcaccaaga tgaacacagc tggtcacaga taaggccatt gctagtaact tttggccatg 120

atggaaaagg gcatcctctc cacaaaagag aaaaacgtca agccaaacac aaacagcgga 180

aacgccttaa gtccagctgt aagagacacc ctttgtacgt ggacttcagt gacgtggggt 240

ggaatgactg gattgtggct cccccggggt atcacgcctt ttactgccac ggagaatgcc 300

cttttcctct ggctgatcat ctgaactcca ctaatcatgc cattgttcag acgttggtca 360

actctgttaa ctctaagatt cctaaggcat gctgtgtccc gacagaactc agtgctatct 420

cgatgctgta ccttgacgag aatgaaaagg ttgtattaaa gaactatcag gacatggttg 480

tggagggttg tgggtgtcgc 500

<210> 9

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tagtacagca aaattaaata cataaatata tatatatata tatattttag aaaaaagaaa 60

aaaacaaaca aacaaaaaaa ccccacccca gttgacactt taatatttcc caatgaagac 120

tttatttatg gaatggaatg gaaaaaaaaa cagctatttt gaaaatatat ttatatctac 180

gaaaagaagt tgggaaaaca aatattttaa tcagagaatt attccttaaa gatttaaaat 240

gtatttagtt gtacatttta tatgggttca accccagcac atgaagtata atggtcagat 300

ttattttgta tttatttact attataacca ctttttagga aaaaaatagc taatttgtat 360

ttatatgtaa tcaaaagaag tatcgggttt gtacataatt ttccaaaaat tgtagttgtt 420

ttcagttgtg tgtatttaag atgaaaagtc tacatggaag gttactctgg caaagtgctt 480

agcacgtttg cttttttgca 500

<210> 10

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cacuagaauu caaaacaguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 11

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tccatcttct gttataattt ttaggtgctt cagaactggg ccctttttca gaccccaggc 60

agttcccaag catttcatcc ctcactgaga gccgcttctc caacccacga atgcactatc 120

cagccacctt tacttacacc ccgccagtca cctcaggcat gtccctcggt atgtccgcca 180

ccactcacta ccacacctac ctgccaccac cctaccccgg ctcttcccaa agccagagtg 240

gacccttcca gaccagcagc actccatatc tctactatgg cacttcgtca ggatcctatc 300

agtttcccat ggtgccgggg ggagaccggt ctccttccag aatgcttccg ccatgcacca 360

ccacctcgaa tggcagcacg ctattaaatc caaatttgcc taaccagaat gatggtgttg 420

acgctgatgg aagccacagc agttccccaa ctgttttgaa ttctagtggc agaatggatg 480

aatctgtttg gcgaccatat 500

<210> 12

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgaaattcct cagcagtggc ccagtggtat ctgggggcca catcccacac gtatcaatat 60

atacatatat agagagagtg catatatatg tatatcgatt agctatctac aaagtgccta 120

ttttttagaa gatttttcat tcactcactc agtcatgatc ttgcagccat aagagggtag 180

atattgagaa gcagaaggct caagagagac aattgcaatc gagcttcaga ttgtttacta 240

tttaagatgt acttttacaa aggaacaaag aagggaaaag gtatttttgt ttttgttgtt 300

tggtctgtta tcatcaataa cctgttcata tgccaattca gagaggtgga ctccaggttc 360

aggagggaga agagcaaagc cgcttcctct ctgtgctttg aaacttcaca ccctcacggt 420

ggcagctgtg tatggaccag tgccctccgc agacagctca caaaaccagt tgaggtgcac 480

taaagggaca tgaggtagaa 500

<210> 13

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcuugauucc ugccauaugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 14

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actcctgaac cctactccaa gcacagcctc tgtctgactc ccttgtcctt caagagaact 60

gttctccagg tctcagggcc aggatttcca taggatcgcc tgtggctttg attctattct 120

agtgtctctg ggtgggggtc ctgggcaagt gtctttctga gtctcagttt ctttatcggt 180

aaaatgtaca taatgagatt gaaagtgctc tgcaaagcac tatgtgcact aagaatttat 240

tattcaggtt gtttccatca tgttttctga ggtgaaatca caaaggatca gtggagtttg 300

aggattatct agttcaatgc tttgagttta gagttttacg gtgaaaatga gacttgtctc 360

ctgacactaa gtctctctca actatagcgc tatcttgcta ttttctctat ctcagaagga 420

tccttgggca ggaggaagga tgtggatatg atttggctgg tttctatgct gaagctctta 480

tctgattttc tctcacagct 500

<210> 15

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgattcctgc catatggagg aggctctgga gtcctgctct gtgtggtcca ggtcctttcc 60

accctgagac ttggctccac cactgatatc ctcctttggg gaaaggcttg gcacacagca 120

ggctttcaag aagtgccagt tgatcaatga ataaataaac gagcctattt ctctttgcac 180

atcctgcttc tgtgattcgt tgggggtatg agtggggtgg gaagctgtga gggaagatct 240

agatatgagg cctccttcct atgaatacgt agtgggagga agaggcttag ggactggggg 300

aacttgaatt tatatcatga gtgtgaaagt gctgactctg tgatttggga caagtgattt 360

tatctcctaa atttcaatgg gattagggat gtacaataac atgaagaatc agaaacctca 420

attttactgc ctctggcagg attgtcaact gcaggtgaaa aactttcctg agacgagttt 480

atgcataaga gatcctgcca 500

<210> 16

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

uuuaaaggac aaggcuacga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 17

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aagaagaaga ggaggaagag gaaggaaatg aaaacgaaga aagcgaagca gaagtggatg 60

aaaacgaaca aggcataaac ggcaccagta ccaacagcac agaggcagaa aacggcaacg 120

gcagcagcgg aggagacaat ggagaagaag gggaagaaga aagtgtcact ggagccaatg 180

cagaagacac cacagagacc ggaaggcagg gcaagggcac ctcgaagaca acaacctctc 240

caaatggtgg gtttgaacct acaaccccac cacaagtcta tagaaccact tccccacctt 300

ttgggaaaac caccaccgtt gaatacgagg gggagtacga atacacgggc gccaatgaat 360

acgacaatgg atatgaaatc tatgaaagtg agaacgggga acctcgtggg gacaattacc 420

gagcctatga agatgagtac agctacttta aaggacaagg ctacgatggc tatgatggtc 480

agaattacta ccaccaccag 500

<210> 18

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgaagctcca gcctgggatg aattcatcca ttctggcttt gcatccggct accattttcg 60

aagttcaact caggaaggtg caatataaca aatgtgcata ttataatgag gaatggtact 120

accgttccag attttctgta attgcttctg caaagtaata ggcttcttgt cccttttttt 180

tctggcatgt tatggaatga tcattgtaaa tcaggaccat ttatcaagca gtacaccaac 240

tcataagatc aaatttcatt gaatggtttg aggttgtagc tctataaata gtagttttta 300

acatgcctgt agtattgcta actgcaaaaa catactcttt gtacaagaag tgcttctaag 360

aatttcattg acattaatga cactgtatac aataaatgtg tagtttctta atcgcactac 420

ctatgcaaca ctgtgtatta ggtttatcat cctcatgtat ttttatgtga cctgtatgta 480

tattctaatc tacgagtttt 500

<210> 19

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgggccguag aagcgccgau guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 20

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cactcctgcc acctcctgtc tggccatcag gaaggccagc ctgctcccca cctgatcctc 60

ccaaacccag agccacctga tgcctgcccc tctgctccac agcctttgtg tccaagcagg 120

agggcagcga ggtagtgaag agacccaggc gctacctgta tcaatggctg gggtgagaga 180

aaaggcagag ctgggccaag gccctgcctc tccgggatgg tctgtggggg agctgcagca 240

gggagtggcc tctctgggtt gtggtggggg tacaggcagc ctgccctggt gggcaccctg 300

gagccccatg tgtagggaga ggagggatgg gcattttgca cgggggctga tgccaccacg 360

tcgggtgtct cagagcccca gtcccctacc cggatcccct ggagcccagg agggaggtgt 420

gtgagctcaa tccggactgt gacgagttgg ctgaccacat cggctttcag gaggcctatc 480

ggcgcttcta cggcccggtc 500

<210> 21

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtgtcgctc tgctggcctg gccggcaacc ccagttctgc tcctctccag gcacccttct 60

ttcctcttcc ccttgccctt gccctgacct cccagcccta tggatgtggg gtccccatca 120

tcccagctgc tcccaaataa actccagaag aggaatctgt gggcctgtga gtctgtccag 180

tttatggagt gtgggaggga ggtgtcagga ggatgggggt gaggaggttt taccttcttc 240

agttctagaa agtgctttcc aaagttttat ttttttattt gtacctgcct tgttccagaa 300

aacgttgaag gtggcttccc aaagtctaac tagggatacc ccctctagcc taggaccctc 360

ctccccacac ctcaatccac caaaccatcc ataatgcacc cagataggcc cacccccaaa 420

agcctggaca ccttgagcac acagttatga ccaggacaga ctcatctcta taggcaaata 480

gctgctggca aactggcatt 500

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtaacatgct agtattattt cagc 24

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aacaaaacat cacaccgtac c 21

<210> 24

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg cccagtgagc 60

aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta 120

aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg 180

accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc 240

accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac 300

ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac 360

gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc 420

atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag 480

tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag 540

gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac 600

cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc 660

acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag 720

ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagga attctaa 777

<210> 25

<211> 2949

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgcg aatgctgcgg cgcgcggcta gcctgatttt 180

gtaggtaacc acgtgcggac cgagcggccg caggaacccc tagtgatgga gttggccact 240

ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg 300

ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca ggggcgcctg 360

atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac 420

catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 480

tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 540

tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 600

gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta 660

gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 720

atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg 780

atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 840

aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta 900

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 960

cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 1020

ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 1080

tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 1140

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 1200

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 1260

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 1320

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 1380

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 1440

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 1500

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 1560

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 1620

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 1680

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 1740

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 1800

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 1860

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 1920

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 1980

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 2040

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 2100

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 2160

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 2220

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 2280

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 2340

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 2400

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 2460

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 2520

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 2580

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 2640

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 2700

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 2760

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 2820

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 2880

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 2940

ctcacatgt 2949

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtagacccca aaagtaaaga agaagataaa cacct 35

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aggtgtttat cttctttact tttggggtct ac 32

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcagcttcag gcaccaccac 20

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgaacttgtg gccgtttacg tcg 23

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccctgcagtt cgagtatgg 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gcagtctgag aaccccagg 19

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cccatcatcg atgtggcacc cttggacgtt ggtgc 35

<210> 33

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcaccaacgt ccaagggtgc cacatcgatg atggg 35