一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法

摘要

本发明公开了一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，包括将间充质干细胞接种到动物源性去细胞角膜基质载体材料上进行定向诱导培养，得到所述人源化活性去细胞角膜基质支架；具体操作步骤包括：步骤一、动物源性去细胞角膜基质载体材料的复水；步骤二、将体外分离培养的1代～4代间充质干细胞接种到步骤一中复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料，然后加入定向诱导培养液，于CO

说明书

技术领域

本发明属于生物角膜材料的组织工程领域，具体涉及一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法。

背景技术

角膜是位于眼球最前端的透明膜，是视光系统重要的屈光介质，它的功能决定了视觉的清晰度。角膜损伤引起的角膜混浊为不可逆改变，严重者可导致永久性视力损伤甚至致盲，目前世界上约有6000万角膜盲患者，其中我国大约有400万，角膜移植术是角膜病致盲患者重要的复明手段。但由于角膜供体材料匮乏，目前我国每年仅能完成约5000例角膜移植手术，而如何获取角膜移植材料成为亟待解决的难题。人工生物角膜的研究是当今国内外眼科学研究的热点，但内皮细胞培养体系的不成熟严重制约全层人工生物角膜的构建。我国目前感染仍是角膜盲的主要原因，而板层角膜移植手术是治疗该病的主要手段，因此异种角膜基质支架研究具有重要的临床意义。

异种角膜基质具有和人角膜接近的光学性能、韧性和组织结构，来源广泛，成为近年来基质支架制备的研究热点。目前，世界首创由我国科学家自主研发的猪去细胞角膜基质支架已上市用于临床板层角膜移植，但因其基质成分是由动物角膜基质细胞分泌合成的，缺乏人源化生物活性，植入后与受体人角膜整合性差，存在排斥反应，甚至可能导致患者病毒感染。研发具备与人体更好相容性的角膜替代物能够有效降低免疫排斥发生的可能，降低病毒感染。

以生物材料作为种子细胞种植于异种角膜移植材料上的新型角膜材料引起人们的广泛关注，常用生物材料包括羊膜、胶原等，CN201019018003中涉及到一种在动物角膜上种植羊膜上皮细胞和羊膜基质细胞的方法，据此所制备的组织工程角膜材料生物相容性能得到提升，但是其力学强度不足，同时由于其缺乏人源角膜构相，移植后角膜透明度不足。

间充质干细胞具有广阔的应用潜能，其中脐带间充质干细胞和角膜间充质干细胞的研究应用更为广泛。人角膜基质间充质干细胞起源于胚胎神经嵴，主要分布于基质边缘前部，具有自我更新和多向分化的潜能，抗原性低，是角膜缘微环境的组成部分。人角膜基质间充质干细胞可以分化为功能性角膜基质细胞，能分泌胶原、细胞因子、粘多糖和角膜蛋白等人源化活性基质成分，改善供、受体角膜基质微环境。人角膜基质间充质干细胞的引入可以进一步扩大现有动物源角膜基质支架材料的来源，同时它所具有的天然角膜结构特征可以进一步遏制临床上角膜移植术后出现的感染、术后排斥以及后发性角膜疾病的发生。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法。该制备方法将间充质干细胞接种到动物源性去细胞角膜基质载体材料上进行定向诱导培养，得到人源化活性去细胞角膜基质支架，该角膜基质支架具有高透明度、强韧性、良好的抗拉性能和生物相容性、有效抗炎和抗排斥性，可以促进角膜移植后供、受体的有机融合。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，包括将间充质干细胞接种到动物源性去细胞角膜基质载体材料上进行定向诱导培养，得到所述人源化活性去细胞角膜基质支架；所述间充质干细胞为人角膜基质间充质干细胞或人脐带间充质干细胞。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，所述定向诱导培养所用的定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液；所述定向诱导培养液中2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸的浓度为0.25mM～1mM，三碘甲状腺素的浓度为0.038nM～0.154nM；所述蛋白添加物为血清替代物、胎牛血清或人血小板裂解液，血清替代物的体积为定向诱导培养液体积的5％～10％，胎牛血清的体积为定向诱导培养液体积的0.5％～0.8％，人血小板裂解液的体积为定向诱导培养液体积的1％～4％。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、对动物源性去细胞角膜基质载体材料进行复水；

步骤二、将体外分离培养的1代～4代间充质干细胞接种到步骤一中复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料上，然后加入定向诱导培养液，于CO₂培养箱中进行定向诱导培养，得到人源化活性去细胞角膜基质支架。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，步骤一中所述动物源性去细胞角膜基质载体材料的制备方法包括以下步骤：

步骤101、将摘取的动物眼球清洗干净；所述动物为鸵鸟或猪；

步骤102、从步骤101清洗后动物眼球上剪取角膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗，之后对冲洗后角膜进行削切；

步骤103、将步骤102削切后的角膜冻融处理1～4次；

步骤104、将步骤103冻融处理后的角膜置于高渗溶液中进行高渗处理，然后对高渗处理后的角膜进行洗涤，将洗涤后的角膜置于无菌去离子水中溶胀，将溶胀后的角膜置于胰酶替代物中振摇消化；

步骤105、对步骤104消化后的角膜进行清洗；

步骤106、对步骤105清洗后的角膜进行干燥处理，对干燥后角膜进行灭菌和保存，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，步骤101中所述清洗为用生理盐水和含妥布霉素300U/mL的生理盐水交替清洗；步骤102中削切后的角膜厚度为200μm～400μm；步骤104中所述高渗溶液为1M～3M的氯化钠溶液，高渗处理的时间为20h～30h，高渗处理的温度为20℃～30℃；所述溶胀的温度为4℃～25℃，溶胀的时间为10h～16h；所述振摇消化的时间为2h，振摇消化的温度为20℃～30℃。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，步骤105中所述清洗的方法为将消化后的角膜置于生理盐水中清洗3次，每次清洗时间为10min，然后将生理盐水清洗后的角膜置于无菌去离子水中清洗3次，每次清洗的时间为10min；或者为将消化后角膜置于PBS缓冲溶液中清洗3次，所述PBS缓冲溶液的pH值为6.8～7.2。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，步骤一中所述复水用溶液为含妥布霉素的无菌生理盐水溶液，所述含妥布霉素的无菌生理盐水溶液中妥布霉素和无菌生理盐水的质量比为1:2000，所述复水的时间为10min～25min。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，步骤二中所述接种的方法为：将间充质干细胞制成细胞浓度为1×10³/μL～1×10⁶/μL的细胞悬液，采用间隔滴注法滴注到动物源性去细胞角膜基质载体材料的两面。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，所述间隔滴注法包括：取50μL所述细胞悬液滴注到动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h。

上述一种人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法，其特征在于，步骤二中所述CO₂培养箱的CO₂体积浓度为5％，定向诱导培养的温度为37℃，培养的时间为2周～8周，每周换液2次。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明的人源化活性去细胞角膜基质支架具有透明度高、韧性好和抗拉性能高等特点，可以促进角膜移植后供、受体的有机融合，修复角膜病变及缺损，同时可以显著降低角膜移植后的排斥反应。

2、本发明的人源化活性去细胞角膜基质支架不仅具有动物源性去细胞角膜基质载体材料特点，同时具有正常人角膜组织的部分特征。通过将间充质干细胞接种到动物源性去细胞角膜基质载体材料上进行定向诱导培养，可以充分利用间充质干细胞能定向分化为功能性细胞的特点得到人角膜组织成分，本发明的角膜基质支架相对于传统的动物源性去细胞角膜基质载体材料具有更高的生物相容性，可促进受损角膜干细胞的增殖分化，促进受损角膜的愈合。

3、本发明采用定向诱导培养液对间充质干细胞进行定向诱导培养，得到的支架材料表面形成了人源化的胶原成分，可以为受体提供良好的移植后微环境，提高抗炎和抗新生血管的能力。

4、本发明的制备方法简单可靠，原料来源广泛，使用方便，此外本发明能有效拓宽角膜移植材料的来源。本发明所制备的人源化活性去细胞角膜基质支架还可作为体外人源化生物角膜研制的支架材料，广泛用于由各种病原微生物、酸、碱、热损伤等原因造成的面积较大、较深的角膜溃疡、角膜穿孔、角膜色素痣和翼状胬肉等切除后的板层移植修补。

下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明实施例1培养的人角膜基质间充质干细胞形成的集落克隆的图片。

图2为本发明实施例1培养的第1代人角膜基质间充质干细胞的图片。

图3为本发明实施例1培养的第1代人角膜基质间充质干细胞的流式细胞仪检测结果。

图4为本发明实施例2所对应的人源化活性去细胞角膜基质支架的透射电子显微镜图片。

图5为本发明实施例2所对应人角膜基质间充质干细胞接种到动物源性去细胞角膜基质载体材料上进行定向诱导一周，于倒置显微镜下的形态的图片。

图6为本发明实施例2所对应人角膜基质间充质干细胞接种到动物源性去细胞角膜基质载体材料上进行定向诱导三周，于倒置显微镜下的形态的图片。

图7为本发明实施例2所得到的人源化活性去细胞角膜基质支架移植前的外观图片。

图8为本发明实施例3所对应的人源化活性去细胞角膜基质支架的透射电子显微镜图片。

具体实施方式

实施例1

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康猪眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为400μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理3次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理15min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在20℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.5M的氯化钠溶液中高渗处理24h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于4℃无菌去离子水中溶胀10h，溶胀后角膜用胰酶替代物在20℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于pH为6.8的PBS缓冲溶液中清洗3次；

对PBS缓冲溶液清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的角膜基质间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，连续培养的时间为7天，解剖显微镜下收集第1代角膜基质间充质干细胞。培养结果见图1和图2。图1显示的为本实施例所培养的人角膜基质间充质干细胞形成的集落克隆，表明细胞生长状况良好。由图2可知本实施例所获得的第1代人角膜基质间充质干细胞具有较高的一致性。

通过流式细胞仪检测收集的第1代角膜基质间充质干细胞CD29、CD44、CD105的表达，同时采用CD34、CD45检测排除造血干细胞的污染；检测HLA-DR抗原表达预测排斥反应。流式细胞仪检测试剂采用异硫氰酸荧光素(FITC)、R-藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠单克隆体，仪器采用美国BD公司ARIA型流式细胞分析仪，LYSYSⅡ系统分析软件，检测结果见图3，结果显示收集的细胞为间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为15min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第1代角膜基质间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10⁴/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为胎牛血清，该定向诱导培养液中胎牛血清的体积为定向诱导培养液体积的0.7％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.08nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养8周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

实施例2

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康鸵鸟眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为200μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理1次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理20min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在30℃条件下，将冻融处理后的角膜置于3.0M的氯化钠溶液中高渗处理20h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于25℃无菌去离子水中溶胀12h，溶胀后角膜用胰酶替代物在30℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于pH为7.2的PBS缓冲溶液中清洗3次；

对PBS缓冲溶液清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的角膜基质间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，每代的连续培养时间为10天，解剖显微镜下收集第2代角膜基质间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为25min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第2代间充质干细胞制成细胞浓度为1×10³/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为胎牛血清，该定向诱导培养液中胎牛血清的体积为定向诱导培养液体积的0.8％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为1mM、三碘甲状腺素的浓度为0.154nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养6周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下(图4)可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致，人源化胶原的厚度约为10μm～20μm。

由图5-图6可以看出，本实施例中接种到动物源性去细胞角膜基质载体材料上的人角膜基质间充质干细胞定向诱导成功，生长良好，由图7可以看出本实施制备得到的人源化活性去细胞角膜基质支架具有高的透明度。

实施例3

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康猪眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为300μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理4次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理10min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在25℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.0M的氯化钠溶液中高渗处理30h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于20℃无菌去离子水中溶胀16h，溶胀后角膜用胰酶替代物在25℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于pH为7.0的PBS缓冲溶液中清洗3次；

对PBS缓冲溶液清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.脐带间充质干细胞的体外分离培养

将常规方法体外分离的人脐带间充质干细胞以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的脐带间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，每代的连续培养时间为8天，解剖显微镜下收集第4代脐带间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为10min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第4代脐带间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10⁶/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为胎牛血清，该定向诱导培养液中胎牛血清的体积为定向诱导培养液体积的0.5％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.25mM、三碘甲状腺素的浓度为0.038nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养2周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

如图8所示，本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致；采用体外培养的人脐带间充质干细胞通过种植、诱导培养于动物源性去细胞角膜基质载体材料上，在透射电镜下可以看到支架表面形成人源化的板层基质胶原。

实施例4

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康鸵鸟眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为400μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理3次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理15min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在20℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.5M的氯化钠溶液中高渗处理24h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于4℃无菌去离子水中溶胀10h，溶胀后角膜用胰酶替代物在20℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于0.9％的生理盐水中清洗3次，每次清洗时间为10min，然后将从0.9％生理盐水中取出的角膜置于无菌去离子水中清洗3次，每次清洗时间为10min；

对无菌去离子水清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的角膜基质间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，每代的连续培养时间为7天，解剖显微镜下收集第2代角膜基质间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为25min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第2代角膜基质间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10³/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为血清替代物，该定向诱导培养液中血清替代物的体积为定向诱导培养液体积的5％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.08nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养8周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

实施例5

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康鸵鸟眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为400μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理3次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理15min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在20℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.5M的氯化钠溶液中高渗处理24h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于4℃无菌去离子水中溶胀10h，溶胀后角膜用胰酶替代物在20℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于0.9％的生理盐水中清洗3次，每次清洗时间为10min，然后将从0.9％生理盐水中取出的角膜置于无菌去离子水中清洗3次，每次清洗时间为10min；

对无菌去离子水清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的角膜基质间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，每代的连续培养时间为7天，解剖显微镜下收集第2代角膜基质间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为25min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第2代角膜基质间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10⁴/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为血清替代物，该定向诱导培养液中血清替代物的体积为定向诱导培养液体积的10％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.08nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养8周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

实施例6

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康鸵鸟眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为400μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理3次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理15min，然后取出置于室温下缓慢溶解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在20℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.5M的氯化钠溶液中高渗处理24h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于20℃无菌去离子水中溶胀10h，溶胀后角膜用胰酶替代物在20℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于0.9％的生理盐水中清洗3次，每次清洗时间为10min，然后将从0.9％生理盐水中取出的角膜置于无菌去离子水中清洗3次，每次清洗时间为10min；

对无菌去离子水清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的角膜基质间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，每代的连续培养时间为10天，解剖显微镜下收集第2代角膜基质间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为25min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第2代角膜基质间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10⁴/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为血清替代物，该定向诱导培养液中血清替代物的体积为定向诱导培养液体积的8％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.154nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养6周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

实施例7

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康猪眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为300μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理3次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理15min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在20℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.5M的氯化钠溶液中高渗处理24h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于20℃无菌去离子水中溶胀16h，溶胀后角膜用胰酶替代物在20℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于0.9％的生理盐水中清洗3次，每次清洗时间为10min，然后将从0.9％生理盐水中取出的角膜置于无菌去离子水中清洗3次，每次清洗时间为10min；

对无菌去离子水清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的角膜基质间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，每代的连续培养时间为7天，解剖显微镜下收集第2代角膜基质间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为25min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第2代间充质干细胞制成细胞浓度为1×10³/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为人血小板裂解液，该定向诱导培养液中人血小板裂解液的体积为定向诱导培养液体积的3％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.08nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养8周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

实施例8

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康猪眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为300μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理3次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理15min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在20℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.5M的氯化钠溶液中高渗处理24h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于4℃无菌去离子水中溶胀10h，溶胀后角膜用胰酶替代物在20℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于0.9％的生理盐水中清洗3次，每次清洗时间为10min，然后将从0.9％生理盐水中取出的角膜置于无菌去离子水中清洗3次，每次清洗时间为10min；

对无菌去离子水清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC>

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为25min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第1代角膜基质间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10⁶/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为人血小板裂解液，该定向诱导培养液中人血小板裂解液的体积为定向诱导培养液体积的1％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.08nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养8周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

实施例9

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.制备动物源性去细胞角膜基质载体材料：

取处死2小时内的健康猪眼球，用生理盐水和含300U/mL的妥布霉素的生理盐水交替清洗，剪下角膜，剪取的角膜上无巩膜，然后将剪取的角膜用含抗生素的生理盐水进行冲洗；无菌条件下对冲洗后角膜进行削切，削切后的角膜厚度为300μm，将削切后的角膜放置于4℃铺有生理盐水纱布的无菌平皿中；

将无菌平皿中的角膜冻融处理3次，冻融处理的具体过程为：将角膜置于-80℃冰箱中冰冻处理15min，然后取出置于室温下缓慢融解，待角膜完全融解即完成一次冻融处理；

在25℃条件下，将冻融处理后的角膜置于1.5M的氯化钠溶液中高渗处理20h，然后用无菌去离子水洗涤3次，每次洗涤时间为10min；将洗涤后角膜置于25℃无菌去离子水中溶胀10h，溶胀后角膜用胰酶替代物在20℃条件下振摇消化2h，将振摇消化后的角膜置于0.9％的生理盐水中清洗3次，每次清洗时间为10min，然后将从0.9％生理盐水中取出的角膜置于无菌去离子水中清洗3次，每次清洗时间为10min；

对无菌去离子水清洗后的角膜进行石蜡包埋组织切片以确认无完整细胞的存在，得到动物源性去细胞角膜基质载体材料；

将得到的动物源性去细胞角膜基质载体材料放置到铺有消毒纱布的平皿中，置于放有无水氯化钙的干燥器内干燥约48小时，干燥期间需将动物源性去细胞角膜基质载体材料翻转一次，以保持载体材料平整；将干燥好的动物源性去细胞角膜基质载体材料密封后用钴60照射进行灭菌处理，将灭菌后动物源性去细胞角膜基质载体材料置于4℃冰箱中冷藏保存。

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC SFM(美国ThermoFisher公司)培养液中进行原代培养，原代培养的时间为7天，待细胞集落直径达50μm～100μm时，用细玻璃管在解剖镜下挑取集落，用含EDTA的0.25％胰酶消化，用细玻璃吸管收集离散的角膜基质间充质干细胞，将细胞以同样密度接种到新的培养皿上，在上述间充质干细胞培养基中传代扩增，每代的连续培养时间为7天，解剖显微镜下收集第4代角膜基质间充质干细胞。

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

对制得的动物源性去细胞角膜基质载体材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为15min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

将收集的第4代角膜基质间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10⁴/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为人血小板裂解液，该定向诱导培养液中人血小板裂解液的体积为定向诱导培养液体积的4％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.038nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养8周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

实施例10

本实施例的人源化活性去细胞角膜基质支架的制备方法包括以下步骤：

1.猪去细胞角膜基质支架的复水

取猪去细胞角膜基质支架(爱欣瞳)，其来源于深圳艾尼尔角膜工程有限公司，对该猪去细胞角膜基质支架(爱欣瞳)材料用妥布霉素和无菌生理盐水质量比为1:2000的溶液进行复水，复水时间为25min，然后将复水后角膜基质载体材料放入4孔培养板上；

2.角膜基质间充质干细胞的体外分离培养

无菌条件下取角膜移植术后剩余的角膜缘组织，用手术刀片去除内皮和上皮组织，将基质组织切成1mm×2mm小块，用含有质量含量为0.5％的胰蛋白酶和0.3％的胶原酶的消化液进行消化处理后得角膜缘基质细胞，以10⁶/μL的细胞浓度，2500cells/cm²的接种密度将细胞接种到60mm的培养皿上，在间充质干细胞培养基试剂盒MSC>

3.制备人源化活性去细胞角膜基质支架

将收集的第1代角膜基质间充质干细胞消化离散后制成细胞浓度为1×10⁴/μL的细胞悬液，用微量注射器取50μL细胞悬液滴注到4孔培养板内复水后的动物源性去细胞角膜基质载体材料的一面，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，然后翻转载体材料，在动物源性去细胞角膜基质载体材料的另一面滴注50μL的细胞悬液，静置0.5h后再次滴注50μL细胞悬液，静置0.5h，加入定向诱导培养液，该定向诱导培养液为添加有2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸、三碘甲状腺素和蛋白添加物的EMEM培养液，其中蛋白添加物为胎牛血清，该定向诱导培养液中胎牛血清的体积为定向诱导培养液体积的0.7％、2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(VC)的浓度为0.4mM、三碘甲状腺素的浓度为0.08nM，于37℃含5％CO₂的培养箱培养；每周换液2次，培养8周，得人源化活性去细胞角膜基质支架；

用pH为7.0的PBS缓冲溶液洗涤制得的人源化活性去细胞角膜基质支架，植入直径为30mm的无菌平皿中，放入含有无水氯化钙的干燥器中干燥，干燥后用钴60辐照灭菌。

本实施例制备的人源化活性去细胞角膜基质支架，在透射电子显微下可以观察到清晰且分布整齐的支架结构，其分泌的人源化胶原排列规整，胶原走向与支架结构一致。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。