一种奥兰丁的制备方法

摘要

本发明公开了一种奥兰丁的制备方法。本发明开发了适合黑曲霉的大米培养基及培养条件，大大提高奥兰丁(P‑orlandin)的产量，然后，采用新的分离纯化方法，使用萃取的方法去掉大部分非奥兰丁的化合物，进一步用中试用加压柱层析系统来进行大量分离，得到纯度>99％的奥兰丁纯化物。此方法极大地提高了黑曲霉中奥兰丁的产量及分离纯化奥兰丁的效率，并且显著的降低了生产成本，同时保证了奥兰丁的生物活性，适合用于对奥兰丁进行大量快速的分离纯化工作。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种奥兰丁的制备方法。

背景技术

黑曲霉菌(Aspergillus niger)广泛存在于粮食作物和土壤中，是一种重要的工业发酵菌株，也是一种比较常见的曲霉属真菌，可以生产包括淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等多种生物产品。最近有作者发现黑曲霉菌(Niu,G.,Wang,B.,Zhang,G.,King,J.B.,Cichewicz,R.H.,Li,J.*，2015.Targeting mosquito FREP1with a fungal metaboliteblocks malaria transmission.Sci.Rep，5,14694.PMID:26437882.)，可以释放一种抑制疟疾传播的化合物奥兰丁，P-orlandin(式1)。这个化合物是在2015年由该研究团队在Scientific Reports上发表。其指出从黑曲霉菌的粗抽提物中分离纯化出来的这一化合物有抑制疟疾在蚊虫中传播的效果。当把含有此化合物的粗提取物或者纯化物加入到人血里，喂食成年母蚊，经七天以后，解剖蚊子中肠，与对照相比(没有加奥兰丁)，发现中肠中疟原虫卵囊的数量极大的降低了，证明此化合物可以抑制疟原虫感染蚊虫，进而抑制其在蚊虫中的传播。其后这篇文章也证明了此化合物对人血红细胞和蚊虫Sau5B细胞没有毒性，综合其数据说明该黑曲霉菌的粗抽提物或者纯化合物可以发展成为有效抑制疟疾在蚊虫传播的生物制剂。奥兰丁能直接抑制疟原虫在蚊虫中的传播，所以其可以直接喷洒到室内或者蚊帐上，通过接触蚊虫进入其体内，从而抑制疟疾的传播。

式1

该文章(Niu et al.,2015)采用了麦片糖水培养基的方法来培养黑霉菌，然后采用了加压小型硅胶玻璃柱层析、制备高效液相色谱和半制备高效液相色谱来分离纯化奥兰丁抗疟疾传播化合物。具体方法为：采用蘑菇袋加入适量的灭菌麦片，再加入适量的含有0.005w/v％的氯霉素和0.3w/v％的灭菌蔗糖的水溶液，接种种黑曲霉菌液，封口后，在室温培养下一个月。然后用乙酸乙酯提取粗抽提物。根据其数据描述，培养三袋蘑菇袋后得到53.8g的粗提物，每个蘑菇袋生产约600g真菌混合物，最终抽提出约18g粗提取物。尽管这篇文章介绍了为了生产此抗疟疾代谢物的黑曲霉菌的培养方法，但是此方法培养时间久，产量低，导致生产成本高。

此文章继续对粗提物进行奥兰丁的分离和提纯。其采用的方法为：粗抽提物先用加压硅胶柱层析先进行分离，采用梯度洗脱，洗脱液依次为甲醇-水(20:80，40:60，60:40，80:20，100:0)和二氯甲烷(50:50)，再用生物方法来测定各个组分的生物活性并收集含有生物活性的组分，再继续用制备液相色谱法进一步分离。其分离得到的半纯化物再用半制备高效液相色谱进行分离，采用梯度洗脱的方法(从含有0.1％甲酸的水：甲醇(10：90)混合物逐步升高至到100％甲醇)分离得到>99％的纯化物。此方法采用了硅胶柱层析分离，制备和半制备高效液相色谱三种方法才得到>99％的纯化物，其中在制备和半制备高效液相分析的步骤，还需对组分进行生物活性的测试。

此方法的缺点有：1)制备和半制备高效液相色谱分离粗抽提物的时间长；2)样品需要进行预处理除掉不溶解的小颗粒才可以进样，对仪器的维护要求也非常高；3)所需要的半制备和制备谱柱以及溶剂等耗材的需要量和花费比较大；4)因为单次上样量较少(半制备色谱柱最多一次上样量最多只有约200mg),导致生产成本昂贵；5)经过多次制备和半制备高效液相色谱柱的分离才能达到一定量的纯化物，仅适合于分离获取<1g纯化物，适用于实验室试验或小试试验的<1g纯化物要求。

但是奥兰丁的应用需要进行室内喷洒试验、中试生产和大量生产，其一次试验至少需要>100g或更多的样品，所以此种方法无法满足要求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种从黑曲霉菌中快速、大量培养及分离纯化制备抗疟疾传播化合物奥兰丁(P-orlandin)的方法，能以更高的效率和更低的成本来快速、大量培养及分离纯化制备抗疟疾传播化合物奥兰丁(P-orlandin)。

本发明的一种奥兰丁的制备方法，包括以下步骤：

a.收集黑曲霉菌，先加入适量甲醇，搅拌，再加入足量甲醇充分抽提，过滤，收集并干燥甲醇提取物，然后加入适量水，振荡制备成水悬液；

b.加入等量的乙酸乙酯进行萃取，弃去水相，蒸干乙酸乙酯，然后再加入适量甲醇，振荡制备成甲醇溶液；

c.加入等量己烷，充分振荡，弃去己烷相，得到奥兰丁半纯化物甲醇溶液；

d.然后用硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯/甲醇v/v，30/1，16/1，8/1，4/1，2/1，1/1，0/1梯度洗脱，每次洗脱为2个柱体积的洗脱液，收集乙酸乙酯/甲醇体积比8/1洗脱的组分，再使用二氯甲烷/甲醇v/v 98/2，96/4，90/10，85/15，80/20继续进行梯度洗脱，每次洗脱为2个柱体积的洗脱液，收集二氯甲烷/甲醇v/v 85/15洗脱的组分，得到奥兰丁。

优选，所述的奥兰丁的制备方法，包括以下步骤：

a.收集黑曲霉菌，先按菌量1倍体积加入甲醇，搅拌，再加入2倍体积甲醇进行抽提，然后再用甲醇抽提2至3次，每次提取1-3h，至提取液从黄色变为无色；过滤，收集并干燥甲醇提取物，然后加入1/5-1/3菌体积的水，振荡制备成水悬液；

b.加入等量的乙酸乙酯进行萃取，弃去水相，蒸干乙酸乙酯，然后再加入1/5-1/3菌体积的甲醇，振荡制备成甲醇溶液；

c.加入等量己烷，充分振荡，弃去己烷相，得到奥兰丁半纯化物甲醇溶液；

d.然后用硅胶柱层析分离，使用乙酸乙酯/甲醇v/v，30/1，16/1，8/1，4/1，2/1，1/1，0/1梯度洗脱，每次洗脱为2个柱体积的洗脱液，收集乙酸乙酯/甲醇体积比8/1洗脱的组分，再使用二氯甲烷/甲醇v/v 98/2，96/4，90/10，85/15，80/20继续进行梯度洗脱，每次洗脱为2个柱体积的洗脱液，收集二氯甲烷/甲醇v/v 85/15洗脱的组分，得到奥兰丁。

优选，所述的黑曲霉菌是通过以下方法制备得到的：

接种黑曲霉发酵液至大米培养基，在无菌环境下培养，培养条件为12h光照/12h黑暗、空气相对湿度为70±2％、温度为19-37℃，保持大米培养基含水量在70-80％，适时收集黑曲霉菌。

优选，所述的黑曲霉发酵液是通过以下方法制备得到的：

将黑曲霉接种至麦芽液体培养基中进行发酵，25～28℃，发酵至稳定期终止发酵，得到发酵液；所述的麦芽液体培养基：每升含有麦芽提取物10g、酵母提取物1g、氯霉素0.05g，余量为蒸馏水；pH 7.2-7.4。

优选，所述的大米培养基，是将籼米经常规高温灭菌，然后放入50℃干燥箱干燥1小时制备得到的。

优选，所述的接种是按照400mL黑曲霉发酵液：600g大米培养基的比例，接种黑曲霉发酵液至大米培养基。

优选，所述的黑曲霉培养温度为22-28℃。

优选，所述的适时收集黑曲霉菌是在大米培养基上培养7天后，按照100mL麦芽液体培养基：600g大米培养基的比例再加入麦芽液体培养基，再培养7天后，收集黑曲霉菌。

本发明提出了一种通过培养黑曲霉(Aspergillus niger)并高效、大量分离纯化抗疟疾传播化合物奥兰丁(P-orlandin)用于中试测试的新方法，首先，开发了适合本发明黑曲霉的大米培养基及培养条件，大大提高奥兰丁(P-orlandin)的产量，然后，采用新的分离纯化方法，采取萃取的方法去掉大部分非奥兰丁的化合物，进一步用中试用加压柱层析系统来进行大量分离，得到纯度>99％的奥兰丁纯化物。此方法极大的提高了黑曲霉的奥兰丁产量及分离纯化奥兰丁的效率，并且显著的降低了生产成本。

本发明的黑曲霉菌(Aspergillus niger)已于2015年10月6日公开于非专利文献Niu,G.,Wang,B.,Zhang,G.,King,J.B.,Cichewicz,R.H.,Li,J.*，2015.Targetingmosquito FREP1with a fungal metabolite blocks malaria transmission.Sci.Rep，5,14694.PMID:26437882.，该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。

附图说明

图1是对加压柱层析分离得到的组分Fr.3D使用液相高效色谱分析得到的色谱图。在保留时间6.82分钟时出现一个吸收峰，经过计算此峰的面积占总吸收峰的面积>99％，证明此化合物的纯度达到>99％。

图2是对加压柱层析分离得到的组分Fr.3D使用液相高效色谱分离得到的化合物的质谱分析图。对在保留时间6.82分钟时分离得到的化合物进行质谱分析，使用ESI作为离子源，采用负离子模式，发现一个m/z 409.15的信号，经过和已经公开发布的奥兰丁的质谱图相比，完全一致，可以证明此化合物为奥兰丁(P-orlandin)。

图3是含有奥兰丁的粗抽提物抑制疟原虫在蚊虫中传播效果，图中的每个点，代表每个蚊虫中肠内的疟原虫卵囊的数量。

图4是分离的奥兰丁纯化物抑制疟原虫在蚊虫中传播效果，图中的每个点，代表在每个蚊虫中肠内的疟原虫卵囊的数量。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例中所用到的试剂来源说明：

麦芽提取物、酵母提取物、琼脂粉购自北京双旋微生物培养基制品厂；产地：北京；氯霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；产地：上海。

麦片是购自General Mills,Inc.的Cheerios Gluten Free Breakfast Cereal，产地：Minneapolis,Minnesota,United States。

用于加压柱层析的硅胶由青岛海洋化工有限公司生产；产地：山东省青岛市；目数：200-300；粒度：45-75μm，比表面积：600-800m²/g；孔体积：0.35-0.45ml/g。

所使用的化学试剂包括甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯等全部为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；产地：上海。

所使用的籼米是湖南金健米业股份有限公司的金健银针米；产地：湖南岳阳。

所使用的真空旋转蒸发仪系统是YRE-5299型旋转蒸发器、CCA-20迷你型低温冷却液循环泵及SHZ-D(III)防腐双表双抽循环水真空泵，均产自巩义市予华仪器有限责任公司；产地：河南巩义市。

以下实施例中所采用的麦芽琼脂固体培养基：每升含有麦芽提取物10g、酵母提取物1g、氯霉素0.05g、琼脂粉15g，余量为蒸馏水；调节pH值在7.2-7.4，121℃灭菌20分钟，待培养基温度降低到50℃，将培养基倒入到无菌培养皿中。

所采用的麦芽液体培养基：每升含有麦芽提取物10g、酵母提取物1g、氯霉素0.05g，余量为蒸馏水；调节pH值在7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。

实施例1：生产奥兰丁的黑曲霉的培养方法1

1.培养黑曲霉

将麦芽琼脂固体培养基上培养的黑曲霉接种2～3环到麦芽液体培养基中，25-28℃，150rpm振荡培养3天，作为种黑曲霉。将种黑曲霉接种至麦芽液体培养基中进行发酵5-7天，发酵温度为25～28℃，发酵至黑曲霉稳定期终止发酵，得到发酵液。

大米培养基培养：将灭菌后的不锈钢盘内的大米培养基放入无菌室的的架子上，倒入400mL的发酵液，大米培养基中含水量在70-80％，在无菌室内培养。保持室内光照为12h光照/12h黑暗，空气相对湿度为70±2％，温度为25-28℃。培养7天后，加入100mL麦芽液体培养基，再培养7天后，(总培养14天后)收集生长在大米培养基上的真菌，倒入10L的不锈钢锅。所述的大米培养基：大米选用籼米，其含有7.2％蛋白质、75％碳水化合物和0.6％脂肪。将籼米放入不锈钢盘，盖好，121℃灭菌20分钟，然后放入50℃干燥箱干燥1小时。根据不锈钢盘子的大小来放入适当的大米培养基。其比例为：采用60cmX50cmX12cm(长X宽X高)的不锈钢盘，加入600g大米培养基，铺匀并完全覆盖盘底。

2.含有奥兰丁的粗抽提物及其生物活性检测

收集培养的真菌黑曲霉，然后用乙酸乙酯抽提，干燥，得到含有奥兰丁的粗抽提物。

以文章(Niu et al.,2015)中的相关数据为对比例1。

利用本方法得到的粗抽提物的产量为：12g/100g大米培养基，比对比例1使用麦片糖水培养基的粗抽提物的产率(约3g/100g)约提高了4倍，其生产时间从一个月缩短至14天，生产成本从10元/g粗抽提物减少到1元/g粗提物。经检测，本实施例粗抽提物其中的奥兰丁(P-orlandin)在粗抽提物内的含量达到2g/kg，是对比例1所用方法得到的粗抽提物(1g/kg)的2倍。

当把本实施例制备的含有奥兰丁(P-orlandin)的粗抽提物以(0，20，100μg/mL)的浓度加入到人血里，然后喂成年母蚊子，七天以后，解剖蚊子的中肠，用0.1％的mercurydibromofluresein disodium salt染色剂染色，在光学显微镜下检查蚊虫中肠内的疟原虫(Plasmodium falciparum)卵囊的数量。与对照相比(没有加粗抽提物)，每个中肠中的疟原虫卵囊(Plasmodium falciparum)的数量分别降低了81％和98％，疟原虫的感染率分别降低了24％和68％(图3)，证明此粗抽提物含有抑制疟原虫感染蚊虫的有效物质奥兰丁。

实施例2：生产奥兰丁的黑曲霉的培养方法2

其他方法步骤及培养条件均与实施例1的培养黑曲霉相同，不同的是在大米培养基上22-24℃培养，培养14天后，粗抽提物的产率为11-13g/100g大米培养基。

实施例3：生产奥兰丁的黑曲霉的培养方法3

其他方法步骤及培养条件均与实施例1的培养黑曲霉相同，不同的是在大米培养基上19-21℃培养，培养14天后，粗抽提物的产率为5-9g/100g大米培养基。

实施例4：生产奥兰丁的黑曲霉的培养方法4

其他方法步骤及培养条件均与实施例1的培养黑曲霉相同，不同的是在大米培养基上29-32℃培养，培养14天后，粗抽提物的产率为5-8g/100g大米培养基。

实施例5：生产奥兰丁的黑曲霉的培养方法5

其他方法步骤及培养条件均与实施例1的培养黑曲霉相同，不同的是在大米培养基上33-37℃培养，培养14天后，粗抽提物的产率为5-8g/100g大米培养基。

其他对比例：

(1)温度条件

对比例2：其他方法步骤及培养条件均与实施例1的培养黑曲霉相同，不同的是在大米培养基上15-18℃培养，培养14天后，粗抽提物的产率为2-3g/100g大米培养基。

(2)湿度条件

空气相对湿度保持在70±2％效果最好，低于或高于此湿度，都会使粗抽提物的产率下降。

(3)无菌室的使用

对比例1没有使用恒温恒湿的无菌室来生长黑曲霉菌，而是放置在灭菌的蘑菇袋内。此蘑菇袋带有一个约2cmX2cm大小，孔径为0.5μm的过滤膜，这种膜可以阻止真菌进入蘑菇袋，防止造成污染。发明人在研究过程中发现奥兰丁此代谢物的合成和释放与蘑菇袋内的氧气有直接的正相关关系，蘑菇袋内的不能提供足够的氧气使此代谢物大量合成和释放。本发明方法直接在恒温恒湿的无菌室来生长黑曲霉菌，并且使用不锈钢盘装大米培养基，使黑曲霉菌直接暴露在空气中培养，保证了其有足够的氧气。而且，本方法在培养7天后加入麦芽液体培养基，保证了大米培养基始终处于一个大约70-80％含水量的状态，这样是最适合黑曲霉菌的生长的。

实施例6：奥兰丁的分离纯化方法

1.奥兰丁的分离纯化

将麦芽琼脂固体培养基上培养的黑曲霉接种2～3环到50mL麦芽液体培养基中，23-25℃，150rpm振荡培养7天，作为种黑曲霉菌液。

向蘑菇袋内加入550mL的灭菌麦片，再加入800mL含有0.005w/v％的氯霉素和0.3w/v％灭菌蔗糖的水溶液，将上述种黑曲霉菌液和氯霉素蔗糖水溶液倒入60cmX40cmX10cm(长X宽X高)的蘑菇袋中，封口后，在21-25℃培养一个月。

收集一个蘑菇袋里的真菌，约600g，倒入10L的不锈钢锅。先加入600mL的甲醇，采用破碎机把菌打碎，再加入1200mL的甲醇，室温放置三个小时后，采用布式漏斗过滤掉不溶于甲醇的物质，收集甲醇提取物，然后用真空旋转蒸发仪系统(型号：YRE-5299型旋转蒸发器，CCA-20迷你型低温冷却液循环泵，SHZ-D(III)防腐双表双抽循环水真空泵)干燥，最后加入200mL的水，振荡30分钟后制备成水悬液。当需要大量萃取时候，按同样的方法和溶剂比例来处理更多的真菌。同样方法继续提取2次，至提取液从黄色变为无色。

合并所有水悬液，加入等量(600mL)的乙酸乙酯对奥兰丁进行萃取，弃去水相(去除掉溶解于水的非奥兰丁物质)，用旋转蒸发仪对乙酸乙酯相进行蒸干，最后再加入600mL的甲醇，振荡30分钟后制备成甲醇溶液。当处理大量样品的时候，按同样的方法和比例扩大溶剂量来进行萃取。

加入等量(600mL)的己烷，振荡3个小时，弃去己烷相(去除掉溶解于己烷的非奥兰丁极性较低的物质)，用旋转蒸发仪对甲醇相进行蒸干，得到奥兰丁半纯化物。重新用甲醇溶解得到300mg/mL的奥兰丁半纯化物溶液。当处理大量样品的时候，按同样的方法和比例扩大溶剂量来进行萃取。

采用中试用加压柱层析分离系统继续分离纯化。层析柱直径为200mm，高度为2000mm，高径比为10；层析柱材质为304不锈钢，设计压力为0.6mPa，填充200-300目硅胶。加压系统采用氮气，氮气钢瓶内的氮气由专门的阀门来控制溶剂和分离柱的压力。检测系统采用紫外-可见光检测器(UV-Vis Detector C-640，BUCHI公司产)的在线自动检测系统。对前述的300mg/mL的奥兰丁半纯化物溶液进行梯度洗脱。

首先使用乙酸乙酯/甲醇v/v，30/1，16/1，8/1，4/1，2/1，1/1，0/1梯度洗脱，每次使用2个柱体积的洗脱液，收集乙酸乙酯/甲醇体积比8/1洗脱的组分，命名为Fr.3，经过薄板层析，使用展开剂为二氯甲烷/甲醇(v/v 8.5：1.5)展开，其主要化合物的Rf为6.8，和对照化合物(p-奥兰丁)的Rf值相同，使用旋转真空蒸发仪蒸干组分。进而继续用硅胶柱层析分离Fr.3，使用二氯甲烷/甲醇v/v 98/2，96/4，90/10，85/15，80/20继续进行梯度洗脱，每次使用2个柱体积的洗脱液，并且根据在254nm下检测到的主要紫外吸收峰来收集组分，最后依次收集到五个组分Fr.3A-Fr.3E，每个组分含有一个主要化合物，对每个组分的化合物进行LC-MS分析，根据其分子量的大小，最终发现组分Fr.3D(对应为使用二氯甲烷/甲醇v/v85/15洗脱的组分)含有奥兰丁，经检测可以得到纯度>99％的奥兰丁化合物。根据图1的液相图谱的结果，组分Fr.3D在保留时间6.82分钟出现一个单一吸收峰，考虑到保留时间在1分钟内出现的吸收峰为溶剂峰(其在空白溶剂对照组中也出现)，在保留时间6.82分钟出现的吸收峰的面积占全部吸收峰的面积为99.2％，这就可以说明组分Fr.3D中的化合物的纯度达到99.2％。用质谱来进一步分析这个化合物，其结果见图2。质谱分析使用电喷雾离子源(ESI)，选择负离子模式时，扫描m/z 150-2000范围内，发现一个相对强度较高的信号，其m/z值为409.15，考虑到采取的负离子模式，其预测的分子量为410.15，其结果和Niu et al2015年发表的论文结果一致，所以可以确定在组分Fr.3D纯化出的化合物为奥兰丁(P-orlandin)。LC-MS使用的液相色谱/离子阱多级质谱联用仪为：高效液相色谱仪；生产厂家：Agilent Technologies,INC.；；产地：Santa Clara,CA，USA；型号：Agilent 1220。离子阱多级质谱仪生产厂家：Bruker Daltonics布鲁克·道尔顿；产地：Germany；型号：amaZon SL。液相色谱使用的色谱分析柱为：生产厂家：Phenomenex；产地：Torrance，CA,USA；品牌：Kinetex；型号：75X3mm,2.6μm C18。液相色谱采用流动相溶剂甲醇：水v/v(10:70–100:0)梯度洗脱,流速为1mL/min。质谱采用电喷雾离子源(ESI)，选择负离子模式。

中试用加压层析分离系统可以一次上样量达到500g(mL)，如果需要增加上样量，还可以再连接几个同样的层析柱，就可以达到处理更多样品的需求。而且还可以采用自动上样和自动分离组分收集系统，以达到更高的效率和更大的奥兰丁生产规模。

以文章(Niu et al.,2015)中的相关数据为对比例1。

本实施例的奥兰丁分离纯化方法相较于对比例1的分离纯化奥兰丁的方法具有更好的效果，具体表现如下：

(1)本方法用甲醇为起始的抽提溶剂相对于对比例1的用乙酸乙酯作为抽提溶剂，每一袋蘑菇袋比使用乙酸乙酯作为溶剂可以多获得2.5g的粗抽提物。

(2)本方法继续用乙酸乙酯作为萃取剂来萃取在水中的溶解的和不溶的奥兰丁，这样就可以去除大部分水溶性的非奥兰丁物质，根据前后的对比发现，该步骤可以去除掉30％的极性较高的非奥兰丁物质。

(3)本方法进一步用己烷萃取去除掉另外50％极性较小的非奥兰丁物质，这样2次萃取之后，可以从粗抽提物中去除>80％的非奥兰丁物质。

(4)经过萃取以后，得到含有纯度>80％的奥兰丁半纯化物；然后再通过本方法开发的分离条件，使用中试用加压硅胶层析柱经过两次分离，可以得到纯度>99％的奥兰丁纯化物。本方法可以使从真菌中提取奥兰丁纯化物的产量从32mg/g粗提取物，提高至62mg/g粗提取物。

本方法使用硅胶层析柱，并且采用了不同的溶剂系统对经过萃取后纯度>80％的奥兰丁半纯化物进行了分离效果研究。为了研究适合的溶剂系统，首先先采用薄板层析法，对多种不同的溶剂系统的分离效果进行了比较，然后采用分离效果比较好的几种溶剂作为硅胶柱层析的溶剂，继续分析不同的溶剂比例进行梯度分离的效果，其分离结果包括产量和纯度如表1所示。

表1使用不同溶剂系统纯化分离得到的奥兰丁的产量和纯度

基于对奥兰丁产量和纯度的综合比较，选用表1中的序号F的溶剂系统对半纯化的粗提物经行分离纯化，最终可以从1000g粗抽提物分离纯化出62g纯度>99％的奥兰丁化合物。

(5)本方法适宜于大量或较大量提取。本方法使用了萃取方法加硅胶分离系统，可以一次处理多达几吨或更多的样品，从而可以一次得到>1000g奥兰丁纯化物，在分离方法基本不变的情况下，其硅胶分离系统还可以升级为处理更多样品的工业级别硅胶层析柱分离系统，可以满足工业化生产奥兰丁的目的。本方法不需要使用高效液相色谱作为分离方法，节省了>85％的时间和>95％的费用。

(6)本实施例的分离方法所使用的设备，溶剂和分离条件对奥兰丁的生物活性没有任何负面影响。

2.纯化物的生物活性检测

分离出的纯度>99％的奥兰丁纯化物，以(0，1，3，8μg/mL)的浓度加入到人血，喂食成年母蚊，七天以后，解剖蚊子的中肠，用0.1％的mercury dibromofluresein disodiumsalt染色剂染色，在光学显微镜下检查蚊虫中肠内的疟原虫(Plasmodium falciparum)卵囊的数量。其结果发现(图4)，和对照相比(0μg/mL纯化物)，添加奥兰丁纯化物1，3，8μg/mL的中肠中的疟原虫卵囊的数量分别降低了69.5％、91％和98％，疟原虫的感染率分别降低了25.9％、52.1％和68.9％，此结果和对比例1的结果一致。此结果证明，分离的奥兰丁纯化物可以有效的抑制疟原虫在蚊虫中的传播。

实施例7：高效的培养黑曲霉及分离纯化奥兰丁的方法

按照实施例1或实施例2的方法培养黑曲霉，收集黑曲霉，然后再利用实施例6的奥兰丁的分离纯化方法，高效的大量制备获得纯度>99％的奥兰丁纯化物。