法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-01-14
授权
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2018-11-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/6895 申请日:20180705
实质审查的生效
2018-10-23
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎的分子特异性标记引物及检测方法，用于木槿品种的鉴定。
背景技术
木槿隶属于锦葵科（Malvaceae）木槿属（Hibiscus），是世界著名的园林观赏植物。目前已知木槿品种有200多个，因其株型优美、花色艳丽、整个花期延续期长，在园林上有极大的应用价值。目前，在全球范围内，对木槿属树种的研究与栽培主要集中在观赏资源。近年来，人们开始重视作为食用花卉和天然食物着色剂及其他用途的潜在新资源的研究。在食用花卉的新品种选育和栽培方面，国外有专门种植食用鲜花的农场与农户，如法国布列塔尼亚的托尔地区由一百多位花农组成的市场园艺家合作社，专门改良、培育食用花卉新品种，产品除在当地消费外，有近半销售到美国等地。
我国木槿属植物资源丰富，分布广泛，木槿具有较强的抗寒性及适应型强等特点，在全国各地均有栽培。且木槿属植物表型具有较强可塑性，种间杂交容易，品种数量众多，有些品种间性状差异较小，传统形态分类很难快速、准确有效评价与区分。学术界对目前种植木槿品种的名称和描述比较混乱，“同物异名”或“同名异物”现象较为严重，缺乏统一规范的名称及科学系统的分类体系，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此亟需建立一个科学合理的木槿品种分类鉴定系统。
目前，木槿品种辨别主要依据传统的形态学特征：花色、花冠直径、花梗长度和果实长度比，同时结合流式细胞术、电镜扫描花粉粒和Q型聚类分析等方法，这些方法尽管有用，但受发育阶段和数量的限制，很难对木槿品种进行快速准确的鉴定和应用。尤其当叶、花和果实等脱离母株后，品种无性系或种源在形态上则区别难度更大，加之木槿无性繁殖较容易，如申请号为200710190933.1的中国专利，难免出现品种偷盗和假冒良种等行为发生。而近年来已广泛应用的DNA分子标记技术尚未在木槿品种分类、品种间亲缘关系及遗传多样性等研究上得以广泛应用。因此，有必要利用分子标记技术手段，对木槿品种进行科学鉴别，不仅有助于木槿品种分类鉴定系统的建立，也为木槿属植物资源的进一步研究提供分子依据。
近年来，我国引进韩国、日本等地木槿新品种和类型达100多个，在全国各地广泛种植，观赏和食用价值极高。经过长期的调查工作，我们发现20个木槿花品种包括布里克（Hibiscussyriacus‘Bricutts’）、海琳（Hibiscussyriacus‘Helene’）、诺伍德一号（Hibiscussyriacus‘Notwoodone’）、奥苏蓝（Hibiscussyriacus‘OiseauBleu’）、弗洛吉（Hibiscussyriacus‘Flogi’）、红心（Hibiscussyriacus‘RedHeart’）、弗洛鲁（Hibiscussyriacus‘Floru’）、木桥（Hibiscussyriacus‘Woodbridge’）、桑乔约（Hibiscussyriacus‘Sanchoyo’）、哈玛布（Hibiscussyriacus‘Hamabo’）、奇异（Hibiscussyriacus‘Monstrosus’）、白花单瓣（Hibiscussyriacus‘TotusAlbus’）、天蓝（Hibiscussyriacus‘Coelestis’）、鸮鹦鹉（Hibiscussyriacus‘Kakapo’）、阿登（Hibiscussyriacus‘Ardens’）、哈玛布（Hibiscussyriacus‘Hamabo’）、露西（Hibiscussyriacus‘Lucy’）、敏柔莎（Hibiscussyriacus‘Minrosa’）、诺伍德二号（Hibiscussyriacus‘Notwoodtwo’）、芍花（Hibiscussyriacus‘Paeonyflorus’）在园林中的应用极其广泛，但这些品种的“同名异物”、“同物异名”现象也异常严重，从表型特征方面很难鉴别，给园林植物应用、推广以及新品种选育带来很多困难，因此着力从分子水平上开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实现木槿品种准确快速鉴定的科学途径。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎的分子特异性标记引物，以及利用该引物对木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎进行快速鉴定的方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎的分子特异性标记引物，其特征在于，所述分子特异性标记引物包括上游引物和下游引物，所述分子特异性标记引物序列如下：
上游引物：5′-AAGATACACTGGAATAGAACA-3′；
下游引物：5′-GAATTCACGCTTCGATGCTCA-3′。
上述分子特异性标记引物是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该特异性引物对木槿品种进行PCR扩增，仅奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎不可获得190bp大小的特异性片段，其他木槿品种均能获得190bp大小的特异性片段。需要说明的是，本发明中的分子特异性标记引物仅限于木槿品种的鉴定，鉴定其是否为奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎，即待测样品仅限于木槿。
一种木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎的检测方法，其特征在于，利用上述木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎的分子特异性标记引物，所述检测方法如下：提取待测木槿品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，对提取的木槿品种叶片的基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果仅出现500bp的特异DNA条带，则待测木槿品种为奥苏蓝、弗洛鲁、阿登和/或敏柔莎，，若电泳结果同时出现500bp和190bp的DNA条带则否。
上述检测方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，操作过程均可按照本领域常规方法进行。
所述PCR反应体系组成如下：
PCR Buffer：终浓度为1×
dNTPs：1>
MgCl2：2.5>
Taq DNA酶：1.0 U/反应；
上、下游引物：各0.4 μM；
模板DNA：60 ng/反应；
余量为ddH2O。
所述PCR扩增条件如下： 95℃预变性2.5-3.5 min；95℃变性35-45 s，58℃退火35-45 s，72℃延伸0.5-1.5 min，共30-40个循环；最后于72℃补平6-8 min，终止温度为3-5℃。
PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR Buffer。10×PCR Buffer成分为：100 mM Tris-HCl（pH 8.5）、500 mM KCl、25 mM MgCl2和1.0%>2O。
所述检测方法步骤如下：
第一步：取待测木槿叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测木槿叶片的基因组DNA；
第二步：以第一步提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR扩增体系每25μL中各组分如下：
10×PCR Buffer：2.5μL；
10 mmol/L dNTPs：2.5μL；
25 mmol/L MgCl2：2.5μL；
5 U/μL Taq DNA酶：0.2μL；
10 μM上游引物：1μL；
10 μM下游引物：1μL；
20 ng/μL模板DNA：3μL；
ddH2O补足至25μL。
PCR扩增条件如下：95℃预变性3 min；95℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1min，共35个循环；最后于72℃补平7 min，终止温度为4℃；
第三步：取第二步的扩增产物5μL，与1μL 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上进行拍摄，若电泳结果仅出现500bp的特异DNA条带，则待测木槿品种为奥苏蓝、弗洛鲁、阿登和/或敏柔莎，，若电泳结果同时出现500bp和190bp的DNA条带则否。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明分子特异性标记引物可对木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别木槿品种所不能替代的分子手段。
附图说明
图1是本发明实施例中对木槿品种进行PCR扩增的结果图。
图中：M为DNA分子量标准；编号4，7，15，18为木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎扩增出了分子量约为500bp的特异DNA条带；而其余编号的木槿品种均扩增出分子量为500bp和190 bp两条DNA条带。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1。
（1）木槿品种基因组DNA的提取：
取待测木槿品种幼嫩叶片0.01 g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得木槿品种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化（博日Bioer，杭州，中国）后，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计（GeneQuant Pro，GE Healthcare）来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
（2）设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
上游引物：5′-AAGATACACTGGAATAGAACA-3′；
下游引物：5′-GAATTCACGCTTCGATGCTCA-3′；
生工生物工程（上海）股份有限公司。
（3）SCAR分子标记的PCR扩增：
PCR反应液组成：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2.5 μL，25 mmol/LMgCl2>2O>
扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：95℃预变性3 min；95℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后于72℃补平7 min，终止温度为4℃。
（4）电泳检测：取步骤（3）PCR扩增产物5μL，与1μL 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5 μg/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在GELl-DOC2000凝胶成像分析仪上拍摄。
按照上述方法，分别对20个木槿花品种（编号1-20代表木槿品种依次为：1、布里克（Hibiscus>）、2、海琳（Hibiscus>）、3、诺伍德一号（Hibiscus>）、4、奥苏蓝（Hibiscus>）、5、弗洛吉（Hibiscus>）、6、红心（Hibiscus>）、7、弗洛鲁（Hibiscus>）、8、木桥（Hibiscus>）、9、桑乔约（Hibiscus>）、10、哈玛布（Hibiscus>）、11、奇异（Hibiscus>）、12、白花单瓣（Hibiscus>Albus’）、13、天蓝木槿（Hibiscus>）、14、鸮鹦鹉木槿（Hibiscus>syriacus>）15、阿登（Hibiscus>）、16、哈玛布（Hibiscus>syriacus>）、17、露西（Hibiscus>）、18、敏柔莎（Hibiscus>syriacus>）、19、诺伍德二号（Hibiscus>）、20、芍花（Hibiscus>））的PCR扩增图谱进行电泳检测，结果参见图1。
其中从编号分别为4，7，15，18的木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎中仅扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为500 bp多大小的特异DNA条带，而其余编号的木槿品种均扩增出分子量为500bp和190 bp两条DNA条带。
实施例2。
（1）木槿品种基因组DNA的提取：
取待测木槿品种幼嫩叶片0.02 g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得木槿品种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化（博日Bioer，杭州，中国）后，通过1.8%的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计（GeneQuant Pro，GE Healthcare）来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-22℃冰箱贮藏备用。
（2）设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
上游引物：5′-AAGATACACTGGAATAGAACA-3′；
下游引物：5′-GAATTCACGCTTCGATGCTCA-3′；
生工生物工程（上海）股份有限公司。
（3）SCAR分子标记的PCR扩增：
PCR反应液组成：10×PCR Buffer 2.6 μL，10 mmol/L dNTPs 2.6 μL，25 mmol/LMgCl2>2O>
扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：95℃预变性3.5 min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1.5min，共40个循环；最后于72℃补平8min，终止温度为5℃。
（4）电泳检测：取步骤（3）PCR扩增产物5μL，与1μL 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.8%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5 μg/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在GELl-DOC2000凝胶成像分析仪上拍摄。
按照上述方法，分别对20个木槿花品种（编号1-20代表木槿品种依次为：1、布里克（Hibiscus>）、2、海琳（Hibiscus>）、3、诺伍德一号（Hibiscus>）、4、奥苏蓝（Hibiscus>）、5、弗洛吉（Hibiscus>）、6、红心（Hibiscus>）、7、弗洛鲁（Hibiscus>）、8、木桥（Hibiscus>）、9、桑乔约（Hibiscus>）、10、哈玛布（Hibiscus>）、11、奇异（Hibiscus>）、12、白花单瓣（Hibiscus>Albus’）、13、天蓝木槿（Hibiscus>）、14、鸮鹦鹉木槿（Hibiscus>syriacus>）15、阿登（Hibiscus>）、16、哈玛布（Hibiscus>syriacus>）、17、露西（Hibiscus>）、18、敏柔莎（Hibiscus>syriacus>）、19、诺伍德二号（Hibiscus>）、20、芍花（Hibiscus>））的PCR扩增图谱进行电泳检测。
其中从编号分别为4，7，15，18的木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎中仅扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为500 bp多大小的特异DNA条带，而其余编号的木槿品种均扩增出分子量为500bp和190 bp两条DNA条带。
实施例3。
（1）木槿品种基因组DNA的提取：
取待测木槿品种幼嫩叶片0.01 g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得木槿品种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化（博日Bioer，杭州，中国）后，通过1.6%的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计（GeneQuant Pro，GE Healthcare）来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-18℃冰箱贮藏备用。
（2）设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
上游引物：5′-AAGATACACTGGAATAGAACA-3′；
下游引物：5′-GAATTCACGCTTCGATGCTCA-3′；
生工生物工程（上海）股份有限公司。
（3）SCAR分子标记的PCR扩增：
PCR反应液组成：10×PCR Buffer 2μL，10 mmol/L dNTPs 2μL，25 mmol/L MgCl2>2O补足至25>
扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：95℃预变性2.5 min；95℃变性35s，58℃退火35s，72℃延伸0.5min，共30个循环；最后于72℃补平6min，终止温度为3℃。
（4）电泳检测：取步骤（3）PCR扩增产物5μL，与1μL 0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.6%的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5 μg/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在GELl-DOC2000凝胶成像分析仪上拍摄。
按照上述方法，分别对20个木槿花品种（编号1-20代表木槿品种依次为：1、布里克（Hibiscus>）、2、海琳（Hibiscus>）、3、诺伍德一号（Hibiscus>）、4、奥苏蓝（Hibiscus>）、5、弗洛吉（Hibiscus>）、6、红心（Hibiscus>）、7、弗洛鲁（Hibiscus>）、8、木桥（Hibiscus>）、9、桑乔约（Hibiscus>）、10、哈玛布（Hibiscus>）、11、奇异（Hibiscus>）、12、白花单瓣（Hibiscus>Albus’）、13、天蓝木槿（Hibiscus>）、14、鸮鹦鹉木槿（Hibiscus>syriacus>）15、阿登（Hibiscus>）、16、哈玛布（Hibiscus>syriacus>）、17、露西（Hibiscus>）、18、敏柔莎（Hibiscus>syriacus>）、19、诺伍德二号（Hibiscus>）、20、芍花（Hibiscus>））的PCR扩增图谱进行电泳检测。
其中从编号分别为4，7，15，18的木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎中仅扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为500 bp多大小的特异DNA条带，而其余编号的木槿品种均扩增出分子量为500bp和190 bp两条DNA条带。
虽然本发明以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
<110> 浙江省林业科学研究院
<120> 木槿品种奥苏蓝、弗洛鲁、阿登、敏柔莎的分子特异性标记引物及检测方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
aagatacact ggaatagaac a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
gaattcacgc ttcgatgctc a 21
