2-(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基噻唑啉-4-酮在制药中的应用

摘要

本发明公开了2‑[(4‑叔丁基噻唑‑2‑基)亚氨基]噻唑啉‑4‑酮在制备抑制和杀伤变形链球菌模式菌株药物或在制备抑制变形链球菌模式菌株生物膜的形成药物中的应用。实验证实本发明的化合物对浮游状态下的变形链球菌模式菌株呈现出良好的抑菌活性和杀菌活性，且当培养基中化合物终浓度达到4mg/L时对变形链球菌生物膜的抑制率达到99％以上。本发明的化合物可以作为预防龋齿的新型先导化合物，在制备口腔变形链球菌生物膜抑制剂方面应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及一种噻唑类化合物的应用，尤其涉及一种2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在制备抑制和杀伤变形链球菌(Streptococcus mutans)类药物中的应用。

背景技术

龋齿俗称虫牙、蛀牙，其特点是牙釉质、牙本质脱矿和有机质的分解，属于细菌诱发的一种世界范围内的慢性疾病，在青少年和儿童中尤其常见。由于其发病率高、流行范围广等特点，龋齿现已成为严重危害人类身体健康的主要口腔疾病之一(Pitts,2004)。正常情况下，口腔中的微生物在牙齿表面处于一种相对稳定的生理平衡状态，一旦这种平衡被打破就会引发龋齿(Selwitz et al.,2007)。在龋齿的形成过程中，变形链球菌(Streptococcus mutans)起着至关重要的作用。变形链球菌能够代谢碳水化合物产生大量的酸类物质，同时自身又能够在低pH的酸性环境中存活。除此之外，变形链球菌能够通过产生葡聚糖转移酶将口腔内残留的蔗糖转变为葡聚糖。葡聚糖很容易被吸附在牙齿上并且不易被清除，并且能够选择性地吸附口腔中其他细菌，形成菌斑。

1940年人们首次发现口腔中链球菌和乳酸杆菌在体外培养时其碳水化合物的代谢能力可以被氟化物所抑制(Bibby and Van Kesteren,1940)。自此以后，人们便尝试利用氟化物来预防龋齿的产生，例如在牙膏中添加氟化钠。然而，随着氟化物的大量长期使用，变形链球菌已经开始产生了耐氟性(Hoelscher and Hudson,1996)，这使得龋病的预防形势变得更加严峻。因此，研发新的预防龋病的措施及制备更为有效抑制和杀伤变形链球菌(Streptococcus mutans)类药物成为迫切需求。

发明内容

针对现有技术的需求，本发明的目的是提供一种2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在制备抑制和杀伤变形链球菌(Streptococcus mutans)类药物中的应用。

本发明所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在制备抑制和杀伤变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株药物中的应用。

本发明所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在制备抑制变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株生物膜的形成药物中的应用。

本发明所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在制备口腔变形链球菌(Streptococcus mutans)生物膜抑制剂中的应用。

其中：所述变形链球菌(Streptococcus mutans)是变形链球菌UA159浮游细胞和/或变形链球菌UA246浮游细胞。

进一步的，本发明所述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在制备防治龋齿的靶向药物中的应用。或作为抑菌添加成分在制备牙膏、漱口水或消毒液中的应用。

人体口腔中存在着大量的微生物，他们利用代谢碳水化合物产生的酸类物质和口腔中的唾液寄居在人体牙齿的表面形成生物膜(biofilm)。同时，变形链球菌(Streptococcus mutans)在龋齿的形成过程中起着至关重要的作用。申请人用DMSO将化合物2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮溶解，配成终浓度为1024mg/L的母液贮存，并利用实验测定了该化合物对变形链球菌模式菌株和临床菌株的抑制效果。

结果显示，化合物2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮对浮游状态下的变形链球菌具有很好的抑菌活性和杀菌活性，其对变形链球菌UA159菌株的最小抑菌浓度为2.4mg/L，最小杀菌浓度为8.5mg/L，半数最大抑制浓度(IC50)为0.964mg/L。当培养基中化合物终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA159菌株生物膜的抑制率为99.66％。化合物对变形链球菌UA246菌株的最小抑菌浓度为4.5mg/L，最小杀菌浓度为32.8mg/L，半数最大抑制浓度(IC50)为0.687mg/L。当培养基中化合物终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA246菌株生物膜的抑制率为99.29％。

其中，上述实验中所使用的变形链球菌UA159菌株为模式菌株，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的参考基因组编号为NC_004350。本发明所使用的变形链球菌UA246菌株为临床菌株，分离自患有龋齿病人的口腔当中。其最适的培养基优选脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heartinfusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodiumchloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2)，最适的培养条件优选厌氧，37℃静置培养。

本发明公开的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮抑菌实验证实具有抑制性强、杀伤效果好等特点，能够显著抑制变形链球菌浮游细胞和生物膜的形成，可以作为预防龋齿的新型靶向候选药物，应用前景广阔。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮在杀伤、抑制变形链球菌浮游细胞及其生物膜形成过程中的应用。所述内容是对本发明保护内容的解释而不是限定。

实施例1：2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮的制备

4.36g(25mmol)4-叔丁基噻唑-2-胺，30ml二氯甲烷，搅拌溶解，加入3.45g(25mmol)无水碳酸钾，常温搅拌30min，滴加2ml(25mmol)氯乙酰氯，常温反应1.5h。反应液倒入冰水，二氯甲烷萃取，饱和碳酸钠水溶液洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，脱溶，乙醇重结晶得5.50g白色固体1，收率87.7％，m.p.113～115℃。

2.30g(9mmol)化合物1，1.31g(13.5mmol)硫氰酸钾，30ml乙醇溶解，加热回流反应2.5h；冷却，析出固体，抽滤，干燥得2.10g黄色固体2即为2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮，收率90.0％，m.p.200～202℃。

¹H>3，400MHz)δ:1.33(s，9H，3×CH₃)，3.88(s，2H，CH₂)，6.64(s，1H，噻唑环)，12.24(s，1H，NH)；¹³C>3，101MHz)δ:29.71，34.77，107.58，139.38，160.38，162.78，172.66.EI-MS>+。

上述制备过程反应是如下：

实施例2：变形链球菌的培养

(1)培养变形链球菌的培养基为脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(品牌OXOID，货号CM1135)，培养基主要成分为Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heartinfusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodiumchloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate2.5g/L，pH 7.4±0.2。如需配置成固体，需要添加琼脂粉15g/L。115℃灭菌30min，冷却后待用。

(2)培养变形链球菌生物膜的培养基为脑心浸液-蔗糖培养基，即在脑心浸液培养基中添加终浓度为1％的蔗糖。蔗糖需事先配成20％贮存液并用0.22μm的无菌滤器过滤除菌。

(3)用无菌接种环将变形链球菌模式菌株UA159和分离自龋齿病人口腔中的变形链球菌菌株UA246在含有脑心浸液琼脂固体培养基的平板上进行划线，倒置于37℃的厌氧培养箱中培养直至出现明显的单菌落。

(4)用无菌的接种铲刮取变形链球菌UA159和UA246菌株，分别转接到装有脑心浸液液体培养基的试管中，在37℃的厌氧培养箱中静置，培养至液体浑浊。

(5)用紫外可见分光光度计检测变形链球菌在600nm下的吸光度值(OD₆₀₀nm)，待用。

实施例3：2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮化合物对变形链球菌浮游细胞的活性检测

(1)按照实施例1中描述的方法制备2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮，用分析天平精确称量该化合物，并加入DMSO将其溶解，然后用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤除菌，配成终浓度为1024mg/L的贮存液，存放于-20℃待用；

按照实施例2中描述的方法准备变形链球菌UA159和UA246菌液，将其培养至对数期并使变形链球菌菌液OD₆₀₀nm＝0.8～1.0，用脑心浸液培养基稀释至终浓度为5×10⁵cfu/ml待用。

(2)采用微量肉汤稀释法检测2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮化合物对变形链球菌UA159和UA246浮游细胞的最小抑菌浓度。

具体是：将倍比稀释后不同浓度的2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮溶液分别加到无菌的96孔板中，第1至第11孔为加药液的实验组，第12孔为不加药作为生长对照组，每个孔中变形链球菌菌液终浓度为5×10⁵cfu/ml，此时，第1孔至第12孔药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0μg/ml。以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度定位最小抑菌浓度(MIC)。

(3)将小孔内的菌液均匀涂布到脑心浸液琼脂固体培养基上后，在37℃厌氧培养箱中倒置培养24小时，以没有细菌生产的最低浓度定位最小杀菌浓度(MBC)。

(4)用酶标仪检测每个小孔内在600nm下的吸光度值，计算每个药物浓度条件下细胞的抑制率，计算公式为抑制率＝(1-实验组/生长对照组)×100％，所得数据使用SPSS统计软件计算半数最大抑制浓度(IC₅₀)，实验结果如表1所示。

表1.2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮化合物对变形链球菌UA159和UA246浮游细胞的活性检测

MIC：最小抑菌浓度；MBC：最小杀菌浓度；IC₅₀：半数最大抑制浓度

从表1可以看出，2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮化合物对变形链球菌UA159和UA246浮游细胞具有很好的抑菌活性和杀伤活性。其中2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮对变形链球菌UA159浮游细胞的活性要明显好于变形链球菌UA246。

实施例4：2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮化合物对变形链球菌生物膜的抑制活性

(1)按照实施例1中描述的方法制备2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮，用分析天平精确称量该化合物，并加入DMSO将其溶解，然后用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤除菌，配成终浓度为1024mg/L的贮存液，存放于-20℃待用；

按照实施例2中描述的方法准备变形链球菌UA159和UA246菌液，将其培养至对数期并使变形链球菌菌液OD₆₀₀nm＝0.8～1.0，用脑心浸液-蔗糖培养基将处于对数期的变形链球菌稀释至终浓度为5×10⁵cfu/ml，待用。

(2)向无菌的96孔板中加入(1)中的菌液150μl，并以加入2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮化合物的孔(终浓度4mg/L)作为实验组，以不加化合物的孔作为对照组。放于37℃厌氧培养箱中静置培养40小时。

(3)将每个孔中的浮游细胞移走，并用大量的水冲洗未吸附的细胞。

(4)向每个孔中加入0.1％的结晶紫溶液200μl，在室温的条件下静置5min进行染色，然后移除结晶紫溶液，并用大量水冲洗掉除去未吸附的结晶紫。

(5)向每个孔中加入33％的乙酸溶液200μl溶解吸附的结晶紫，然后使用酶标仪检测590nm下的吸光度值，计算生物膜的抑制率，计算公式同实施例3。

结果显示，当培养基中化合物2-[(4-叔丁基噻唑-2-基)亚氨基]噻唑啉-4-酮终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA159菌株生物膜的抑制率为99.66％，对变形链球菌UA246菌株生物膜的抑制率为99.29％。